第十二章 荧光分析法
1 *
A
+ 3O2
( A+ .O2- )*
3 *
A
+ 3O2
氧的熄灭作用
24
5. 散射光
散射 光子与物质相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向 不同的方向散射。
瑞利散射 光子和物质分子发生弹性碰撞，只有光子运动方向发 生改变的散射光，其波长与入射光波长相同。
19
2. 溶剂
一般地，随极性溶剂的增加，荧光波长长移，
荧光强度增强。
奎宁在苯、乙醇和水中的荧光效率的相对大小
为1、30、1000。
溶剂粘度减小，分子碰撞机会增加，荧光减弱。
20
3. 酸度
每一种荧光物质都有其最适宜的pH范围
SO 3-H OH
+
SO 3-
pH=6.4~7.4
O-
无荧光
蓝色荧光
3. 荧光光谱与激发光谱的镜像关系 基态与激发态的振动能级间隔类似 激发光谱：基态激发态各振动能级 荧光光谱：激发态基态各振动能级
11
二、荧光与分子结构
（一）荧光寿命和荧光效率
荧光寿命 除去激发光源后，分子 的荧光强度降低到最大 荧光强度的1/e所需的时 间，用f 表示。
Ft F0 e Kt F 荧光强度 K 衰减常数 F f F0 / e F0 e 1/ ee
2. 仪器的校正
（1）灵敏度的校正
一定浓度的稳定荧光物质作对照品溶液调仪器
（如1ug/ml硫酸奎宁） （2）波长校正 汞灯的标准谱线 （3）激发光谱和荧光光谱的校正
光源强度、检测器的感应度
35
3. 荧光分析法的应用
（1）无机化合物的分析
采用有机试剂进行荧光分析的元素已近70多种 能够与金属离子形成荧光络合物的有机试剂绝大多数 是芳香族化合物。（分子刚性平面结构增大） 另一类络合物是三元离子缔合物。
15
2. 分子的刚性
分子的刚性越强，荧光效率越大
联苯 ＝0.2
N N OH OH
芴 ＝1.0
N O N O
Al+
无荧光
有荧光
16
3. 取代基
给电子取代基常使荧光强度增大 如：-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-NR2、-CN等 吸电子取代基常使荧光强度降低 如：-COOH、-NO、-NO2、 -SH、 RCO-等 卤素取代基随卤原子序数的增加而荧光下降 1-溴代萘 ＝0.002 1-碘代萘 ＝0.000 可能是由 “重原子效应”所致。在重原子中，能级之间的 交叉现象比较严重，容易发生自旋轨道的相互作用，增加 了体系间跨越的速度。
37
二、荧光分析新技术简介
1. 激光荧光分析 激光作光源；超低浓度分析
2. 时间分辩荧光分析
利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和检 测之间延缓的时间不同来实现分别检测。 3. 同步荧光分析 4. 胶束增敏荧光分析
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（1）关于荧光光谱和激发光谱，叙述错误的是（ ） A. 荧光光谱的形状与激发光的波长无关 B. 荧光光谱和激发光谱一般是对称镜像关系 C. 荧光光谱是分子的吸收光谱 D. 荧光激发光谱和紫外吸收光谱的形状相似 （2）溶液温度降低通常会使荧光效率 。 （3）在高浓度时荧光物质的浓度增加，荧光强度 。 （4）下列化合物中，哪种物质的荧光效率最大（ ） A. 苯 B. 联苯 C. 萘 D. 芴 E.蒽 （5）下列说法中正确的是（ ） A. 长共轭结构使得分子的荧光波长向短波方向移动。 B. 分子的刚性越强，荧光强度越小。 C. 给电子取代基可导致荧光增强。 D. 吸电子取代基可导致荧光增强。
低浓度时呈现良好的线形关系
29
为什么荧光分析法比紫外可见法更灵敏？
对于荧光法 F = 2.3k I0ECl FI0， I0 增强，F增大；低浓度时，FC 只要检测器灵敏，可检测微弱信号。
对于分光光度法 A = -lgT = ECl C极小时，A0，无吸收； 若C不变，改变入射光I0强度，A无变化。 所以吸收光谱受一定限制，灵敏度小于荧光光谱。
+ H+ NH 2 pH=4.8~3.4 NH3+
21
蓝色荧光
无荧光
苯胺在（ C ）条件下荧光强度最强 A. pH=1 B. pH=3 C. pH=10 D. pH=13
下列中能使苯胺引起荧光熄灭的是（ BD ） A. 乙醇 B. 盐酸 C. 水 D. 硫酸
22
4. 荧光熄灭剂
荧光熄灭（荧光猝灭） 荧光强度降低的现象
在350nm，拉曼光波长为400nm。荧光波长为
448nm。则测定时选择波长应为（ D ） A. lex320nm lem 400nm C. lex350nm lem 448nm B. lex320nm lem 360nm D. lex320nm lem 448nm
28
第二节 荧光定量分析方法
一、荧光强度与物质浓度的关系
13
（二）有机化合物分子结构与荧光的关系
