实验六 酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定实验报告
酶联免疫吸附测定实验报告酶联免疫吸附测定实验报告酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析生物样本中特定分子的存在。
本实验旨在通过ELISA技术，对特定抗原在样本中的含量进行测定，并了解其原理及应用。
一、实验原理ELISA技术是一种基于免疫反应的实验方法，其原理主要包括固相吸附、特异性结合、酶标记和显色反应。
首先，在微孔板中固定特异性抗体，形成固相吸附。
然后，加入待测样本，样本中的目标抗原与固相抗体结合。
接着，加入酶标记的二抗与目标抗原结合，形成特异性结合。
最后，通过添加显色底物，酶催化反应产生可见的颜色变化，从而定量分析目标抗原的含量。
二、实验步骤1. 准备样本和试剂：收集待测样本，如血清、尿液或细胞培养上清液，并准备好ELISA试剂盒中的各种试剂。
2. 板洗涤：将微孔板放入洗板机中，加入洗板缓冲液，进行洗涤步骤，以去除未结合的物质。
3. 固相吸附：将特异性抗体加入微孔板孔中，孵育一段时间，使其与固相吸附。
4. 样本孵育：将待测样本加入各孔中，与固相抗体结合，在恒温条件下孵育。
5. 二抗结合：加入酶标记的二抗，与目标抗原结合形成特异性结合。
6. 洗涤：再次进行洗板步骤，去除未结合的物质。
7. 底物反应：加入显色底物，酶催化反应产生可见的颜色变化。
8. 反应终止：加入终止液，停止酶催化反应。
9. 测定吸光度：使用酶标仪测定各孔的吸光度值。
10. 数据分析：根据吸光度值，绘制标准曲线，通过比较待测样本的吸光度值，计算出目标抗原的浓度。
三、实验结果通过ELISA实验，我们成功测定了待测样本中目标抗原的含量。
根据标准曲线，我们计算出了各样本中目标抗原的浓度。
这些结果将有助于我们了解样本中特定分子的水平，从而进一步研究其生物学功能和相关疾病的发生机制。
四、实验应用ELISA技术具有广泛的应用领域，包括生物医学研究、临床诊断、药物开发等。
酶联免疫吸附方法测定
酶联免疫吸附方法测定一、酶联免疫吸附方法测定的基本概念酶联免疫吸附测定（ELISA）呀，这可是个超级有趣又超级有用的检测方法呢。
它就像是一个超级侦探，能够在一堆复杂的东西里找到我们想要检测的特定物质。
比如说在医学上，要是想知道一个人有没有感染某种病毒，就可以用这个方法在血液样本里找找有没有病毒相关的抗原或者抗体。
在食品检测里也很厉害哦，如果想看看食物里有没有某种有害的细菌毒素，ELISA也能派上大用场。
二、ELISA的主要类型1. 间接ELISA这个类型呢，是先把抗原固定在板子上，然后加入含有抗体的样品。
这个抗体如果能和抗原结合，再加入一种酶标记的二抗，这个二抗是专门针对我们之前加入的抗体的哦。
最后加入底物，要是有反应，就说明样品里有我们要找的抗体啦。
就像一场接力赛，抗原先站好位置，抗体来接力，二抗再接力，最后底物来冲线。
2. 直接ELISA直接ELISA就简单一点啦。
直接把酶标记的抗体加入到固定了抗原的板子上，如果有反应，那就是有我们要检测的抗原啦。
就像是一对一的直接对决，简单明了。
3. 夹心ELISA这个就有点像三明治啦。
先把捕获抗体固定在板子上，然后加入含有抗原的样品，抗原就被捕获抗体抓住啦。
再加入检测抗体，这个检测抗体也是针对抗原的，不过它是另外一个识别位点哦。
最后加入底物，有反应就说明有抗原存在。
三、ELISA的操作步骤1. 包被就是把抗原或者抗体固定在酶标板的孔里。
这个过程就像是给每个小房间分配任务一样，要保证每个孔里都均匀地有我们要固定的东西。
一般是用合适的缓冲液把抗原或者抗体稀释到合适的浓度，然后加入到孔里，在一定的温度下孵育一段时间。
2. 封闭因为酶标板上可能还有一些没有被抗原或者抗体占据的地方，这些地方如果不处理，后面可能会有非特异性的结合。
所以我们要用封闭液把这些空的地方填满，就像把空房间都锁起来一样。
常用的封闭液有牛血清白蛋白（BSA）之类的。
3. 加样把我们要检测的样品加入到孔里，如果是检测抗体的，就加入血清之类的样品；如果是检测抗原的，就加入可能含有抗原的样品。
酶联免疫吸附实验报告
酶联免疫吸附实验报告导言酶联免疫吸附实验是一种用于检测抗原或抗体的常用方法，其原理是利用酶的特异性活性，使其与试验物发生特异性反应，并通过测定酶反应产生的信号来确定目标物的存在与否。
本实验报告将介绍使用酶联免疫吸附实验来检测抗原的方法和结果。
实验材料与方法材料：实验所需材料包括试剂盒、检测板、洗涤缓冲液、标准物质、底物试剂等。
方法：首先准备样本和标准溶液，按照试剂盒说明书的指导加入相应试剂，进行酶联免疫吸附实验。
实验过程中需要进行洗板步骤、底物反应、反应终止等操作。
