薄层色谱柱色谱及凝胶色谱法
薄层色谱法原理
第一节
薄层色谱法的基本原理
c
a b
a R f R c
st
b c
起始线
AA
BB
Rf值相差越大，分离越好。一般要求分 离后组分的Rf值在0.2～0.8之间，各组 分的Rf值之差应大于0.05，以防斑点重 叠。
（二）固定相和流动相
• 1、固定相（吸附剂）
• 常用的吸附剂：硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭和大孔吸 附树脂等。 • 吸附剂的选择要合适，与流动相、被分离化合物不反应
被分离试样组分极性、吸附剂活性和展开剂极性之 间的关系
活泼 Ⅰ C’ B C 极性
吸附剂 （固定相）
展开剂 （流动相）
不活泼 B’
Ⅴ
A’ A
非极性
非极性 被分离物质
极性
展开剂成分的选择： 对于容易分离的化合物，用单一溶剂展 开 优点：溶剂简单，分离重现性好。 对于难分离组分，则选用二元、三元、 甚至多元溶剂 Rf太小——加入强极性展开剂 Rf过大——降低展开剂的极性
• 定义：薄层色谱法是将被分离的试样 溶液点在薄层板的一端，再用溶剂把 试样展开，从而使试样组分分离。 • 分型：吸附薄层色谱、分配薄层色谱 法、离子交换薄层色谱法、凝胶色谱 等。
（一）薄层色谱法的原理
将一定粒度的吸附剂 均匀地涂铺在表面光 洁的玻璃板或塑料平 板上，制成薄层板。
把待分析试样的溶液滴 加在薄层板的起始线 上（点样）
• 2、流动相（展开剂） 薄层色谱法中采用单一溶剂或多元 混合溶剂作流动相，称为展开剂。 与吸附柱色谱法中选择流动相的一 般规则相同，展开剂的选用要从被分 离试样组分极性、吸附剂活性和展开 剂的极性三个因素综合考虑。
第七章 色谱分离技术
④ 设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件， 因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子 有机化合物。
缺点： 处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此 主要用于实验室，工业生产上应用较少。
3.色谱法的分类 吸附色谱法
分配色谱法
分离机理
离子交换色谱法 凝胶色谱法
亲和色谱法
（一）基本原理
溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表 面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。
1.发生吸附作用的原理：
固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子） 所处的状态不同：
固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是 对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处 于平衡状态。
界面上的分子所受的力不对称，作用力总和不等于零， 合力指向固体内部。
小分子
（二）凝胶过滤介质
基本要求：
不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相 互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用
高物理强度、高化学稳定性 耐高温高压、耐强酸强碱 高化学惰性 内孔径分布范围窄 颗粒大小均一度高
常用的凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
1. 葡聚糖凝胶
pH、缓冲液浓度、离子强度
③ 柱操作 柱的大小、长短 ④ 流速的控制 高速度、高效率 ⑤ 清洗 除去不结合的所有物质 ⑥ 洗脱 特异性洗脱（竞争性置换目的物） ⑦ 柱的再非生特异性洗脱（调节pH、离子强度和种类、温度）
（五）亲和色谱法的应用
1.亲和色谱法的特点： 专一、高效、简便、快速
2.应用 ① 分离和纯化各种生物分子 纯化生物大分子，适于从组织或发酵液中分离
色谱法应运而生。
色谱分离是一组相关技术的总称，又叫做色 谱法、层析法，是一种高效而有用的生物分离 技术。
色谱分析法
色谱分析法色谱分析法色谱分析法是一种分离分析方法，是根据混合物中被分离物质的色谱行为差异，将各组分从混合物中分离后再选择性对被测组分进行分析的方法。
因此色谱分析法是分析混合物的最有力手段。
色谱分析法分为：1、依据分离方式分类：可分为纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。
