09-致畸作用的研究方法081215
第九章 致畸作用
第九章致畸作用致畸作用是指对胚胎、胎儿或其后代造成的基因突变或畸形影响。
许多物理、化学或生物学因素会对胚胎发育产生危害，导致致畸作用。
本文将介绍致畸作用的定义、影响及预防措施。
1. 定义致畸作用是指在胚胎、胎儿或其后代发育过程中,由某些化学、生物或物理因素引起的染色体畸变、基因突变、产生畸形或影响机体正常发育功能的一种损害。
2. 影响致畸作用可能会导致严重后果，包括：2.1 基因突变或损伤基因突变是指DNA的结构或序列发生变化，导致基因功能异常或消失。
一些因素如X射线和化学物质都可能导致基因突变，有些基因突变可能带来慢性疾病或癌症等严重后果。
2.2 染色体畸变染色体畸变是指染色体结构或数量异常，可能导致阳性染色体畸形，自身免疫疾病等后果。
2.3 影响胚胎发育一些物理或化学物质可能导致胚胎发育异常，如严重的神经管缺陷、心脏病等先天性病变。
3. 预防措施为了预防致畸作用，必须采取一些措施来避免因素的致害作用，包括：3.1 避免化学物质尽量避免接触有毒有害的化学物质，特别是毒性较强或它们能形成危险代谢产物的物质。
3.2 科学合理用药孕期切忌随意用药，必须经过医生指导，科学合理用药。
3.3 保持良好的卫生习惯经常洗手并保持良好的卫生习惯，可以降低感染和接触有害物质的几率。
3.4 定期体检定期检查、筛查并随访高危孕妇以及有遗传疾病家族史的群众，可以及早发现异常情况并制定有效措施。
致畸作用严重影响胎儿或其后代的正常发育，预防致畸作用至关重要。
减少接触有害物质，科学合理用药，保持良好的卫生习惯，定期进行体检是预防致畸作用的有效措施。
药物致畸性和胚胎毒性研究
药物致畸性和胚胎毒性研究药物的致畸性和胚胎毒性研究是药物安全性评价中的重要内容。
这种研究主要用于评估药物在妊娠期间对胎儿的影响，确保药物使用不会对胚胎发育和妊娠产生不良影响。
本文将详细介绍药物致畸性和胚胎毒性研究的内容、方法和应用。
一、药物致畸性和胚胎毒性的定义与分类畸胎（Teratogenesis）是指外界因素所致的胚胎和胎儿在生长发育过程中出现异常或异常发育，这些异常可以是结构异常、功能异常或颜色异常等。
而胚胎毒性（Embryotoxicity）是指药物或其他化学物质对受精卵、胚胎或胚胎发育中的细胞和组织造成直接或间接的有害影响。
药物致畸性和胚胎毒性的研究主要是为了评估药物对正常胚胎发育的影响，并预测药物在妊娠期间的安全性。
根据胚胎发育的阶段，药物致畸性和胚胎毒性可分为早期胚胎发育阶段和后期胚胎发育阶段的研究。
早期胚胎发育阶段研究主要是观察药物对受精卵、囊胚和胚胎植入过程的影响，例如胚胎的存活率、发育速度、着床率等。
后期胚胎发育阶段研究主要是观察药物对胚胎器官和系统发育的影响，例如心脏、肺、肾等器官的形态和功能。
二、药物致畸性和胚胎毒性研究的方法1. 体内试验方法：体内试验方法是最常用的药物致畸性和胚胎毒性研究方法之一。
常用的动物模型包括小鼠、大鼠、兔子等，通过给动物灌胃或注射药物，观察药物对胚胎发育的影响。
体内试验可以直接观察到药物对胚胎的影响，但由于动物模型与人类的差异，其结果在转化到临床应用上还需要谨慎解释。
2. 体外试验方法：体外试验方法是通过利用体外培养技术，观察药物对胚胎细胞的影响。
常用的体外试验方法包括细胞毒性实验、细胞增殖实验、细胞凋亡实验、细胞迁移实验等。
这些实验可以从细胞水平上研究药物的毒性和致畸性效应，但其结果在体内效应的预测方面仍需进一步确认。
3. 组织工程技术：组织工程技术是近年来发展起来的一种新的研究方法，可以模拟人体器官和组织的结构和功能。
