桑叶有效部位对胰岛素抵抗HepG2细胞体外糖代谢的影响

桑叶有效部位对胰岛素抵抗HepG2细胞体外糖代谢的影响方飞;吴新荣;罗明俐;吕欢【摘要】目的探讨桑叶水提物(mulberry leaves extracts,MLE)、桑叶多糖(mulberry leaves polysaccharides,MLP)、桑叶黄酮(mulberry leaves flavonoids,MLF)对胰岛素抵抗HepG2(IR-HepG2)细胞糖代谢的作用.方法采用高浓度胰岛素(INS)持续作用于HepG2细胞24h建立胰岛素抵抗模型,加桑叶有效部位孵育24h后,测定对照组和加药组细胞内葡萄糖消耗量、肝糖原含量及己糖激酶(hexokinase,HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)的活性.结果 MLE、MLF 明显增加了细胞的葡萄糖消耗；MLE能明显提高IR-HepG2细胞HK、PK活性,增加肝糖原含量.结论 MLE、MLF可以明显改善胰岛素抵抗状态下HepG2细胞对葡萄糖的利用；MLE提高肝HK、PK活性,促进葡萄糖进入肝细胞,使肝糖原合成增加,从而达到促进糖代谢、改善糖尿病病症的作用.%Objective To explore the effect of bioactive components in mulberry leaves, including mulberry leaves extracts (MLE) , mulberry leaves polysaccharides (MLP) and mulberry leaves flavonoids (MLF), on glucose metabolism in insulin-resistant HepC2 cells. Methods The insulin resistant models of HepC2 cells were induced by high concentration of insulin for 24 h. The glucose consumption of cells, the liver glycogen, hexokinase ( HK) and pyruvate kinase ( PK) were measured after incubation with bioactive components in mulberry leaves. Results MLE and MLF advanced glucose uptake in insulin-resistant HepC2 cells. The liver glycogen synthesis, HK secretion and PK secretion increased significantly after incubation with MLE. Conclusions MLE and MLF can improve the glucose consumptions in insulin-resistant model of HepG2cells. MLE can enhance HK and PK vitality,promote blood glucose to enter the liver cells and increase glycogen synthesis. MLE may regulate the glucose metabolism and improve the symptoms in diabetes mellitus.【期刊名称】《广东药学院学报》【年(卷),期】2011(027)006【总页数】4页(P637-639,657)【关键词】HepG2细胞;胰岛素抵抗;桑叶有效部位;糖代谢【作者】方飞;吴新荣;罗明俐;吕欢【作者单位】广州军区广州总医院药剂科,广东广州 510010;广州军区广州总医院药剂科,广东广州 510010;广州军区广州总医院药剂科,广东广州 510010;广州军区广州总医院药剂科,广东广州 510010【正文语种】中文【中图分类】R965糖尿病是由多种原因引起的糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱，以血糖增高和糖尿为特点，进而导致多系统、多脏器损害的综合征。

胰岛素抵抗是其病症之一。

近年来人们开始利用胰岛素抵抗HepG2(IR-HepG2)细胞模型筛选抗糖尿病药物，取得重要结果。

桑叶是我国传统中药之一，现代药理研究证明[1-4]，桑叶具有降血糖、降血压、抗氧化、抗菌、抗焦虑、抗疲劳等多种药理活性，特别在对糖尿病及其并发症的预防和治疗方面，具有药性平和、作用广泛和不良反应少等特点。

本实验研究了桑叶水提物(mulberry leaves extracts，MLE)、桑叶多糖(mulberry leavespolysaccharides，MLP)、桑叶黄酮(mulberry leaves flavonoids，MLF)对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗、肝糖原、己糖激酶(hexokinase，HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)的影响，从调节糖代谢和改善胰岛素抵抗等方面探讨桑叶有效部位降血糖的作用机制，为综合开发利用桑叶资源提供依据。

1 材料1.1 材料和试剂MLE、MLP、MLF、罗格列酮由广州军区总医院药剂科提供；结晶牛胰岛素(Sigma公司)；含酚红DMEM高糖培养基、无酚红DMEM高糖培养基(葡萄糖含量均为25 mmol/L)、胎牛血清(Hyclone公司)；胰蛋白酶(杭州吉诺)；葡萄糖测定试剂盒(上海科欣生物技术研究所)；己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；BCA法蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)。

1.2 仪器酶标仪(Biocell)；CO2培养箱(Thermo)；超净工作台(AIR TECH)；离心机(KUBOTA 5220)；倒置显微镜(OLYMPUS CK40)；紫外分光光度计(OPTIZEN 2120UV)；超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技有限公司)。