2、依据分离原理分类：可分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法与分子排阻色谱法（凝胶色谱法）等。
（一）高效液相色谱法（HPLC）1、方法的特点与适用范围：2、测定法定量测定时，可根据供试品或仪器的具体情况以峰面积或峰高计算。
目前大多数以峰面积计算。
常用两种方法如下：内标法：按各品种项下规定，精密称定药物对照品和内标物质，分别制成溶液，各精密量取适量，混合制成校正因子测定用的对照溶液。
取一定量注入仪器，记录色谱图。
分别测量药物对照品和内标物质色谱峰面积或峰高，按式子计算校正因子f：式中，AS为内标物质的峰面积（或峰高）；AR为药物对照品的峰面积（或峰高）；CS为内标物质的浓度；CR为对照品的浓度。
再取各品种项下含有内标物在的供试品溶液，进样，记录色谱图，测量供试品中被测物质和内标物质色谱峰的峰面积或峰高，按式子计算含量：式中，AX为供试品中被测药物的峰面积（或峰高）；cX为供试品溶液的浓度；f为校正因子；A'S和c'S为内标物质的峰面积（或峰高）和浓度。
采用内标法，可避免因供试品前处理及进样体积误差对结果的影响。
外标法：按各品种项下的规定，精密称量对照品和供试品，制成溶液，分别精密取一定量，进样，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中被测物质的峰面积（或峰高），按式子计算含量：式中，AX为供试品中被测药物的峰面积（或峰高）；AR为药物对照品的峰面积（或峰高）；CR为对照品的浓度。
外标法简便，但要求进样量准确及操作条件稳定。
由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定含量时，以手动进样器定量环或自动进样器进样为宜。
薄层色谱和柱色谱色谱法是分离提纯和鉴定有机化合物的重要方法
图1 薄层色谱示意图 薄层色谱和柱色谱色谱法是分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法，有着极其广泛的用途。
色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能(即分配)的不同，或其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该物质时进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。
流动的混合物溶液称为流动相；固定的物质称为固定相(可以是固体或液体)。
根据组分在固定相中的作用原理不同，可分为吸附色谱、分配色谱等。
吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相；分配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂，以吸收较大量的液体作固定相，而支持剂本身不起分离作用。
根据操作条件不同，可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。
一、薄层色谱薄层色谱(Thin Layer Chromatography, TLC)属于固-液吸附色谱，是一种微量的分离分析方法，具有设备简单、速度快、分离效果好、灵敏度高以及能使用腐蚀性显色剂等优点。
适用于小量样品(几到几十微克，甚至0.01µg)的分离。
同时薄层色谱是一种非常有用的跟踪反应的手段，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。
也常用作柱色谱的先导，可用于柱色谱分离中展开剂的选择，也可监视柱色谱分离状况和效果。
最常用的薄层色谱属于液-固吸附色谱，把吸附剂(如氧化铝、硅胶)和粘合剂(如煅石膏CaSO 4·H 2O 、羧甲基纤维素钠等)均匀地铺在一块玻璃板上形成薄层，将分离样品滴加在薄层的一端，当利用毛细作用使流动相沿着吸附剂薄层(固定相)移动时，吸附剂借各种分子间力(包括范德华力和氢键)作用于混合物中各组分，各组分以不同的作用强度被吸附。
被分离组分在固定相与流动相之间进行分配或吸附，经过反复无数次的分配平衡或吸附平衡，不同组分的极性化合物就会在薄层板上移动不同的距离。
极性强的化合物会“粘”在极性的吸附剂上，在薄板上移动的距离比较短。
中药化学2.2 色谱分离技术
聚酰胺吸附力的影响因素： 1:形成氢键的能力与溶剂有关 水中＞有机溶剂中＞碱性溶剂中 常用溶剂对聚酰胺洗脱能力顺序如下： 水＜甲醇或乙醇＜丙酮＜稀氢氧化钠液或稀氨溶 液＜甲酰胺或二甲基甲酰胺＜尿素水溶液。