通过将胚胎干细胞或胚胎组织培养在体外，可以模拟胚胎发育的过程，研究药物诱导的异常发育和毒性效应。
致畸因子作用的原理和功效
致畸因子作用的原理和功效致畸因子是指对胚胎或胎儿发育产生畸形影响的物质或因素。
引起胚胎畸形的致畸因子可以分为遗传和非遗传两大类。
遗传因子是指与基因有关的致畸因子，包括染色体异常、基因突变等。
通过遗传学方法以及科学研究发现，许多染色体异常和基因突变与胚胎畸形的发生有关。
例如，唐氏综合征就是由于染色体21三体，导致胚胎或胎儿出现智力发育迟缓等一系列身体和智力异常。
此外，一些早产，低体重儿等问题，也与遗传因素有关。
非遗传因子可以分为生化因子和物理因子两大类。
生化因子包括母体疾病、感染、药物、物理因子包括辐射、温度等。
这些非遗传因子在胚胎发育的不同阶段起作用，具有不同的机制和影响。
生化因子：1.母体疾病：母体在妊娠期患有严重的疾病，如糖尿病、高血压等，会导致胎儿出现发育迟缓、器官异常等问题。
2.感染：孕妇感染某些病毒、细菌或寄生虫，如风疹病毒、巨细胞病毒等，可能导致胎儿畸形，如先天性心脏病、耳聋等。
3.药物：一些药物，如酒精、可卡因、某些抗生素等，经过胎盘进入胎儿体内，会对胎儿发育产生不良影响。
物理因子：1.辐射：高剂量的辐射，如X射线、γ射线等，可能引起胎儿染色体异常或器官畸形。
2.温度：孕妇长期暴露在高温环境下，如高热、高温浴、桑拿等，会导致胎儿神经管畸形或其他器官异常。
致畸因子的作用机制主要有几个方面：1.致突变：某些致畸因子可以导致基因突变或染色体异常，从而影响胚胎或胎儿的正常发育。
2.干扰细胞信号传递：致畸因子可以干扰胚胎发育过程中的细胞信号传递，导致胚胎器官形成和功能发挥异常。
3.干扰基因表达：致畸因子可以抑制或激活某些基因的表达，导致胚胎发育过程中的关键基因无法正常工作。
4.干扰细胞增殖和分化：致畸因子可以影响胚胎细胞的增殖和分化，导致器官形成过程中的细胞数量和类型异常。
致畸因子对胚胎或胎儿的影响是多样化的，包括器官畸形、身体结构异常、智力发育迟缓等。
具体影响取决于胚胎或胎儿发育的时期、长时间或短时间的暴露、致畸因子的剂量和个体的敏感性等因素。
发育毒性与致畸作用
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（二）器官形成期 孕体着床后直到硬腭闭合的一段时间 致畸敏感期或致畸作用危险期
(critical period)
器官结构畸形 胚胎死亡 吸收胎（resorption） 流产
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各个器官发育最旺盛时感受性最强，不 同器官的敏感期（target window）不同， 且有交叉重叠
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细胞周期长度的不同可能部分地影响 敏感性。如：胚胎的神经上皮对CP诱导 的细胞死亡相当敏感，而心脏有抵抗力。 第10天大鼠胚胎神经上皮的细胞周期时间 大约为9.5h，而在心脏中的细胞周期大约 是13.4h，这是由于心脏细胞比神经上皮 有更长的C0/G1期
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对DNA的损伤可在G1-S转换时、S期和 G2-M转换时抑制细胞周期的进展。CP诱导 DNA损伤可导致细胞周期混乱和特定的细胞 群体中的细胞死亡。如果DNA损伤被修复， 细胞周期能恢复正常，但如果损伤太广泛， 或细胞周期抑制太久，可能引发凋亡。在全 胚胎培养中使用活化的CP也观察到相似的胚 胎细胞周期阻断和细胞死亡