物质发射荧光的两个条件： 强的紫外吸收、 一定的荧光效率 一般地，大多数荧光物质受到激发后，首先经历 *或n*跃迁，经过振动驰豫或其它无辐射跃 迁，再发生*或*n跃迁，产生荧光。 由于*比n*跃迁的强度更大，寿命更短， 因此*常能产生较强的荧光。 虽然n*跃迁产生的荧光较*弱，但在发生 n*跃迁时，紧接着产生体系间跨越，最后从*三 重态回到基态，产生更强的磷光。
F K ( I 0 I ) I I 0 10 ECL F K I 0 ( 1 10 ECL ) K I 0 ( 1 e 2.303 ECL ) ( 2.303 ECl ) ( 2.303 ECl )2 ( 2.303 ECl )3 F K I 0 1 ( 1 1! 2! 3! ( 2.303 ECl )2 ( 2.303 ECl )3 I 0 2.303 ECl K 2! 3! 当ECl 0.05 F 2.3 K I 0 ECl KC
内部能量转换 当两电子激发态能量相差较小以致其振动能级有重 叠时，受激分子由高电子能级转移致低电子能级的 过程。 （振动失活在同样多重态间进行，如S2* S1*）
5
术
语
外部能量转换
激发态分子与溶剂或其它溶质碰撞，以热能的形
式释放能量的过程。
体系间跨越 处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的 多重性发生变化的过程，如S1* T1*
6
荧光发射 第一激发单重态的最低振动能级 hv 基态（任一 振动能级） 发射荧光的过程约为10-9~10-7s 磷光发射
激发三重态的最低振动能级 hv 基态（任一振动 能级）
发射磷光的过程约为10-4~10s或更长
磷光法不如荧光法普遍
7
分子发光
荧光、磷光和化学发光统称为分子发光
17
1-氯代萘 ＝0.05
（三）荧光试剂
作用：产生强荧光性产物
1. 荧光胺
2. 邻苯二甲醛
3. 1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘 4. 测定无机离子的荧光试剂
18
三、 影响荧光强度的外部因素
1. 温度
温度升高通常会使荧光效率和荧光强度降低 乙醇 -80C =1.00 温度每增加10C ，荧光效率减小约3%
电子能级的多重性 M=2s+1
M=1 M=1 M=3
M=1 单重态
M=3 三重态
3
2. 荧光的产生
内转换 S2 振动弛豫 内转换 系间跨越
S1
能 量 吸 收 T1 T2
发 射 荧 光
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l1
l2
l 2
l3
术
语
振动驰豫
激发态各振动能级的分子通过碰撞释放能量，返回
同一电子激发态的最低振动能级的过程。
30
二、定量分析方法
1. 校正曲线法 F—C 2. 比例法
Fs F0 C s Fx F0 C x Fx F0 Cx Cs Fs F0
（空白不能调零时，要扣 除空Fra bibliotek）3. 联立方程式法
31
第三节 荧光分光光度计和分析新技术
滤光片荧光计 滤光片－单色器荧光计 荧光分光光度计
拉曼散射 光子和物质分子发生非弹性碰撞，光子运动方向发生 改变的同时，光子与物质发生能量交换，发射出比入 射光更长或更短的散射光。
25
如何区别荧光、磷光、瑞利光和拉曼光？ 波长320nm的入射光激发硫酸奎宁的稀硫 酸溶液时，将产生320nm的（ C ） A. 荧光 B. 磷光 C. 瑞利光 D. 拉曼光
荧光熄灭剂
卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合 物、重氮化合物、羰基化合物等等
荧光熄灭原因 分子碰撞失去能量、生成不发光的物质、氧 的熄灭作用、自熄灭和自吸收
23
M* Q M Q M * Q M Q*
碰撞熄灭 能量转移
由于氧分子的顺磁性质，溶液中溶解氧的存在，
使激发单重态分子向三重态的体系间跨越速率增
32
一、荧光分光光度计
1. 主要部件
源发光源（氙灯）、激发单色器、样品池、发射单色器、检测系统
荧光分光光度计结构示意图 1.光源 2、4、7、9. 狭缝 3.激发单色器 5.样品池 6.表面吸光物质 8.发射单色器 10.检测器 11.放大器 12.指示器 13.记录器
荧光分光光度计常使用的光源是（ B ）
14
荧光法_精品文档
荧光法荧光分析法1荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。
2荧光分析法是根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。
荧光分析法的优点：灵敏度高，选择性好，比紫外可见分光光度法低3个数量级以上。
3振动弛豫：处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。