注意温度超过150 ℃则游离硅醇基之间脱 水形成硅氧醚结构丧失游离硅醇基的吸附能力。 为酸性吸附剂适于分离中性或酸性成分。
常用硅胶：
硅胶H（不含黏合剂） 硅胶G（含黏合剂） 硅胶GF254(含煅石膏，另含有一种无机荧 光剂)。硅胶GF254nm紫外光下呈强烈黄绿色 荧光背景，在荧光背景下通过紫外光照射成分 斑点为暗斑，常用于一般显色手段不易显色的 成分的分离。
3、 洗脱：
洗脱操作的目的是要将加入的样品中各个 组分先后从上往下带出来，并能分开收集各成 分。 洗脱的过程中，上端溶剂不能干，分段收 集是关键；作定性检查合并相同成分。 TLC时Rf为0.2－0.3的溶剂系统是最佳的 洗脱系统，梯度洗脱。
4. 应用 柱色谱分离能力比薄层分离能力更强， 效果更好，尤其对结构相似、性质接近、 采用薄层难以分离的成分分离效果好。
（一）吸附剂
4、常用的吸附剂
（1）硅胶SiO2•xH2O 多孔性的硅氧烷交链结构，极性吸附剂， 吸附性较氧化铝稍低，既适于分离亲水性成分， 又可用于分离亲脂性成分。 其吸附作用的强弱取决于游离硅醇基的数 目，也与含水量有关，含水量达17％以上，则 失去吸附性，所以需110℃活化30分钟。
（一）吸附剂
例：求图中A、B、C三斑点Rf大小并判断三成分 极性大小顺序。
薄层色谱柱色谱及凝胶色谱法
1.4.3展开 展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂 的活性等因
素来考虑。
薄层的展开在密闭的容器中进行。先将选择的展开剂放入色谱器中 （小板可用广口瓶代替），使色谱器内空气饱和5－10min，再将点好 试样的薄层板放入色谱器中进行展开，点样的位置必须在展开剂液面 之上，当展开剂上升到薄层的前沿（离前端 5－10mm）或多组分已明 显分开时，取出薄层板放平晾干，用铅笔划溶剂前沿的位置后，即可 显色。
2.3.5 淋洗剂 也叫洗脱剂，即流动相。 试样吸附在氧化铝柱上后，用合适 的溶剂进行洗脱，这种溶剂称为洗脱剂。如果原来用于溶解试样的溶 剂冲洗柱子不能达到分离的目的，可改用其他溶剂。一般极性较大的 溶剂影响试样和氧化铝之间的吸附，容易将试样洗脱下来，达不到将 试样逐一分离的目的。因此常使用一系列极性渐次增大的溶剂。为了 逐渐提高溶剂的洗脱能力和分离效果，也可用混合溶剂作为过渡。先 用薄层选择好适宜溶剂。常用洗脱溶剂的极性按以下次序递增。
以上看出，色谱定性困难（缺乏标样下），而
质谱 （MS )
测未知物分子量
核磁 （NMR) 测分子结构
红外光谱（IR) 测分子中的官能团
色谱、质谱、光谱、联用，取长补短，发展迅速、发挥更大 的作用。
1 薄层色谱
薄层色谱又叫薄板层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定 性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固-液吸附色谱，它兼 备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克， 甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚 加大，因此，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较 高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。此外，薄层色谱 法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。
常见的色谱法有哪几大类
常见的色谱法有哪几大类色谱法（chromatography）又称色谱分析、色谱分析法、层析法，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。
常见的色谱法主要有：柱色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、超临界流体色谱法。
1、柱色谱法原始的色谱方法，该方法将固定相注入下端塞有棉花或滤纸的玻璃管中，将被样品饱和的固定相粉末摊铺在玻璃管顶端，以流动相洗脱。
常见的洗脱方式有两种：一种是自上而下依靠溶剂本身的重力洗脱，另一种：自下而上依靠毛细作用洗脱。
收集分离后的纯净组分也有两种不同的方法：一种方法是在柱尾直接接受流出的溶液，另一种方法是烘干固定相后用机械方法分开各个色带，以合适的溶剂浸泡固定相提取组分分子。
柱色谱法被广泛应用于混合物的分离，包括：对有机合成产物、天然提取物以及生物大分子的分离。
