植物细胞色素P450基因的克隆策略及鉴定方法

摘要 细胞色素 P450是动植物及微生物体内一类重要的具有混合功能的血红素氧化还原酶, 它参与多种生化反应, 植物 P450参与许 多植物体次生代谢物质的合成和外源物质代谢解毒, 在防御生物免受病虫害及逆境胁迫等方面具有重要作用。综述了植物细胞色素 P450基因的克隆策略及鉴定方法, 并对其未来研究作了展望。 关键词 细胞色素 P450; 克隆策略; 鉴定方法 中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517- 6611( 2009) 11- 04911- 04
细胞色素 P450( cytochrom e P450, 简称 P450)广泛存在于 动物、植物、细菌、真菌等细胞内[ 1], 是与内质网、线粒体、质 体、高尔基体等细胞器膜结合的一类以血红素为辅基的 B 族 细胞色素超家族蛋白酶。由于还原态 P450与一氧化碳结合 后在 450 nm 处有一吸收峰, 因此命名为 P450。最早于 1958 年在大鼠肝微粒体中发现。 1969年, Frear等首次发现在植 物中也存在 P450。已有的研究表明, 细胞色素 P450 是高等 植物中最大的酶蛋白家族, 不仅参与植物体的基础代谢, 还 参与了植物的次生代谢, 主要表现在次生代谢物质如黄酮 类、香豆素、异黄酮类氰甙、生物碱、萜类等的合成以及降解 外源化学药物毒性 2个方面 [2- 3]。 P450 催化的代谢途径可 产生一些重要的次生代谢产物, 使植物抵抗病虫害及逆境胁 迫, 而参与物质代谢的 P450将杀草剂、杀虫剂及其他毒害化 学物质转化为非毒害化合物。目前, 关于植物细胞色素 P450 的研究主要集中在基因片段的克隆、全基因的获得等方面, 而关于 P450功能及其鉴定方法的文献综述相对较少, 因此, 笔者就植物细胞色素 P450 的克隆策略和鉴定方法作一综 述, 以期对相关的研究有所帮助。 1 P450基因的克隆策略
安徽农业科学, Jou rn al ofAnhu iAgr.i Sc.i 2009, 37( 11): 4911 - 4914
责任编辑 金琼琼 责任校对 张士敏
Leabharlann Baidu
植物细胞色素 P450基因的克隆策略及鉴定方法
张松焕
1
,
李明泽
2
,
张
军
3
,
李春奇 1
*
( 1. 河南农业大学生命科学学院, 河南郑州 450002; 2. 濮阳职业技术学院, 河南濮阳 457000; 3. 河南农业大学林学院, 河南郑州 450002 )
自 1958年首次发现细胞色素 P450基因以来, 每年发表 的有关 P450的文章超过 2 000篇。迄今为止, 利用缺失功能 突变体法、差异筛选法、抗体或探针筛选 cDNA 文库、同源序 列法等方法已成功地分离了上万个 P450基因 ( http: / /www. ncb.i n lm. n ih. gov/G enbank /), 部分 P450 基因功能已得到鉴 定 [ 4] 。植物细胞色素 P450基因 cDNA 和片段的克隆策略大 致如下: 1. 1 mRNA 差异显示技术 mRNA 差异显示技术 ( mRNA d ifferen tial disp lay PCR, DD PCR )具有简单、快速、灵敏、重现 性好、多用途和可适用于微量起始 RNA 等优点。 2004年, 余 小林等利用 mRNA 差异显示技术结合 cDNA 末端快速扩增
作者简介 张松焕 ( 1980 - ), 女, 河南 洛阳人, 硕士研 究生, 研 究方向: 植物分子生物学。 通* 讯作者, E m ai:l licq66@ 126. com。
收稿日期 2009 01 21
( RACE )技术成功分离并克隆到 1个与白菜核雄性不育相关 的编码细胞色素 P450 cDNA 全长 CYP86MF [ 4] 。经过 Gen Bank BLAST查询, CYP86MF 与位于拟南芥第 1条染色体上 的编 码 细 胞 色 素 P450 基 因 CYP86C4 的 核 苷 酸 序 列 有 85 3% 同源性, 氨基酸同源率为 84. 9% 。M arten S等从大丁草 ( G erbera hybrid s)中通过差异显示获得了一个 P450基因全长 cDNA CYP93B2, 由酵母表达的 CYP93B2 可以催化黄烷酮产 生黄酮, 序列比较显示, 该基因与黄酮合成酶 FNS 的 序列同源性为 54% 。 [ 5] 1. 2 功能突变体法 郑文光等利用以 Col 0 为背景的拟南 芥 EM S诱变的 M 2群体, 培养得到突变体 ber15, 从而分离克 隆到一个细胞色素 P450 单加氧酶 C YP85A2, 该酶是油菜素 内酯 ( BR )生物合成途径中的一个重要的酶[ 6]。 Zhou等利用 图位克隆 ( m ap based clon ing)从拟南芥突变体 pad3 中, 获得 催化合成植保素 cam alexin 的 PAD3 基因, 该基因与玉米中催 化源于吲哚次生代 谢物 2, 4 dihydroxy 1, 4 benzoxazin 3 one 合成的酶类似, 且与 P450单加氧酶的同源性很高, D. N elson 将其命名为 CYP71B15, 它能使拟南芥抗黑斑病菌 ( Alternaria brassicicola ), 但不影响植株对丁香假单胞菌 (P seudom onas sy ringae)的抗性 [ 7] 。 1. 3 纯化 P450蛋白, 制备抗体以筛选 cDNA 表达文库 从 植物中分离和纯化具有特定目的的 P450蛋白, 再以此为抗 原制备抗体, 用于筛选同种植物的 cDNA 表达文库, 从中分 离和调出目的 P450基因 cDNA。由于蛋白质的分离纯化较 困难, 抗体制备也相当费时, 所以利用该方法对植物 P450 的 克隆没有广泛使用, 目前, 仅 C YP74B1 通过该方法获得 [ 8] 。 1. 4 用已知的植物 P450基因作为探针筛选 cDNA 文库或 基因组文库 由于克隆出来的 P450基因逐渐增多, 所以利 用该方法使得 P450基因的克隆速度大大加快。探针可以从 不同种植物已克隆出来的 P450基因中进行选择, 然而, 探针 有时与筛选的基因并不属于同一家族 [ 9]。Um em oto等以茄 子 CYP75A2 基因的部分片段为探针, 从其基因组文库中筛选 出 3个 CYP71 家族成员, 即 CYP71A2、CYP71A3 和 CYP71A4[10] 。