（非辐射跃迁）4内部能量转换：简称内转换，是当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。
5荧光发射：无论分子最初处于哪一个激发单重态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。
（辐射）6外部能量转换：简称外转换，是溶液中的激发态分子与溶剂分子或与其他溶质分子之间互相碰撞而失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。
（非辐射)7体系间跨越：是处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。
（非辐射）8磷光发射：经过体系间跨越的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出光辐射，这种光辐射称为磷光。
磷光的坡长比荧光更长。
9溶液荧光光谱的特征：①斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发光波长。
激发态分子通过内转换和振动弛豫过程而迅速到达第一激发单重态S1的最低振动能级。
②荧光光谱的形状与激发波长无关，荧光发射光谱只有一个发射带。
③荧光光谱与激发光谱的镜像关系。
10影响荧光强度的外部因素：⑴温度（温度升高溶液中荧光物质的荧光效率和荧光强度将降低）；⑵溶剂（荧光波长随着溶剂极性的增强而长移，荧光强度也增强）；⑶酸度（每一种荧光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是它最适宜的PH范围）；⑷荧光熄灭剂（是指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象；荧光熄灭的原因：①因荧光物质分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量；②荧光物质的分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配位化合物；③溶解氧的存在，使荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁性，促进了体系间跨越，使激发单重态的荧光分子转变至三重态；④浓度较大时，还发生自熄灭现象）⒂散射光。
荧光分析法
荧光分析法一、基本原理某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluorescence analysis）。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快（约10-8s）因碰撞而以热的形式损失部分能量，由所处的激发态能级下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（excitation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
荧光物质的线性范围一般在0.00005-100微克/ml,当荧光物质溶液的吸光度小于或等于0.05时荧光强度和浓度才成线性关系。
荧光分析法
S2S 1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l ll3外转换l'2T2内转换振动弛豫第一节荧光分析法的基本原理（2）(二) 有机化合物分子结构(molecular structure)与荧光(fluorescence)的关系1. 分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构：强的紫外-可见吸收；（2）具有一定的荧光效率。
2. 有机化合物的结构与荧光(1）跃迁类型：π→ π*跃迁的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；(2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移(3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。
如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。
(4）取代基效应：芳环上有供电基团，使荧光增强。
综上所述：具有π→π*跃迁，长的共轭结构，刚性平面以及具有供电子基团的一类化合物，有利于荧光的产生。
(三) 荧光试剂：为了提高测定的灵敏度和选择性，常使弱荧光物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物，扩大荧光分析法的应用范围。
