毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式
毕赤酵母表达手册
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
酵母菌表面展示操作步骤之基因重组和构建
酵母菌表面展示操作步骤之基因重组和构建酵母菌表面展示是一种常用的蛋白质表达和展示技术，可以用于各种研究和应用领域。
其中，基因重组和构建是实施酵母菌表面展示的关键步骤之一。
本文将详细介绍酵母菌表面展示操作中的基因重组和构建步骤。
一、基因重组和构建的原理基因重组和构建是指将目标蛋白质的基因序列插入到酵母菌表面展示载体上，使其能够被酵母菌表面展示。
这一步骤包括以下几个关键的操作过程：1. 寻找合适的表达载体：根据目标蛋白质的特性和需要展示的表面酵素活性，选择合适的表达载体。
常用的载体包括pYD1、pCTCON2等。
2. 提取目标基因：从目标蛋白质的源菌中提取基因序列，通过PCR扩增获得目标基因片段。
3. 消化酵母菌表面展示载体：使用限制性内切酶对表达载体进行切割，以产生适当的限制性内切片段。
4. 连接目标基因和载体：将目标基因片段与切割后的载体通过DNA连接酶进行连接。
连接时需确保目标基因与载体之间的方向一致，以便正确表达。
5. 转化酵母菌：将连接好的重组载体转化到酵母菌中，可使用化学转化或电穿孔法。
二、基因重组和构建的操作步骤下面将具体介绍酵母菌表面展示操作中的基因重组和构建步骤：1. 寻找合适的表达载体根据实验需求选择合适的表达载体。
常用的表达载体包括pYD1、pCTCON2等。
根据需要选择合适的酵母菌，如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或表面展示酵母（Pichia pastoris）。
2. 提取目标基因从目标蛋白质的源菌中提取基因序列，可以通过细菌基因组DNA提取试剂盒等常用试剂盒进行提取。
提取后，使用PCR扩增获得目标基因片段。
3. 消化酵母菌表面展示载体将所选择的表达载体进行消化，使用适当的限制性内切酶切割载体。
消化后的载体含有适当的限制性内切片段，以便与目标基因连接。
4. 连接目标基因和载体将目标基因片段与切割后的载体进行连接，可采用DNA连接试剂盒等常用试剂盒进行连接。
毕赤酵母手册
毕赤酵母表达实验手册作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
［1］。
同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。
酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。
1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。
干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。
毕赤酵母实验操作手册
毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵间题［1］。
与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的量下降。
同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。
毕赤酵母表达操作手册(PDF精译版)
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
毕赤酵母高效表达策略-1
1.基因的内在特性主要包括mRNA 5’端非翻译区(5’2 U TR)、基因的A +T 组成和密码子的使用频率3 个方面。
由于巴斯德毕赤酵母中乙醇氧化酶的表达量极高(占胞内可溶蛋白的30% 以上) 因此为了有高的蛋白表达量,维持外源基因mRNA 5’－U TR。
尽可能和AOXlmRNA 5’－U TR 相似是必需的, 最好是保持两者一致。
A + T 含量高的基因在巴斯德毕赤酵母中表达时偶尔会造成转录提前终止,这是因为A T 丰富区可能存在转录提前终止信号。
因此对A T 含量丰富的基因最好是重新设计序列, 使其A + T 含量在30%～55% 范围内。
巴斯德毕赤酵母也有特殊的密码子偏好趋向。
（赵翔,霍克克,李育阳. 毕赤酵母的密码子用法分析[J ] . 生物工程学报,2000 ,16(3) :308 - 311.）外源蛋白自身的理化特点也影响其表达和分泌。
外源蛋白的加工修饰都会影响蛋白的表达量。
2．选择强启动子启动子在转录水平上调控基因的表达最常用的启动子是AOXI 启动子。
PGAG(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子) 是最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,在它的控制下β- LabZ 基因表达率比甲醇诱导下的PAOX驱动的产量更高,由于该组成型启动子不需要甲醇诱导,发酵工艺应该更简单,同时其产量更高,所以成为代替PAOX1 最有潜力的启动子。
通过分离选择恢复利用甲醇能力的自发突变体, 从AOX1 基因缺陷菌株中分离M ut+ 的自发突变体，从中筛选提高表达量的突变体。
（戴秀玉, 王恂, 周坚1 毕赤氏酵母PAOX2 突变化序列分析〔J 〕1微生物学报, 1999, 39 (6) : 559～5611）3．增加外源基因整合拷贝数（1）Invitrogen 公司最新发展的质粒pPIC9K上带有G418 的抗性基因,可以通过转化子对G418抗性水平快速筛选高拷贝转化子（配合电激法转化的效果更好）。
（2）在体外载体上多次插入目的基因片段。
毕赤酵母表达操作手册(精译版)
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。
AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。
表达：AOX1基因的表达在转录水平受调控。
毕赤酵母在基因克隆与表达中的应用2_占今舜
3.2 pH 值
毕 赤 酵 母 能 在 pH3.0 ～ 7.0 的 范 围内生长。在不同的表达体系中，不同 的蛋白酶需要最佳 pH 值存在不同，且 不同的重组蛋白对蛋白酶的耐受性有差 异，因此选择适当的发酵 pH 值不仅不 影响细胞的生长，还能降低蛋白酶活性 甚至灭活，减少目的蛋白的降解。Xue 等 [20] 研究发现，pH 值在 5.8 ～ 8.0 的 范围内，真菌免疫调节蛋白 LZ-8 蛋白 表达量随 pH 值上升而提高，且 pH 值 到 8.0 时， 蛋白表达量达到峰值。另外， Zhao 等 [21] 研究结果表明，即使对于同 一工程菌，它的菌种生长阶段和表达阶 段的最适 pH 值也不一样。
4 小结