C loning Strategies and Identification M ethods of P lant Cytoch rom e P450 Gene ZHANG Song huan et al ( College of L ife Sciences, H enan A griculturalU niversity, Zhengzhou , H enan 450002) A bstract Cytochrom e P450s are a diverse array ofm ultifunctional hem e ox idoreductase in anmi als, plants and m icrobe. They participates in lots of biochem ica l reactions. P lant cy tochrom e P450s involve in the synthesis o fm any secondary m etabo lites and detoxification m etabo lism o f exogenous tox ins. They play an mi portant role in preventing plants from pathogen and insect attacks and adversity stress. The cloning strateg ies and identifica tion m ethods of plant cytochrom e P450sw ere summ arized. And the future researches were pred icted. K ey w ords Cytochrom e P450; C loning stra tegy; Identification m ethods
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安徽农业科学
2009年
与 CYP75 同源性比较, 其值最高达 35. 0% 。 Bak等以 CYP81 为探针, 采用低严谨 ( low stringency)杂交从小麦中分离出了 基因 CYP51[ 11] 。 1. 5 同源序列法 植物 P450基因含有一段血红素结合区 域 (H em e b inding region), 该结合区域的氨基酸序列为 P F G X G R R X C X G, 根据这段保守氨基酸序列设计简并性 引物, 并用简并引物对 cDNA 文库进行 PCR扩增, 再以 PCR 产物作为探针, 对 cDNA文库进行筛选, 或采用 RACE 途径, 从而得到全序列 P450 cDNA[ 12] 。王东兰等根 据菊科植物 P450基因 C YP75B5 和 CYP75B6 核酸序列同源区设计引物, 用 RT PCR方法从紫茎泽兰植株中获得一个细胞色素 P450 基因 CYP75 片段。经过氨基酸序列同源性比较, 发现该段序 列与 CYP75B5 和 CYP75B6 的氨基酸序列分别具有 79. 5% 和 85. 6% 的同源性[ 13] 。C astellarin 等根据基因 F3 H 和 F3 5 H 的保守区域设计简并引物, 从葡萄 Vitis vinifera 中分离得到 了其基因片段, 它们与植物细胞色素 P450单加氧酶 CYP75 分别有 76. 0% 和 82. 0% 的同源性[ 14] 。但是, 由于同源序列 有时候并不专属于 P450基因某一家族, 因此扩增产物不一 定属于同一家族。例如 Ralston 等从烟草中同时克隆分属于 4个家族的 6个基因, 即 CYP71D20 和 CYP71D21, CYP73A27 和 CYP73A28, CYP82E1 和 CYP92A5 。 [15] 1. 6 表达序列标签 ( expressed sequence tag)法 Ikezaw a等 报道从体外培养的日本黄连 ( C optis japonica )细胞表达序列 标签文库里分离和鉴定了一个 P450( CYP80G2 ) cDNA, 该基 因的氨基酸序列与小檗属植物 B erberis stolonif era C YP 80A 1 有很高的同源性, 它的酵母表达试验 表明, CYP80G2 对从 ( S) reticuline(苄基异喹啉型 ) 到 ( S) corytuberine(阿朴啡 ) 具有作用于分子内的 C C 酚偶联活性[ 16] 。用 dbEST cDNA 筛选的方法从拟南芥中得到 1 152个不同的序列, 但不都是 P450基因 [17]。 2 P450的鉴定方法 2. 1 核酸检测 核酸检测技术具有适用范围广、准确性高、 灵敏度高、费用低等优点, 对于表达量不高的外源结构基因 尤为适宜。核酸检测方法主要有核酸印迹法 ( Southern b lot ting)、PCR 技术、基因芯片技术等, 其中 PCR技术中又包括 常规 PCR、多重 PCR、竞争 PCR、PCR EL ISA ( Enzym e Linked Imm unosorbent Assay, ELISA)、PCR GeneScan、荧光定量 PCR等。 2. 1. 1 Southern印迹法 ( Southern b lotting)。 Southern印迹法 是一种常用的核酸检测试验技术, 它将待检测的 DNA 分子 用或者不用限制性内切酶消化后, 通过琼脂糖凝胶电泳进行 分离, 继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维 素薄膜或尼龙膜上, 固定后再与同位素或其他标记物标记的 DNA 或 RNA 探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补 的序列, 则二者通过碱基互补的原理进行结合, 游离探针洗 涤后用自显影或其他合适的技术进行检测, 从而可以推知目 的基因的特定序列定位, 基因的缺失或突变都有可能导致带 的缺失或位置改变。 2. 1. 2 PCR 技术。 2. 1. 2. 1 半定量 RT PCR ( Sem i quantitative Reverse T ran scription PCR)。半定量 RT PCR 是一种常用的具有很高灵