常用的荧光试剂有：1 荧光胺(fluorescamine)：能与脂肪族和芳香族伯胺形成高度荧光衍生物；2 邻苯二甲醛(OPA)：3 1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯）：4 测定无机离子的荧光试剂：三影响荧光强度的外部因素：1.溶剂的影响：一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移，荧光强度也增强。
2.温度的影响：荧光强度对温度变化很敏感，温度增加，外转换去活的几率增加，使荧光效率和荧光强度降低。
3. 溶液pH：对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；4. 荧光熄灭剂：又称荧光猝灭，是指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。
引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂(quenching medium)。
如果荧光熄灭强度与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系，可以利用这一性质测定荧光熄灭剂的含量。
荧光分析法ppt
荧光分析法的化学基础
荧光物质的化学结构
荧光物质的化学结构决定了其荧光性质，如荧光量子产率、荧光 波长等。
荧光物质的激发态性质
荧光物质的激发态性质对其荧光性质也有重要影响，如激发态的 稳定性、激发态的能量转移等。
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详细描述
荧光分析法可用于检测生物样品中的肿瘤标志物、药物浓度、DNA等物质。通过荧光探针、荧光免疫 分析等方法，可实现对肿瘤标志物、药物浓度的快速检测，为肿瘤诊断、药物治疗监测等提供依据。 此外，荧光分析法还可用于DNA检测，为遗传病诊断、亲子鉴定等提供技术支持。
荧光分析法在食品安全中的应用
总结词
荧光分析法的缺点
易受干扰
荧光分析法可能会受到其他物质的干扰，影响检测结果的准确 性。
不稳定性
荧光物质的荧光光谱可能会随着环境条件的变化而发生变化， 导致分析结果不稳定。
成本高
荧光分析法所需的仪器设备相对昂贵，而且需要专业人员操作 和维护。
荧光分析法的改进与发展趋势
优化荧光探针
通过改进荧光探针的设计和合成方法，提高荧光分析法的灵敏度 和特异性。
02
荧光分析法的原理
荧光分析法的物理基础
01
分子能级
荧光分析法涉及分子的能级跃迁，即分子从基态跃迁到激发态，再从
激发态返回到基态的过程。
02 03
激发态与基态的能量差
荧光分析法利用了激发态与基态之间存在的能量差，当分子吸收特定 波长的光能后，会从基态跃迁到激发态，之后释放出特定波长的荧光 。
荧光的产生
荧光物质的基态性质
荧光物质的基态性质同样影响其荧光性质，如基态的稳定性、基 态与激发态之间的跃迁能量等。
荧光分析法课件
荧光光谱（fluorecence spectrum）：固定激发 光波长为最大激发波长，而让荧光物质发射的 荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同波长 下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧光强 度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。
荧光分析法
荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从第 一激发单重态的最低振动能级返回基态时发射 出的光。 荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强 度进行物质鉴定和含量测定的方法。 优点：灵敏度高；选择性好；试样量少；方法 简单。
缺点：应用范围小。
第一节 荧光分析法的基本原理
一、分子荧光 （一）分子荧光的产生 1.分子的电子能级与激发过程
磷光发射：激发分子由第一激发三重态的最低振动 能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称 为磷光；磷光辐射能要比荧光辐射能量低，磷光波 长大于荧光波长；磷光发射时间为10-4-10s。
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
量
发
吸
射
收
荧
光
S0
l1
l2
l 2
外转换
l3
T1 T2
发 射 磷 振动弛豫 光
水 乙醇 环己烷 CCl4 CHCl3
激发光(nm)
248 313 365 405 436
271 350 416 469 511 267 344 409 459 500 267 344 408 458 499 — 320 375 418 450 — 346 410 461 502
第二节 荧光定量分析方法