实验结果与分析通过此次实验，我们成功检测到了目标抗原。
比如，我们可以观察到在某个特定波长下，底物反应产生了显著的吸光度值。
这是因为被检测的抗原与特异性抗体反应，在酶反应的作用下，产生了底物反应所需的物质，从而使底物反应溶液的颜色发生变化。
结论通过本次实验我们证实了酶联免疫吸附实验可以用于检测抗原。
这种方法具有灵敏度高、准确度高的特点，广泛用于医学、生物学以及生化领域的研究中。
酶联免疫吸附实验可以快速、简单地检测大量样本，并得到可靠的结果。
展望虽然酶联免疫吸附实验在目前的医学研究中被广泛使用，但仍有一些改进的空间。
例如，我们可以进一步优化实验条件，提高实验的灵敏度和准确度。
此外，我们也可以将酶联免疫吸附实验与其他技术手段相结合，进一步扩展其应用领域。
结语本实验报告介绍了酶联免疫吸附实验的方法、结果和意义。
这是一种常用的检测方法，可用于确定抗原的存在和浓度。
酶联免疫吸附实验不仅在医学研究中起着重要作用，也在生物学和生物化学研究中发挥着重要作用。
通过不断改进和创新，酶联免疫吸附实验有望在未来更广泛地应用于科学研究和临床实践中。
酶联免疫吸附试验操作步骤
酶联免疫吸附试验操作步骤
1. 溶解标记抗体。
以适量的磷酸缓冲液()稀释已标记的酶标记抗体,让其浓度为每盘20-30μ。
2. 溶解待检标样。
以液体或稀释液将待检的血清或其他体液样品进行适量稀释,一般为1:100-1:1000。
3. 加样。
分别将稀释后的标记抗体和稀释后的待检标样溶液加入相应位置的试验板孔中,孔内最好包含20-30μ的液体。
4. 导入保护液。
加入或体液作为阻断剂,防止非特异结合,每孔加入100μ。
5. 导入抗原。
加入不同浓度的抗原作为定量标准曲线,以及未加抗原的对照孔。
6. 导入待检血清或体液。
将稀释后的待检标样加入对应位置的试验板孔内。
7.孵育。
将试验板封口后,室温孵育30分钟-2小时。
8.清洗。
用液体洗盘,每孔加入300μ,强力清洗5-10次。
9.加显色底物。
加入显色底物,避光孵育10-30分钟。
10.终止反应。
加入终止液,如2/浓硫酸停止显色反应。
11.读取光密度值。
以未加样对照孔为零点,在450波长下读取各孔吸光值。
12.计算结果。
根据标准曲线计算样本或比对阳性比负性 - 值判断结果。
酶联免疫吸附试验实验报告
酶联免疫吸附试验实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测目标蛋白或抗原的存在与浓度，以及对特定抗体的识别和结合情况。
通过本实验，我们可以了解到酶联免疫吸附试验的原理和操作步骤，以及在生物医学研究和临床诊断中的应用。
二、实验原理。
酶联免疫吸附试验是一种利用酶和抗体的特异性结合来检测抗原或抗体的方法。
其原理是将待检测的抗原或抗体吸附在微孔板表面，然后加入特异性抗体，并通过酶标记的二抗或底物来检测特异性结合的信号。
当待测物与特异性抗体结合后，通过底物的酶反应产生可定量的颜色反应，从而测定待测物的浓度。
三、实验材料和方法。
1. 实验材料，微孔板、待测抗原或抗体、特异性抗体、酶标记的二抗、底物溶液等。
2. 实验步骤，将待测抗原或抗体加入微孔板孔中，加入特异性抗体，洗涤孔板，加入酶标记的二抗，再次洗涤孔板，加入底物溶液，停止反应，测定吸光度。
四、实验结果。
通过本次实验，我们成功检测出待测物的存在与浓度，并观察到特异性抗体与待测物的结合情况。
根据实验结果，我们可以得出待测物的浓度，并进一步分析其在生物学过程中的作用和意义。
五、实验结论。
酶联免疫吸附试验是一种高度敏感和特异性的实验方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域。
通过本次实验，我们深入了解了酶联免疫吸附试验的原理和操作步骤，掌握了实验技术和数据分析方法，为今后的科研工作和临床诊断提供了重要的参考和支持。
六、实验展望。
酶联免疫吸附试验作为一种重要的生物学实验方法，具有广阔的应用前景。
今后，我们将进一步深入研究酶联免疫吸附试验的原理和技术，开展更多的实验和应用，为生物医学研究和临床诊断提供更多的支持和帮助。
七、参考文献。
1. Smith, J. et al. (2010). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol, 588, 89-94.2. Green, N. M. (2015). Avidin and streptavidin. Methods Enzymol, 184, 51-67.以上就是本次酶联免疫吸附试验的实验报告，谢谢阅读。
酶免疫技术—酶联免疫吸附试验(免疫学检验课件)
（二）最适工作浓度的选择
在ELISA测定中应对包被抗原或抗体的浓度和酶标 抗原或抗体的浓度予以选择以达到最佳的测定条件以 间接法测抗体为例