2、薄层色谱法应用非常广泛的色谱方法，这种色谱方法将固定相涂布在金属或玻璃薄板上形成薄层，用毛细管、钢笔或者其他工具将样品点于薄板一端，之后将点样端浸入流动相中，依靠毛细作用令流动相溶剂沿薄板上行展开样品。
薄层色谱法成本低廉、操作简单，被用于对样品的粗测、对有机合成反应进程的检测等用途。
3、高效液相色谱法（HPLC）目前，应用多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是，针对其流动相为液体的特点作出很多调整。
HPLC输液泵要求输液量稳定平衡；进样系统要求进样便利、切换严密；由于液体流动相黏度远远小于气体，为了减低柱压，高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。
HPLC应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。
4、气相色谱法气相色谱法是将氦或氩等气体作为载气(称移动相)，将混合物样品注入装有填充剂(称固定相)的色谱柱里，进行分离的一种方法。
分离后的各组分经检测器变为电信号并用记录仪记录下来。
色谱分析习题及答案(绝对精华)
填充柱色谱:气固(液固)色谱和气液(液液)色谱，两者的分离机理不同。
气固(液固)色谱的固定相: 多孔性的固体吸附剂颗粒。
固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。
气液(液液)色谱的固定相: 由担体和固定液所组成。
固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。
气固色谱的分离机理:吸附与脱附的不断重复过程；气液色谱的分离机理：气液(液液)两相间的反复多次分气相色谱仪主要部件1. 载气系统：包括气源、净化干燥管和载气流速控制；常用的载气有：氢气、氮气、氦气；净化干燥管：去除载气中的水、有机物等杂质（依次通过分子筛、活性炭等）；载气流速控制：压力表、流量计、针形稳压阀，控制载气流速恒定。
2. 进样装置：进样装置：进样器+气化室；气体进样器（六通阀）：推拉式和旋转式两种。
试样首先充满定量管，切入后，载气携带定量管中的试样气体进入分离柱；气化室：将液体试样瞬间气化的装置。
无催化作用。
3. 色谱柱（分离柱）：色谱柱：色谱仪的核心部件。
柱材质：不锈钢管或玻璃管，内径3-6毫米。
长度可根据需要确定。
柱填料：粒度为60-80或80-100目的色谱固定相。
液-固色谱：固体吸附剂液-液色谱：担体+固定液。
柱制备对柱效有较大影响，填料装填太紧，柱前压力大，流速慢或将柱堵死，反之空隙体积大，柱效低。
4. 检测系统：色谱仪的眼睛，通常由检测元件、放大器、显示记录三部分组成；被色谱柱分离后的组分依次进入检测器，按其浓度或质量随时间的变化，转化成相应电信号，经放大后记录和显示，给出色谱图；检测器：通用型——对所有物质均有响应；专属型——对特定物质有高灵敏响应；常用的检测器：热导检测器、氢火焰离子化检测器；5. 温度控制系统：温度是色谱分离条件的重要选择参数；气化室、分离室、检测器三部分在色谱仪操作时均需控制温度；气化室：保证液体试样瞬间气化；检测器：保证被分离后的组分通过时不在此冷凝；分离室：准确控制分离需要的温度。
当试样复杂时，分离室温度需要按一定程序控制温度变化，各组分在最佳温度下分离；气固色谱固定相：1. 种类(1)活性炭 (2)活性氧化铝 (3)硅胶(4)分子筛(5)高分子多孔微球（GDX系列）气固色谱固定相的特点（1）性能与制备和活化条件有很大关系；（2）同一种固定相，不同厂家或不同活化条件，分离效果差异较大；（3）种类有限，能分离的对象不多；（4）使用方便。
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1956 V a n . D e c e m t e r 提出了填充柱速率理论: H=A + B/u + Cu S t a h l 发明并完善了薄层色谱。 F l o d i n发明了凝胶色谱。
1958 G o l a y 发明了毛细管色谱； 氢火焰离子检测器。
1969 K i r k l a n d 提出了表面孔度担体的新型填料。 H e r m u n 研制成第一条高效液相色谱仪。
薄层色谱、柱色谱及凝胶色谱法
金敬杰
色谱法概述
1 发展历史
俄国生物学家茨维特(T s w e t t)首先提出来的。 1903年， T s w e t t柏林会议上宣读了他的研究成果。 1906年，正式发表。
样品：植物色素的石油醚提取液。 柱： CaCO3(固定相） 洗脱剂： 纯石油醚（流动相）。 结果： 有色谱带出现。 实验方法：如图 （1-1） 所示：
石油醚
::
… .…. …..
玻璃管
……....….. …… ……..
