单克隆抗体

《细胞工程》自主学习报告论文题目：单克隆抗体的研究进展姓名：__唐冬临__班级：生物技术132_学号：_2013013884_电话：__666520__摘要: 抗体分子是生物及医学领域中使用最广泛的蛋白质分子之一。

从19世纪末生物学家们就已经开始了抗体的研究，到现在抗体的发展经历了从多克隆抗体到单克隆抗体，直到基因工程抗体，再到人源抗体的过程。

单克隆抗体作为其中重要的一环，自其问世以来，由于其特异性强、重复性好、操作简便易行、在疾病诊断、预防和治疗中，发挥着极其重要的作用，并显示出广阔的应用前景。

本文主要是对单克隆抗体的研究和引用发展情况作简单综述。

关键字：单克隆抗体，研究进展，单抗技术的应用，展望正文：1、单克隆抗体的概述1.1单克隆抗体的概念抗体主要由B淋巴细胞合成。

每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。

动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。

当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。

被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B 细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。

如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。

单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

1.2单克隆抗体的发明1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠B细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。

将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。

（见图解）传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。

此外，要把这些不同的抗体分开也极困难。

如果利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。

这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。

但最初的鼠源抗体由于人鼠之间遗传背景的差异，这极大的限制了单克隆抗体在疾病治疗上的应用和发展。

不过近年来，随着生物技术的发展，鼠源性蛋白质的成分从100%，下降为33%乃至0%。

近年来发展起来的人源化单抗和完全人源化抗体含极少甚至不含鼠源成分，这种技术不仅仅避免了人抗鼠抗体反应，而且特异性、亲和力不受影响，在疾病的治疗中将发挥巨大作用，拥有极其广阔的应用前景。

1.3单克隆抗体的制备1.3.1免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。

一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。

抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

1.3.2细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。

将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。

在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

1.3.3选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。

在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。

未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。

只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

1.3.4杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。

通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。

采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。

经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

1.3.5单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。

(1)体内诱生法取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。

1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。

杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。

约1-2周，可见小鼠腹部膨大。

用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。

(2)体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。

在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。

但这种方法产生的抗体量有限。

各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。

2、基因工程单克隆抗体的发展2.1嵌合抗体嵌合抗体是应用重组 DNA 技术从小鼠杂交瘤细胞基因组中分离和鉴别出抗体基因的功能性可变区, 与人免疫球蛋白( Ig ) 恒定区基因拼接后, 构建成人---鼠嵌合的重链, 轻链基因, 再导入骨髓瘤细胞中表达.根据所用的载体质粒标记基因产物, 选用适当的抗生素或试剂进行筛选, 再按杂交瘤技术相似的方法克隆出分泌人--- 鼠嵌合抗体的细胞株。

2.2重构抗体重构抗体是嵌合抗体的基础上发展起来的，由于人---鼠嵌合抗体的可变区仍保留着小鼠抗体的结构, 因而不能完全克服其在人体内的免疫原性, 从而限制了嵌合抗体的重复给药，重构抗体的设想是用互补性决定区( C D R )移植的方法将鼠源单抗重新构建为人源单抗。

2.3小分子抗体利用细菌表达决定抗体特异性的结构域, 所得到的抗体大小只为完整Ig G 分子的1/3一1/2, 因此称为小分子抗体。

根据小分子抗体结构的特点, 分为下列3类。

2.3.1 Fab将重链的V 区和C H I 的CDNA 与完整的轻链CDNA 连接在一起, 在细菌的启动子控制下大肠杆菌中表达为Fab, 其大小为完整Ig G 的1/3。

2.3.2 单链抗体是指在重链v 区CDNA 3 端与轻链v 区cDNA S`端之间用一寡聚核昔酸连接, 在大肠杆菌中表达成一单链多肤, 并在细菌体内折叠成只由重链和轻链可变区构成的一种新型的抗体。

单链抗体的大小为完整Ig G 的1/6。

2.3.3 单域抗体自然产生的抗体和上述用遗传工程方法产生的抗体, 其抗原结合部是由重链和轻链的C D R 联合构成的。

但Ward 氏等1989 年发现单独的v H 区也具有与抗原结合的亲合力, 保持完整抗体的特异性。

他们用PCR 法从免疫脾细胞的基因组D N A 分离v H 区, 随后在大肠杆菌中表达。

这些v H 区的表达产物可以在收获脾细胞后几天内获得, 而生产单抗需经几个月时间的细胞培养。

这种所谓单域抗体, 大小只有完整Ig G 分子的1/2 , 比较容易穿人细胞,到达完整抗体不能接近的表位。

在将来,这种单域抗体可作为具有抗原特异性的基本元件,用来构建有结合亲合性和效应功能的抗体。

2.4全套抗体基因库对动物个体而言, 针对某一特定抗原, 通常可产生5 一10000个分泌单抗的B 细胞克隆, 若加上抗体产生过程体细胞的变异, 则产生能与该抗原结合的单抗的 B 细胞克隆数更大。

而用杂交瘤技术最多只能筛选出几百种单抗, 这对筛选催化抗体是非常不利的。

筛选催化抗体需要“查阅”全套抗体库, 以便筛选出有强催化作用的Ig 分子.Ig 与抗原结合的能量主要来自重链, 轻链的作用差一些.有些Ig 具有不同的特异性, 而其V L 区非常相似。

因此,将全套抗体基因库中的v H 基因与有限数目的H L 基因排列组合构建Ig, 从中可筛选出有催化作用的抗体。

2.5噬菌体抗体噬菌体抗体的主要特点是它即可以识别相应抗原并与其结合，又能够在感染宿主菌中扩增。

将B淋巴细胞全套可变区基因克隆出来，组装成噬菌体抗体群体，即成为噬菌体库。

构建抗体库过程中采用较多的噬菌体载体是Barbas和Clackson构建的载体---pComb3。

3、单克隆抗体的应用单克隆抗体问世以来，由于其独有的特征已迅速应用于医学很多领域。

主要表现在以下几个方面。

3.1检验医学诊断试剂作为检验医学实验室的诊断试剂，单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。

并且单克隆抗体的应用，很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。

应用单克隆抗体制作的商品化试剂盒广泛应用于：①病原微生物抗原、抗体的检测；②肿瘤抗原的检测；③免疫细胞及其亚群的的检测；④激素测定；⑤细胞因子的测定。

单克隆抗体对抗原的识别，与多克隆抗体有很大的不同。

不同试剂盒因使用的单克隆抗体不同，识别抗原的位点不同，导致检测结果有一定差异。

因此，标准化问题还需要进一步研究。

3.2蛋白质的提纯单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。

将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如Speharose 2B、4B、6B等）上，并制备成层析柱。

当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。

将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。

3.3 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。

另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。

单克隆抗体主要为鼠源性抗体，异种动物血清可引起人体过敏反应。

因此，制备人-人单克隆抗体或人源化抗体更为重要，但此方面仍未取得明显进展。

4、展望与化学药物相比，单克隆抗体药物开发有不少优越性。

由于单克隆抗体药物市场增长迅速、研发成功率较高以及效果明确，因此已成为生物医药的重要开发领域，而且吸引着越来越多的厂家加入该研究开发领域。

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