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Ⅱ阶段试验 从着床到硬腭闭合期间染毒
对成年雌性生殖功能、胚胎发育、器 官形成期的发育毒性
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Ⅲ阶段试验 从着床到幼仔断乳期间对孕（乳）母染毒 从着床到子代性成熟的母体生殖毒性(妊娠、 分娩和哺乳)和子代的发育毒性（胚胎、胎儿 生长发育，新生幼仔宫外生活的适应性，断
乳前后的生长发育，独立生活能力和性功能
3
受精的条件
精子、卵子正常发育，精子获能 （体内自然获能，体外可通过人 工授精方法获能)。 许多计划生育措施针对此条件。
精、卵排出后，只有一天左右的 存活时间。 精子低于500万/ml，或畸形精子 超过20%，几乎不能受精。
发育毒性与致畸作用
自受精之日计算：人是3-8周；大、小鼠是6~15天； 家兔为6~18天。
器官形成期发育毒性
同一剂量的一种致畸物在敏感期与胚胎接触，
可因胚胎所处发育阶段不同而出现不同的畸形。
Case1：大量维生素A在受精后第8天给予大鼠，主要出 现骨骼畸形；在第12天给予，则诱发腭裂。 case2：同样剂量砷酸钠在小鼠受精第7天和第9天分别 给予，前者主要出现脐疝，后者主要为露脑。
区分胚体和胎体两个阶段；
每个阶段损害的主要特点。
4.发育毒性（developmental toxicity）
指出生前后接触有害因素，子代个体发育为成体之 前诱发的有害影响，主要表现为：
发育生物体死亡 生长改变 结构异常 功能缺陷
发育毒性的主要表现
发育生物体死亡：包括
受精卵未发育即死亡；
除了在较高剂量几乎全窝
胚胎死亡外，正常胎、生
长迟缓和结构畸形同时存 在：这一类型较常见。
在远远低于胚胎致死的剂
量下即可出现致畸，甚至 全窝致畸：这种模式表示 受试物有高度致畸作用， 较少见。
只有生长迟缓和胚胎致死，
但没有畸形发生。
发育毒性的阈值概念
需要极大的样本数，难以用实验找出一个发生率
1928
1935 1937 1942 1944 1940 1952 1952 1959 1961
人孕期接受X线照射
VitA缺乏饮食 孕期给予某些激素 孕妇感染风疹病毒 孕妇营养缺乏 广岛、长崎原子弹辐射 溴化钠 孕妇服用氨基喋呤 孕妇食用甲基汞污染鱼 孕妇服用反应停
小头围和智力迟钝
出生猪眼缺陷和其它畸形 啮齿动物性分化异常 先天性白内障,耳聋, 心脏病 多种发育异常 唐氏综合征(小头伴智力不全) 出生后行为功能异常(大鼠) 胎儿严重畸形流产 先天性水俣病(小头,神经缺陷) 导致“ 灾难”性事件
09-发育毒性与致畸作用(081215)
围生期和出生后的发育期
儿童期肿瘤 围生期是一生中对致癌物最敏感的时期，许 多儿童期高发的肿瘤（急性淋巴细胞性白血 病、神经母细胞瘤、骶骨前畸胎瘤、胚性腺 肌瘤等）都可能与出生前接触某些环境因素 有关。 因这一时期细胞增殖快，药物代谢酶的个体 发育不全，免疫监视功能低。
第一节 概 述
发育毒理学（developmental toxicology） 研究发育生物体在受精卵、妊娠期、出 生后、直至性成熟的发育过程中，由于出生 前接触环境有害因素后，导致的异常发育结 局及有关的作用机制、发病原理、影响因素 等。 是毒理学的重要分支学科。
畸胎学（古代）
现代实验畸胎学（19世纪）
母体因素对发育毒性的影响
1. 遗传学 2. 疾病 3. 营养 4. 应激 5. 对胎盘的毒性
（二）母体毒性与胚胎毒性的关系
1. 具有致畸作用，但无母体毒性，称为非共 效应致畸物（non-coeffective teratogen）。 这种外源性化学物的致畸作用具有特定的作 用机制，与母体毒性无关。如反应停。 此种外源性化学物致畸作用往往很强，应特 别加以注意。