1．酶标抗抗体工作浓度的选择
（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。 （2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已 包被的孔中，温育，洗涤。 （3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度（A）值 在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。
抗原
E
E
E 底物
捕获法
EE E
E
（+）
EE
（-）
3．注意事项
采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的 是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF （IgM类）能与固相抗人μ链抗体结合，并可与 随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导 致假阳性反应。
非特异IgM由于其在第一步温育中， 可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以 会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测 IgM，必须对临床样本进行适当稀释。
E
2．技术要点
（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加待检标本,温育，洗涤。 （3）加酶标抗体，洗涤。 （4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的
定性或定量。
双抗体夹心法测抗原
EE E EE E
（+）
EE E
（-）
3．注意事项
双抗体夹心法中，应注意类风湿因子(RF) 的干扰。如果待检标本中含有RF，可能产生假 阳性结果。使用抗体的F(ab’)2或Fab片段作为酶 标抗体可消除RF的干扰。
E E
E
（+）
E EE
E EE
（-）
（2）竞争法检测HBeAb：
酶联免疫吸附测定法ppt课件
实验器材和药品
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附 剂和容器。 最常用的是聚苯乙烯和聚氯乙 烯 。它们有较强的吸附蛋白质的性能，抗 体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的 免疫学活性。 微量滴定板，量滴定板为8×12的96孔 式。ELISA板的特点是可以同时进行大量标 本的检测，并可在特制的比色计上迅速读 出结果。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附 性增加。
酶联免疫吸附测 定法
免疫学实验
基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待
测物与酶连接，然后通过酶与底物产生 颜色反应，用于定量测定。测定的对象 可以是抗体也可以是抗原。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：
①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
实验原理 双抗体夹心法
酶反应终止液
HRP反应终止液为硫酸，一般采用2mol/L AP用NaOH终止
实验方法:
1. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于已包被之反应 孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴 性对照孔及阳性对照孔)。 2. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗 体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 3. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的底物溶 液0.1ml，37℃10～30分钟。 4. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 5. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果： 反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极 浅。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，以空白对照孔调 零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍， 即为阳性。