CaCO3(粉末）
图1 色谱
1919 T s w e t t逝世，当时他的方法并未引起注意。 1931 R . k u h n（库恩）用该法成功分离了胡萝卜素和叶黄素。 1938 R . k u h n Obtain Noble P rise. 1943 R . k u h n 发明了离子交换色谱。 1944 英国的M a r t i n . J . P和S y n g e .R . L发明了纸色谱。 1948 T i s e l I u s（瑞士）发明了电泳和 吸收分析 。 1952 英国的M a r t I n . J . P和S y n g e .R . L又发明了液相色谱。
Me、无机物 少部分有机物
化学法
一般 强 一般 慢 常量
无机 （有机）
强
一般
弱
结论：
色谱法的分离效能是红外光谱、核磁和质谱所不及的,而且一般来说 色谱法的灵敏度要比红外光谱高。
色谱法有一个非常大的弱点，就是在缺乏标准样品的,情况下定性比 较困难。而质谱法可以测定未知物的分子量,核磁可以测定分子 结构，红外光谱法可以测定分子中的官能团，这是色谱法所不及 的。
1.3.2吸附剂： （1）种类：
常用：氧化铝（强极性）、硅胶（中强极性） 不常用：硅藻土、纤维素、糖类、活性碳 （2）符号：H——无任何添加剂；
G——加有锻石膏（Gypsum，CaSO4·1/2 H2O）粘合剂； F——加有荧光素（Fluorescein） CMC——加有羧甲基纤维素钠（3）粒度：颗粒的大小，表示方 法有两种： 目：1cm2内的筛孔数，数目越大，颗粒越小。薄层所用吸附剂颗粒较细， 氧化铝 为200目， 硅胶为100~150目。
GSC LLC TCL
LSC
PC
健 合 离子交 相色谱 换色谱 BPLC IC
凝胶 色谱 GPC
1.3 几种分析方法比较
分离能力 定性 定量 分析速度 分析范围
色谱
强 弱 强 快 常量、微量
分析对象 有机（无机）
特效性
一般
光谱
电化学
弱
弱
强
一般
中弱
中
快
较快
微量
常量、微量
发射光谱
原子吸收光谱 吸收光谱、有机M无、e机物 无机物大部分
2 基本原理：
色谱法是一种物理分离方法，即利用不同物质在两相(固定相和流动 相)中具有不同的分配系数(或吸附 系数、渗透性等)，当两相作相对 运动时，这些物质在二相中反复多次分配，从而使各物质得 到完全 的分离。
3 分类：
①按固定相和流动相的物态可分为：气相色谱法、液相色谱法; ②固定相的操作 方式及形状分类为：柱色谱、纸色谱、薄层色谱；
以上看出，色谱定性困难（缺乏标样下），而
质谱 （MS )
测未知物分子量
核磁 （NMR) 测分子结构
红外光谱（IR) 测分子中的官能团
色谱、质谱、光谱、联用，取长补短，发展迅速、发挥更大 的作用。
1 薄层色谱
薄层色谱又叫薄板层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定 性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固-液吸附色谱，它兼 备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克， 甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚 加大，因此，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较 高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。此外，薄层色谱 法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。
③以分离机制分 类为：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻 色 谱（凝胶色谱）、亲和色谱
流动相 固定相
表1-1 色谱法的分类
气体
液体
液体
固体 液 体
固体
吸附剂
健合固 离子交换 凝胶 定相 树脂
固定相
外型柱Biblioteka 柱 柱 平面 平面 柱柱
柱
柱
气液
名称 GL色C谱
气固 液液 薄层 色谱 液固
色谱 色谱 纸 色谱 色谱
活性等级
I
II
III
IV
V
氧化铝加水量
0
/%
硅胶加水量/%
0
3
6
10
15
5
15
25
38
（5）酸碱性：
市售氧化铝有酸性、中性、碱性，其蒸馏水洗出液的pH值分别为4、 7.5、9—10；其中以中性氧化铝应用最广，可用来分离各种化合物， 特别是那些对酸、碱敏感的化合物。大体分类如下： 碱性氧化铝适用于碳氢化合物、生物碱以及其它碱性化合物的分离。 中性氧化铝应用最广，适用于醛、酮、醌以及酯类化合物的分离。 酸性氧化铝适用于有机酸类的分离。
1.1层析原理：
利用吸附剂（硅胶、氧化铝等）对不同组分吸附能力的差异从而达 到分离目的的方法。
1.2 薄层层析的作用
（1）分离（0.5g以下） （2）柱层析的先导 （3）其他分离手段的效果检测 （4）监控反应
（5）确定组分数 （6）定性鉴定 （7）粗略比较含量
1.3 薄层层析的器材选择
1.3.1 基板：玻璃、塑料、金属箔
（4）活性：
吸附剂按其含水量的多少各分为五个等级, I级含水量最少，活性最 高；V级含水量最多，活性最低；但并不是活性越高分离效果越好， 选用哪种活性级别的吸附剂，要用实验的方法来确定。
氧化铝的活化化I~V五级，I级的吸附作用太强，V级的吸附作用太弱。 所以一般常采用II，III级。
表1 吸附剂活性和含水量的关系
1975 H . S m a l l 离子交换柱
1979 D . T. G j e r d e and J .S .F r i t z非抑柱的单柱离子色谱.
总之：1956 Van. D e e m t e r ：柱速率理论。F l o d i n ：凝胶色谱理论。 Stahl：薄层色谱。再加上1943年发明的离子交换色谱，使色谱学这 门科学开始成为一门独立的学科。