器官形成结束（以硬腭闭合为标志）后即进 入胎儿期（人类从妊娠56-58天开始），直到 分娩。 特点：以组织分化、生长和生理学的成熟为 主。
胎儿期
最易表现的发育毒性是生长迟缓、特异的功 能障碍（如神经、内分泌及免疫系统机能的 改变）、经胎盘致癌和偶见死胎。 胎仔或胎儿对胚胎致死作用的易感性虽较胚 胎为低，但仍可有一定数目的死产胎发生。
二、发育各阶段发育毒性作用的特点
09 发育毒性和致畸作用
4、围生期和出生后的发育期
此期接触外源性化学物质，主要表现在发育免疫毒性、 神经行为发育异常和儿童期肿瘤。 围生期接触外源化学物，会严重影响胎儿T细胞、B细胞 和吞噬细胞的发育、迁移、归巢及功能，可能暂时甚至 永久性地损伤机体的免疫系统。 许多化学物质具有发育神经毒性，表现为对感觉、运动、 自主和认知等方面的影响。
➢不良妊娠结局：妊娠后不能产生外观和功能正常
的子代。包括所有的不良结果，如流产、死胎、 死产、宫内生长迟缓、发育异常、新生儿和婴幼 儿期死亡等。
二、发育毒性作用的特点和影响因素
（一）发育各阶段发育毒性作用的特点 1、着床前期 2、器官形成期 3、胎儿期 4、围生期和出生后的发育期
1、着床前期
当时反应停成了 “孕妇 的理想选 择” ，在欧 洲、亚 洲、非洲和南美洲 被医生大 量处方给 孕妇以治疗 妊娠呕 吐。
科学家们在研制反应停时， 并没有料到这种药物会产生 如此可怕的副作用。
令人恐怖的副作用
到了1960年，欧洲的 医生 们开始发现，本 地区畸形婴儿的出生 率明显上升。这些婴 儿有的是四肢畸 形 (主要是双上肢的短 肢畸形)，有的是腭 裂，有 的是盲儿或聋 儿，还有 的是内脏畸 形。
因素。
父源性暴露引起子代发育异常包括：流产、
死胎、低出生体重、畸形、功能障碍等。
第三节 致畸（发育毒性）作用机制
先天畸形的发生方式
1、不发育(agenesis) 由于某些重要的原基组织(primordial tissue)不存在或缺乏邻近组织或前体组织的正常诱导而使原基 组织不发生，结果某个器官或躯体部分发生或完全缺如。
表现为增重减慢、功能异常、临床症状、甚至死亡。
母体因素对发育毒性的影响
【医学课件】致畸试验
致畸试验的常用方法包括体内试验和体外试验。体内试验包括整胎试验、子代试 验和围产期试验等；体外试验包括离体器官培养、细胞培养和基因检测等。
标准
世界卫生组织（WHO）和国际化学品安全规划署（IPCS）等机构颁布了致畸试 验的标准指南和方法，为试验的标准化和规范化提供了依据。同时，各国也制定 了相应的法律法规，对生殖毒性物质的检测和管理做出了明确规定。
致畸试验的结果可以用于制定相关的法律法规 和标准，为保障公众健康和安全提供有效的政 策保障。
致畸试验的研究成果还可以推广应用于临床医 学、预防医学、健康教育等领域，为提高医疗 保健水平和公众健康素养提供科学支持。
未来研究的方向和挑战
未来致畸试验的研究方向应着重于研究胚胎和胎儿发育过程中 更为精细的分子生物学机制，以及更为先进的实验技术和方法 的应用。
化学因素
接触有害化学物质，如某些药物、染料、农药等 ，可能干扰胚胎正常发育。
生物因素
如风疹病毒、巨细胞病毒等感染，可能导致胎儿 畸形。
致畸效应的表现和评价
外观畸形
如唇裂、腭裂、肢体畸形等。
智力与行为异常
智力低下、多动症等问题。
脏器功能异常
如先天性心脏病、肝肾功能不全等 。
生长发育迟缓
身材矮小、体重偏轻等问题。
致畸试验与其他研究的结合
与流行病学研究的结合