几种酶标分析仪
NM-9602 标配酶标分析仪
酶联免疫吸附试验实验报告
酶联免疫吸附试验实验报告一、实验目的酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的免疫学检测方法，本次实验旨在掌握 ELISA 的基本原理、操作步骤和结果分析，能够熟练运用该技术检测样品中的目标抗原或抗体。
二、实验原理ELISA 的基本原理是将抗原或抗体结合到固相载体表面，然后与待测样品中的相应抗体或抗原发生特异性免疫反应，通过酶标记的二抗与一抗结合，最后加入底物显色，根据显色的强度来定量或定性分析样品中的目标物质。
三、实验材料与设备1、材料抗原或抗体标准品待测样品酶标记的二抗包被缓冲液洗涤缓冲液封闭液底物溶液终止液2、设备酶标仪恒温培养箱移液器96 孔酶标板四、实验步骤1、包被将抗原或抗体用包被缓冲液稀释至适当浓度，加入96 孔酶标板中，每孔100 μL，4℃过夜或 37℃孵育 2 3 小时。
2、封闭弃去包被液，每孔加入200 μL 封闭液，37℃孵育 1 2 小时。
3、加样弃去封闭液，洗涤酶标板 3 5 次。
将待测样品和标准品用稀释液稀释至适当浓度，加入酶标板中，每孔100 μL，37℃孵育 1 2 小时。
4、加酶标二抗弃去样品液，洗涤酶标板 3 5 次。
每孔加入100 μL 酶标记的二抗，37℃孵育 1 2 小时。
5、显色弃去二抗液，洗涤酶标板 3 5 次。
每孔加入100 μL 底物溶液，37℃避光孵育 15 30 分钟，观察显色情况。
6、终止反应当显色达到适当程度时，每孔加入50 μL 终止液，终止反应。
7、测定吸光度使用酶标仪在适当波长下测定各孔的吸光度值。
五、实验结果1、标准曲线的绘制以标准品的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2、待测样品的结果分析根据待测样品的吸光度值，在标准曲线上查找对应的浓度值，计算待测样品中目标物质的含量。
六、实验讨论1、影响实验结果的因素包被条件：包被抗原或抗体的浓度、温度和时间等因素会影响包被效果，进而影响实验结果的准确性。
封闭效果：封闭不完全可能导致非特异性结合，增加背景信号，影响结果的准确性。
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实验六酶联免疫吸附测定法摘要：酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，具有操作简便、灵敏性高等优点，是生物化学等领域检验的常规测定方法。
本实验采用ELISA间接竞争法对牛奶中鼠抗氯霉素（CAP）进行了检测和分析。
关键词：酶联免疫吸附测定鼠抗氯霉素检测60 年代初期，Averameas 及Ram 等在不破坏酶的催化活性及免疫球蛋白的免疫活性或蛋白质结构的前提下，利用特殊的交联剂将辣根过氧化物酶（HRP）与人血清白蛋白（HSA）连接在一起，后来又用酸性磷酸酯酶（AP）与抗体（Ab）结合，这些结合物统称为酶标记物或酶结合物，被用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定，从此建立了免疫酶技术。
1971 年瑞典的Engvall 和荷兰的Van Weeman 等人使抗体与溴化氰激活的纤维素结合或使抗体吸附于聚苯乙烯试管上制成固相免疫吸附剂（固相载体），再与免疫酶技术结合，建立了酶联免疫吸附测定法，用于检测抗体或抗原。
1974 年Voller 等用聚苯乙烯微量反应板作为吸附载体吸附抗体（抗原），再与相应的酶标记物结合，使ELIS A 操作更方便，易重复，灵敏度可高达ng （10-9g）至pg（10-12g），并且所需仪器设备简单，因而成为生物化学，临床医学检验的常规测定方法之一，原则上ELISA 可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。
在实际应用方面可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断鉴定等。
因此，它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行病学及传染病学等方面密切相关。
ELISA 过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。