2 方法2.1 HepG2细胞培养HepG2细胞复苏后用15%(φ)胎牛血清的DMEM高糖培养液转入25 cm2培养瓶中，在37 ℃，5%CO2条件下培养。

当细胞贴满长满后，胰酶消化，每3天按1∶3比例传代1次，取对数生长期的细胞用于实验。

2.2 IR-HepG2细胞模型的建立参考文献[5-6]的基础上加以改进，将细胞以3 000个/孔接种于96孔培养板中。

分为对照组和模型组。

待细胞贴壁长至80%后，PBS洗2次，加入新配置的含有胰岛素浓度10 μg/mL的培养液(无血清)，于37 ℃，5%(φ)CO2培养箱中孵育24 h，即为IR-HepG2细胞模型。

2.3 IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量的检测取对数生长期的HepG2细胞，以3 000个/孔接种于96孔板。

实验分为空白组、对照组(不含药的正常细胞组)、IR模型组、桑叶有效部位组、罗格列酮阳性对照组。

除空白组、对照组外，其他各组按照“2.2”项下方法复制IR模型。

给药组在造模后分别加入MLE 1 500 mg/L、MLP 250 mg/L、MLF 100 mg/L、罗格列酮3.3 mg/L。

每组设6个复孔。

加药物24 h后以葡萄糖氧化酶法检测培养液上清液中的葡萄糖含量(6组培养液中均含0.1 μg/mL胰岛素)。

以未接种细胞的空白组的葡萄糖含量均值减去测得的培养液中葡萄糖含量即得各孔细胞的葡萄糖消耗量。

2.4 IR-HepG2细胞糖原合成量的检测取对数生长期的HepG2细胞，以25 000个/孔接种于6孔板。

同“2.2”项复制IR模型。

实验分为对照组、IR模型组、桑叶有效部位组、罗格列酮阳性对照组。

按上述剂量给药，每组设6个复孔。

加药物24 h后，以细胞裂解液裂解细胞，取少量裂解后的细胞液用BCA法蛋白浓度测定试剂盒测蛋白含量，剩余裂解后的细胞液以95%(φ)无水乙醇沉淀过夜，然后应用蒽酮法测定其糖原含量[7]，进而计算肝糖原。

肝糖原=糖原含量(μg/mL)/蛋白含量(μg/mL)。

2.5 桑叶有效部位对IR-HepG2细胞HK、PK的影响实验分组同“2.4”项。

胰酶消化HepG2细胞，离心取其沉淀，PBS洗2次后加入PBS定容至1 mL。

超声波细胞破碎，取少量细胞破碎液用BCA法蛋白浓度测定试剂盒测蛋白含量，剩余细胞破碎液按照HK、PK试剂盒方法测定HK、PK活性。

2.6 统计方法实验结果均以±s表示，采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果3.1 桑叶有效部位对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响IR模型组细胞的葡萄糖消耗量明显低于对照组(P<0.01)，葡萄糖消耗量减少42.03%，说明该模型组细胞对胰岛素产生抵抗；与IR模型组比较，MLE、MLF 均增加了细胞的葡萄糖消耗，改善了胰岛素抵抗状态，差异具有统计学意义(P<0.01)，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

MLE、MLF分别可以提高葡萄糖消耗率36.43%、37.16%。

见表1。

3.2 桑叶有效部位对IR-HepG2细胞糖代谢的影响模型组细胞肝糖原含量、HK活性、PK活性均明显低于对照组(P<0.01)。

MLE能明显提高IR-HepG2细胞HK活性、PK活性，增加肝糖原含量，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

MLP 亦能明显提高IR-HepG2细胞HK活性、PK活性，增加肝糖原含量，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

与对照组、模型组比较，MLF只能提高HK活性(P<0.01)，PK活性的提高、肝糖原的含量增加均不明显(P>0.05)，见表2。

表1 桑叶有效部位对HepG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗的影响Table 1 Effect of bioactive components in mulberry leaves on glucose consumption in insulin-resistant of HepG2 cells(±s,n=6)组别ρ/(mg·L-1)葡萄糖消耗量/(mmol·L-1)消耗量增加/%对照组-3.119±0.080-模型组-2.196±0.262△△42.03罗格列酮组3.32.879±0.179∗∗23.72MLE组1 5002.996±0.315∗∗36.43MLP组2502.726±0.204△△∗∗24.13MLF组1003.012±0.311∗∗37.16与对照组比较:△△P<0.01;与模型组比较:**P<0.01 。