荧光分析法练习题
第十二章荧光分析法(药学)A型题1.若需测定生物试样中的微量氨基酸应选用下述哪种分析方法()。
A、荧光光度法B、磷光光度法C、化学发光法D、X荧光光谱法E、原子荧光光谱法答案:A2.分子荧光分析比紫外-可见分光光度法选择性高的原因是()。
A、分子荧光光谱为线状光谱,而分子吸收光谱为带状光谱B、能发射荧光的物质比较少C、荧光波长比相应的吸收波长稍长D、荧光光度计有两个单色器,可以更好地消除组分间的相互干扰E、分子荧光分析线性范围更宽答案:B3荧光量子效率是指()。
A、荧光强度与吸收光强度之比B、发射荧光的量子数与吸收激发光的量子数之比C、发射荧光的分子数与物质的总分子数之比D、激发态的分子数与基态的分子数之比E、物质的总分子数与吸收激发光的分子数之比答案:B4.激发光波长和强度固定后,荧光强度与荧光波长的关系曲线称为()。
A、吸收光谱B、激发光谱C、荧光光谱D、工作曲线E、标准工作曲线答案:C5.荧光波长固定后,荧光强度与激发光波长的关系曲线称为()。
A、吸收光谱B、激发光谱C、荧光光谱D、工作曲线E、标准工作曲线答案:B6.一种物质能否发出荧光主要取决于()。
A、分子结构B、激发光的波长C、温度D、溶剂的极性E、激发光的强度答案:A7.下列结构中荧光效率最高的物质是()。
A、苯酚B、苯C、硝基苯D、苯甲酸E、碘苯答案:A8.下列因素会导致荧光效率下降的有()。
A、激发光强度下降B、溶剂极性变小C、温度下降D、溶剂中含有卤素离子E、激发光强度增大答案:D9.为使荧光强度和荧光物质溶液的浓度成正比,必须使()。
A、激发光足够强B、吸光系数足够大C、试液浓度足够稀D、仪器灵敏度足够高E、仪器选择性足够好答案:C10.在测定物质的荧光强度时,荧光标准溶液的作用是()。
A、用做调整仪器的零点B、用做参比溶液C、用做定量标准D、用做荧光测定的标度E、以上都不是答案:D11.荧光分光光度计与分光光度计的主要区别在于()。
荧光分析法 PPT
种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不
是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念， 他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。
1867 年， Goppelsroder 进行了历史上首次的荧光分析工作，
应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由 Jette和West提出了第一台荧光计。
光外还会发射出比原来吸收波长更长的光，当激发光停 止照射后，这种光线随之消失。这种现象称为光致发光。 最常见的是荧光和磷光。
荧光：物质分子接受光子能量激发后，从激发态的最低
振动能级返回基态时发射出的光。
荧光分析法：基于对化合物的荧光光谱测量建立起来的
分析方法。
分类：分子荧光和原子荧光。
根据激发光的波长范围可分为紫外-可见荧光；红外 荧光和X射线荧光。
荧光分析法 (Fluorometry)
1
第一次记录荧光现象的是 16世纪西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes ， 1575 年 他 提 到 在 含 有 一 种 称 为 “ Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝 色。 直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光 度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这
2
,l 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最
低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如l ‘2 )。
12
外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生
相互作用而转移能量的非辐射跃迁；
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
体系间跨越：处在激发态的电子发生自旋反转
第12章荧光分析法
2、溶剂：
1）溶剂极性：极性↑→荧光波长↑，荧光强度↑ 原因：极性溶剂中，π→π*跃迁能量差ΔE小，使紫外 吸收波长和荧光波长均长移；跃迁几率增加，使荧光强度增 强。 2）溶剂粘度：粘度↓→荧光强度↓ 原因：溶剂粘度低，分子间碰撞机会增加，使无辐射跃 迁增加，使荧光减弱。 温度↑→溶剂粘度↓→荧光强度↓
（三）荧光试剂
弱/无荧光物质+荧光试剂→强荧光产物