待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。
ELISA 常用的测定方法主要有直接法和间接法两种：直接法是酶标记抗体与待检测样本中固相抗原直接作用，加入底物后，显色(其颜色深浅与样本中抗原量成正比)；间接法是使已知抗原吸附在固相载体上，与待检测样本中的抗体作用，再加入酶标记抗同种动物抗体的免疫球蛋白(二抗)，使与特异抗原抗体复合物中的抗体作用，加入酶底物，显色(颜色深浅与样本中抗体量成正比)。
ELISA 有许多改良方法, 如夹心法( sandwich ELISA) 、双抗体夹心法( double-antibody sandwich technique) 、竞争法、酶- 抗酶法和均质法(homogeneousELISA) 、生物素- 亲和素放大系统(biotina-vidin system, BAS) ELISA 及斑点- ELISA ( dot-ELISA)等。
常用方法大致可分为三类：(a) 测定抗体的间接法；(b)测定抗原的双抗体夹心法；(c) 测定抗原的竞争法。
前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原，适用于临床诊断上，而竞争法是测定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食品分析。
竞争酶联免疫吸附分析法又可分为直接竞争法和间接竞争法。
直接竞争法主要有三步：抗体吸附于固相载体，温育后清洗→加入含有抗原的待测液及酶标记的抗原，温育后清洗→加入酶底物温育后显色，判断结果。
间接竞争法主要有四步：抗原吸附于固体载体，温育后清洗→加入含有抗原的待测液和抗体，温育后清洗→加入酶标记抗体，温育后清洗→加入酶底物温育后显色，判断结果。
影响ELISA 测定结果的因素主要包括以下几点：(1) 抗原：在ELISA 中，包被于固相载体表面的抗原或抗体的来源和制备方法对试验结果都有影响。
包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。
如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。
此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。
(2) 固相载体：可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。
许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。
但在ELISA 中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。
由于微量反应板所用试剂量少，操作方便，适合于大规模应用。
国产聚苯乙烯微量反应板目前已大量应用于ELISA 测定，并且获得了满意的结果。
但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的。
实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型及其表面性质有关。
(3) 非特异性反应干扰的排除：除了设置稀释液空白、阳性和阴性参比血清等对照外,可采用包埋、封闭等预处理，如在洗涤液和稀释中加入牛血清白蛋白、明胶或吐温- 20 等，以减少非特异性反应的发生。
高选择性的单克隆抗体代替多克隆抗体也是提高ELISA 特异性的另一有效途径。
(4) 酶和底物的选择：用于ELISA 标记的酶，主要有辣根过氧化氢酶(HRP) 、碱性磷酸酯酶(AP) 、葡萄糖氧化酶和半乳糖苷酶等，而以HRP 用得较多。
酶底物本身要求无色，反应后能稳定呈色。
一般HRP 常采用邻苯二胺(产物桔黄色,可稳定呈色数小时) 或邻联甲苯胺作酶底物；AP 常用对硝基苯磷酸盐作酶底物。
3.试剂与器3.1 试剂1、抗体：鼠抗氯霉素（CAP）单克隆抗体2、抗原：CAP-BSA3、酶标记抗体（二抗）：HRP-羊抗鼠4、样品：鸡蛋。
（取10g 鸡蛋加48ml 去离子水搅匀，平均分为2 组，一组加入氯霉素标准品，使其浓度为10 ng/g。
在搅拌下向两组样品中逐滴加入50%高氯酸1ml，4 度振荡提取15min，3000rpm 离心10min，上清液过0.45um 滤膜，后用NaOH 调节pH 为7。
）5、缓冲液：1）包被液:：0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液（Na2CO3 0.159 克，NaHCO3 0.294 克，蒸馏水稀释至100 ml）。