自上个世纪的 60 年代，人们发现 可以利用甲醇为唯一碳源和能源生长的 酵母以来，它们不仅因能够生产单细胞 蛋白作为动物饲料的潜力而引起了广泛 关注，还可以通过其克隆表达外源蛋白 而被广泛利用。如今，毕赤酵母由于在 基因克隆和表达中具有明显的优点而被 广泛应用于医药领域和动植物生产。但 是其也存在一些不足，如发酵周期较 长 ；甲 醇 具 有 易 燃 易 爆 以 及 有 毒 性， 在生产中存在危险性 ；培养基和培养 条件不太成熟等。但是，随着人们对 其不断的研究和优化条件，减少其存在 的不足，提高其生产效率，将更加广泛 地应用于生产。
[3] D E M A I N A L , V A I S H N A V P ． Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms[J].Biotechnology Advance,2009,27(3):297-306． [4] P F E F F E R J , R I C H T E R S , NIEVELER J, et al．High yield expression of lipase A from Candida antarctica in the methylotrophic yeast Pichia pastoris and its purification and characterisation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2006,72(5) : 931-938． [5] ZHANG A L, ZHANG T Y, LUO J X, et al．Inducible expression of human angiostatin by AOXI promoter in P．pastoris using high-density cell culture[J].Molecular Biology Reports,2009,36(8):2265-2270． [6] JIN F L, XU X X, YU X Q, et al．Expression and characterization of antimicrobial peptide CecropinAD in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].Process Biochemistry, 2009,44: 11-16． [7] H A R T N E R F S , G L I E D E R A ． Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts[J]. Microbial Cell Factories,2006,5:39． [8] YU P．A new approach to the production of the recombinant SOD protein by methylotrophic Pichia pastoris[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2007,74(1):93-98． [9] G H A F F A R A , K H A N S A , MUKHTAR Z, et al．Heterologous expression of a gene for thermostable xylanase from Chaetomium thermophilum in Pichia pastoris GS115[J]. Molecular Biology Reports,2011,38（5）:3227-3233. [10] 吕中原，钱江潮， 储炬，等 . 同时利用 AOX1 和 GAP 启动子表达 SAM 合成酶 促进重组毕赤酵母中 S- 腺苷甲硫氨酸 积 累 [J]. 工 业 微 生 物，2008，38（4） ： 24-30. [11] LIN-CEREGHINO J, HASHIMOTO M D, MOY A, et al. Direct selection of Pichia pastoris expression strains using new G418 resistan cevectors[J]. Yeast, 2008, 25 (4) : 293- 299. [12] YANG L,AN X,WEI F,et al． E x p r e s s i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f recombinant human interleukin-18 protein using a yeast expression system[J].Protein Expression and
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毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式通过转化DNA与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组，毕赤酵母与酿酒酵母一样可产生
稳定的阳性转化子。
这些重组的菌株在无选择压力条件下，即使其携带的基因是多拷贝的，
也表现出极度稳定性。
常用的表达载体都含有HIS4基因，编码组氨酸脱氢酶基因，这些载
体经限制性内切线性化以后，可在AOX1或his4位点进行同源重组，从而产生HIS+重组子。
单交换插入比双交换（替换）要更容易发生，多拷贝事件自发发生的几率只有单交换几率的
1-10%。
1. 基因插入AOX1或aox1::AGR4位点
GS115 的AOX1或KM71 的aox1::AGR4 位点可以与载体上AOX1位点（AOX1 启动
子，AOX1 转录终止子TT或下游3’AOX1三个位点发生同源重组，这样就在AOX1 或
aox1::AGR4 基因的上游或下游插入一个或多个基因拷贝。
因为插入的表达盒没有破坏
原有基因组中的AOX1，所以转化子在GS115 中为HIS+ Mut+表型，在KM71 中为HIS+
Muts表型。
2. 基因替换AOX1位点
在his4 菌株如GS115 中，载体及基因组中AOX1启动子及3’AOX1 区的双交
换事件(取
代)，结果AOX1 编码区全部被取代，产生HIS＋Muts 表型。
以AOX1 位点由基
因替
代而产生的Muts表型作为指示，可很容易地筛选出HIS＋转化子的Mut 表
型。
基因取
代的结果是缺失了AOX1 位点（Muts），增加了含有pAOX1、目的基因、HIS4
的表达
盒。
基因取代（双交换事件）不如基因插入（单交换事件）发生得多。
3. 基
因插入His4位点
GS115（Mut+）或KM71（Muts）中，载体上HIS4 基因与染色体上his4 位点之
间发生
单交换事件，结果在his4位点插入一个或多个基因拷贝。
由于基因组上AOX1
或
aox1::AGR4 位点未发生重组，这些His＋转化子的表型均与亲本菌株相同。
4. 多拷贝插入
尽管多拷贝事件自发发生的概率很低，但是通过在培养基中加入选择性标记，
还是很容
易在转化子中筛选到插入多拷贝的表达核的转化子。