通过分析大量数据，可以研究各种致畸因子与胎儿畸形的相关性，并探讨其作用 机制和影响因素，为预防胎儿畸形提供科学依据。
与基础研究的结合
基础研究可以深入探讨胎儿发育过程中各种致畸因子对胎儿组织器官的影响，为 临床干预和治疗提供理论支持。
致畸试验的伦理和法规考虑
02
致畸试验可以为化学品、药品、食品等产品的安全性评估提供参考，为预防和 减少出生缺陷提供有效的技术支持。
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最高剂量的要求达到“最小致胚胎死亡剂量”，但不引起
母体明显中毒、流产和胚胎大量死亡。最低剂量应不出现畸 形。设计 3-4个剂量组。同时，要求设立阴性对照组和阳性
对照组。
③受试动物的处理
动物交配与母鼠受精的确定： 阴道涂片检查精虫 阴拴的检查 ④给药途径
⑤给药时间，应在
全易感期即器官形成期。
⑥孕鼠处死及胎子畸形的检查
与流行病学结合，流行病学与动物试验结合等。
(二)实验性致畸作用的研究方法 体外试验(in vitro)是近来发展很快的毒理学领域，其基本
方法是将细胞和器官、胚胎在体外的条件下进行培养并与受
试物接触，观察细胞、器官或胚胎的改变，以了解受试物是 否具有致畸作用。
由于胚胎发育及母体－胚胎的相互作用非常复杂，一个理 想的测试系统为：数据容易获得、有明确的和能够定量的检 测终点、能模拟体内胚胎发育过程。 较为理想的模型 1.再生组织的试验，利用无脊椎动物水螅的高度再生能力。
致畸（发育毒性）作用机制
1. 基因突变与染色体畸变 2. 干扰基因表达 3. 细胞损伤与死亡 4. 干扰细胞-细胞交互作用 5. 通过胎盘毒性引起发育毒性 6. 干扰母体稳态 7. 内分泌干扰作用
内分泌干扰作用
环境内分泌干扰物（Environmental Endocr内分泌调节剂 外源性雌激素 环境内分泌干扰化学物质 环境内分泌干扰化学剂
Tyrode’s液，大鼠血清)，37℃，5-20％O2，5％CO2，培养2448小时。通过生存力(胚胎一般外观、心跳与循环有无等)、 生长情况(总蛋白质含量、DNA量)、形态发生(Brown计分法)
等了解胚胎存活情况。
全胚胎培养（在评价和筛选化合物胚胎毒性）的特点:
1.胚胎胎龄的控制，它是获得处于器官发生期的胚胎，克服
总的来说，体外试验试验条件可严格控制、费时少。但是， 它与整体试验有一定的差别，体外试验注重致畸阶段和致畸 机理的某一方面，难以概括致畸全过程，故其试验结果的可 靠性尚有争议。
目前对致畸作用研究，体外试验还不足以取代整体试验。
但作为一个研究方向，值得重视。
整体试验（in vivo）:
饲养致畸试验（非传统致畸试验）
体内实验中胚胎胎龄不均一的缺点。胚胎胎龄是影响化合物胚 胎毒性作用的主要原因。胎龄的确定是通过体节来判断。 2.受试物的接触剂量和接触时间的控制，可人为地控制剂量 和时间，并排除体内试验中母体系统的干扰。 3.研究对化合物胚胎代谢的影响。 4.研究化学物胚胎代谢的联合作用。
不足之处：
1.培养基，除大鼠血清外，尚无更好的替代品。 2.化合物作用时间短。给予途径不代表整体试验。 3.评价指标不完善。
致畸因素是否确实作用于器官形成期。这是与传统致畸试验
不同。
传统致畸试验（teratogenesis test）它是检测受试物通过妊 娠母体，能否引起胚胎畸形的动物试验。其目的是要确定受
试物对胚胎作用的性质和表现，以及引起此种作用的阈剂量。
阐明对胚胎产生损伤作用的机理。 主要观察指标为畸形发生率和畸形的类型。实际上，它可
通过比较成虫与人工胚胎之间的毒性反应，评价受试物的胚
胎毒作用。 2.胚胎组织培养，包括胚胎细胞(果蝇原肠胚期的卵)、胚 胎器官(肢牙)、全胚胎等。