1、荧光胺（fluorescamine）： 特点：与脂肪族和芳香族伯胺形成高度荧光衍生物。 荧光胺及其水解产物均不显荧光。 荧光条件：λex=275/390nm，λem=480nm。
2、邻苯二甲醛（OPA）： 特点：在2-巯基乙醇存在下，pH9-10的缓冲溶液中 能与伯胺类、特别是半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸 外的α-氨基酸生成灵敏的荧光产物。 荧光条件：λex=340nm，λem=455nm。 例：测定磺胺类药物
内转换 S2
内转换 振动弛豫 系间跨越
S1
能 量 吸 收 T1 T2
发 射 荧 光
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l1
l2
l 2
l3
（二）荧光的激发光谱和发射光谱
激发光谱（excitation spectrum）：不同激发波长 的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。 绘制：固定发射波长，荧光强度（F）对激发波 长（λex）的关系曲线，其形状与吸收光谱相似。 荧光光谱（fluorescence spectrum）：在所发射的 荧光中各种波长组分的相对强度。 绘制：固定激发光波长和强度，荧光强度（F） 对发射波长（λem）的关系曲线。 荧光分析法通常采用λexmax与λemmax。
《荧光分析法》PPT课件
3〕外部能量转换 激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子碰撞以热
的形式释放能量。发生在第一激发态或发三重态 最低振动能级向基态转换的过程。 4〕体系间跨越
不同多重态,有重叠的振动能级，分子由激发单重态 跨越到激发三重态的过程，电子自旋反转。
5〕荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态 (S1 → S0)发射荧光的过程约为： 10-7～10 -9 s 。由于振动 弛豫和内转换损失局部能量，发射荧光的能量比分子吸收的能 量小，波长要长； 6〕磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态 〔 T1 → S0跃迁〕；磷光能量更低，波长更长。 发光速度很慢： 10-4～10 s ，光照停顿后，可持续一段时间
2.荧光的产生
吸收紫外可见光，基态电子跃迁到单重激发态 的各个不同能级上。激发态不稳定，释放能量 返回基态。发射荧光是其中一条途径。
hγ（荧光）
几率小（禁阻）
10-8s
hγ（磷光）
10-4~10s 能量： S2 ＞T2 ＞ S1 ＞ T1 ＞ S0
1〕振动弛豫 激发态分子通过与溶剂分子碰撞而将局部能量传
受激分子S1 系间窜跃 T1 振动弛豫 T1的最低振动能级
磷光 单重基态(s0)
〔二〕荧光的激发光谱和发射光谱 1.激发光谱：
表示不同激发波长的辐射引起物质发 射某一波长荧光的相对效率。 荧光强度〔F〕与激发波长〔λex〕 的关系曲线。 2.发射光谱〔荧光光谱〕： 保持激发光的波长和强度， 测定发射的荧光在各个波长下的相对强度， 记录荧光强度〔F〕对发射波长〔λem〕 的关系曲线。
2.分子构造与荧光的关系 1〕跃迁类型： π → π* 的荧光效率高,有较强紫外 吸收，有利于荧光的产生； 2〕共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率
《荧光分析法》课件
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微型化与便携化
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结合人工智能和自动化技术，实现荧光分 析的智能化和自动化，减少人为误差和操 作复杂度。
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荧光分析法的应用领域
环境监测
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重金属、有机物和农药等。
生物医学研究
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荧光分析法的缺点
01
02
03
04
样品处理复杂
荧光分析法通常需要对待测样 品进行预处理，如提取、纯化
荧光寿命的测量
通过测量荧光物质在激发光停止后荧光强度随时间的变化，可以了解荧光物质从 激发态回到基态的速率常数和荧光寿命。
时间分辨荧光光谱的测量
通过测量不同时间点的荧光光谱，可以了解荧光物质在激发态的动态过程和能量 转移过程。
荧光量子产率的实验技术
荧光量子产率的测量
通过测量荧光物质在特定波长激发下的荧光发射光子数和激发光子数，可以计算出荧光量子产率，了 解荧光物质的光致发光效率。