2）洗涤及稀释液：0.01mol/L pH7.4 PBST 溶液。
（NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O2.9g, Tween—20，0.5ml. 蒸馏水加至1000ml）。
3）底物溶液：A 液（TMB：20mg+DMSO 10ml+超纯水90ml），B 液（一水合柠檬酸：2.1g+ 十二水合磷酸氢二钠7.11g+ 0.75%过氧化氢尿素0.64ml，加超纯水至100ml），用时将A、B 液按1：1 比例混合。
4）终止液：2mol/LH2SO4。
3.2 器材聚苯乙烯微量反应板( 96 孔)，可调式微量吸液器（200uL），八道可调式移液器，培养皿，小烧杯，隔水式恒温箱，酶联免疫检测仪4.实验内容和步骤1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为0.5ug/ml，每孔加100 微升，4℃冰箱放置16～18 小时。
2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加200 微升洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
3. 封闭：用稀释液将BSA 稀释成浓度为100 ug/ml 溶液，每孔加150 微升，37℃放置1 小时。
4. 洗涤：倒尽板孔中液体，加200 微升洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
5. 加标准品：如下图所示，用稀释液将氯霉素标准品稀释成0.1 ng/mL 至50ng/mL 溶液，每孔50 微升。
同时作稀释液对照。
6. 加被测样：如下图所示，加入被测样，,每孔50 微升。
7. 加抗体：向各孔中加入50 微升抗体（用稀释液按1:16000；1:32000 稀释），37℃放置1 小时。
8. 洗涤同2。
9. 加二抗（用稀释液按1:10000 稀释）, 每孔100 微升, 放置37℃1 小时。
10. 洗涤同2。
11. 加底物：底物溶液加100 微升，室温暗处10--15 分钟。
12. 加终止液：每孔加50 微升H2SO4（2M）。
13. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录450nm 读数。
表1：酶标板上各孔的加样设计BLK 为空白对照。
5.数据处理1)酶联免疫检测仪记录数据如下表：1 2 3A 0.625 0.647 0.482B 0.690 0.610 0.463C 0.578 0.516 0.473D 0.451 0.362 0.281E 0.269 0.187 0.315F 0.157 0.105 0.347G 0.048 0.052 0.044H 0.051 0.052 0.0562) 标准曲线绘制：将测得的吸光度值OD450 按照公下面式换算成结合率B/B0(%)：B/B0(%)＝(OD-Blank)/(OD0- Blank)×100结果如下表：浓度（ng/ml）浓度对数值B/B0*100（%）2 0.301 96.956 0.778 87.7418 1.255 63.8954 1.732 37.33162 2.210 15.243) 其中OD 为给定样品的吸光度值；OD0 为标准蛋白为零时的吸光度值；Blank 为空白对照的吸光度值。
以抑制结合率B/B0(%)为纵坐标，浓度的对数值Log10（CAP）为横坐标作图，绘制标准曲线。
4)根据标准曲线及待测样品B/B0(%)值，计算样品中CAP 含量。
由于S1第一组数据严重偏离其它两组数据所以舍弃该组，所以结果如下表:OD B/B0*100 Log(CAP)CAP浓度（ng/ml）S1 0.369 42.55 1.65044.69S2 0.275 29.81 1.93485.90结果讨论：根据实验检测，样品S1，S2浓度分别为44.69ng/ml、85.90ng/ml。
由图可得本实验所得标准曲线定量最精确区间在1.5-2.0（用log（CAP）表示）之间。
样品测量值在该范围之内，所以本次实验所测样品浓度误差较小，结果准确。
ELISA拥有操作方便，易重复，灵敏度高，设备简单等诸多优点。
但是其特异性取决于抗原的制备，试剂半衰期长，应用范围仅限于小的实验室诊断。
这给ELISA的应用带来了很大的局限性。
6.注意事项1) 聚苯乙烯微量反应板应选择高质量、非特异性吸附小的产品。
包被物应具有较高的纯度，其浓度一般在1-100ug/mL 之间，在偏碱性条件下易吸附于反应板的凹孔中，4℃放置过夜较理想，若暂时不用，可加入终浓度为0.02%NaN3，4℃贮存，也可倾去包被液，干燥后置硅胶干燥器中，室温存放3 个月以上不影响测定效果。