全胚胎培养(whole embryo culture，WEC)
原理：将妊娠第 9或第 10天的大鼠(小鼠早一天)处死， 子宫移入无菌的培养盘中，取出带有蜕膜的胚胎。在解剖显 微镜下，去除蜕膜、滋养层、卵黄囊壁层和Reichert’s膜，注 意不要损伤卵黄囊脏层和羊膜。将胚胎置入培养液(Hank’s与
环境雌激素对生殖系统的发育具有明显影响
在发育的关键期，环境激素对雌激素和雄激 素功能的破坏，可对发育中的生殖器官和其 它具有这些激素受体的器官造成永久性的改 变。
致畸作用的研究方法
(一)人群流行病学研究方法
包括描述流行病学研究（现况调查） 回顾性研究 前瞻性研究（可控制因素与程度，意义更大，困难也大， 不能设接触组）；实验流行病学研究；其他如细胞遗传学
观察胚胎死亡、生长迟缓和畸形发生；如有条件，孕鼠自然
分娩，让仔鼠生长存活一段时间，亦可观察其功能不全等指 标。主要取决于试验动物数目和仔鼠的数目，只有在样本数
足够的情况下，才能对受试物的致畸作用或胚胎毒性作用作
出全面的评价。
①动物选择：应选用胎儿母体关系与人相近，性成熟动物，
要求自然畸胎率低、产仔多、孕期短、价格低廉、易于获得， 操作检查方便。 大鼠(性成熟，雄性250克，雌性200克)，数量15-20只 ②剂量设计：找出最小致畸剂量和最大无致畸剂量。
传统致畸试验（teratogenesis test）
饲养致畸试验是将断奶后的动物，接触受试物，通过交配、 受孕、检查后代有无畸形。此试验可以结合繁殖试验进行。
由于动物在试验全过程接触受试物，故受试物可作用于生殖
细胞，也可作用于体细胞。它可观察因生殖细胞突变和体细 胞突变引起的畸形，包括遗传因素在内。但是，它不易判断
分三级：<10 不致畸，10-100致畸，>100 强致畸
⑦致畸危险度评价
评价实验动物畸胎发生率的高低。 致畸作用具有剂量与效应关系，经统计学处理，肯定试验 组的胎仔畸形率高于对照组，才会考虑其致畸作用。 注意变异与畸形的区别。变异是生物体群体中个体间的差
异，变异出现率低，也没有剂量与效应关系。
同种动物实验结果的重现性，多种动物实验结果的一致性。
一般指标：
母体的体重、黄体数、着床总数、胎块（子宫腺、吸收胎、 早死胎）数、晚死胎数和活胎数； 胎仔的体重、身长、尾长等。
畸胎出现率(％)=(出现畸形胎仔总数/活产胎仔总数)×100％ （每一活胎出现一种以上畸形时，均作一个畸胎计）
平均畸胎出现率(％)=(畸形总数/活产胎仔数)×100％
单项畸形出现率(％)=(其中出现某种畸胎总数/该组母体所产 活胎总数)×100％ 致畸指数=母体LD50/最小致畸剂量 反映致畸强度，比值大，致畸性愈强。
环境雌激素不仅使许多野生动物的繁殖能力 下降，而且对人类的生殖健康也产生了潜在 的威胁。 这些雌激素一方面可能保护人类免患激素依 赖性疾病，如乳腺癌、前列腺癌和骨质疏松 症；另一方面，对生殖系统产生危害，如大 豆异黄酮可引起妇女月经紊乱等。
动物实验表明，外来雌激素几乎可引起各 类型的雄性生殖系统发育障碍，包括性腺发 育不良、睾丸萎缩、睾丸和附睾重量减轻、 生精细胞、支持细胞和间质细胞数目减少、 精液质量下降、精子数减少甚至无精子、睾 丸肿瘤、隐睾、性欲降低或不育等
考虑的是种属差异问题。一般认为在两种动物显示致畸作 用，增加了预示致畸作用的可靠性。但是，只要受试物对一 种动物具有致畸，就应警惕它对人类具有致畸性的潜在危险。
动物致畸的有效剂量与人类实际可能摄入量之比值的大小。
许多化合物达到一定剂量，都能呈现致畸作用，如阿斯匹 林、磺胺类对大鼠具有致畸作用，但人类已长期使用，未发 现致畸作用。实验常用的阳性对照物 VitA ，它是人体必需的 营养素。