基因工程常见问题梳理

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1、什么是星星活性，产生的原因及解决方案？

星星活性是指在极端非标准条件下，限制性内切酶能切割与识别序列相似的序列，而造成误切的现象。

产生的原因：

1) 甘油浓度过高，大于5%；

2) 酶过量，>100U/ul；

3) Mg2+被其他的二价金属离子取代；

4) pH过高，>8.0；

5) 添加了有机溶剂DMSO、乙醇等；

6) 离子强度低，<25mmol/l。

2、限制性内切酶的发现、分类和各类的特点：

限制性内切酶的发现是20世纪60年代，噬菌体侵染大肠杆菌之后，DNA在感染宿主中会被降解，从而提出了限制酶切和限制酶的概念。1970年，H.Smith偶然发现了HindIII，揭开了限制酶的面纱。

主要分为三类：

I类、III类：限制作用需要ATP

II类：最常使用的一类限制酶，识别序列主要有4-6个核苷酸，回文结构，与甲基化的反应分开，限制作用不需要ATP。

3、不同条件的两种限制性内切酶，双酶切时应该采取什么措施？

1) 同步双酶切：配置同时适合这两种限制酶的最佳缓冲体系，同时加入两种酶；

2) 分步酶切：分开加酶时遵循先低盐后高盐原则，而且可以在加入第二种酶的时

候使第一种酶失活，避免产生星星活性。

3) 使用配有特殊缓冲液的酶进行酶切：在大多数情况下采用标准缓冲液的酶也能

在这些特殊缓冲液中进行酶切，这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工

作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切时，反应速度会减慢，因此需要增

加酶量，延长反应时间。

4、差异杂交的基本原理和思路

差异杂交要拥有两种不同的细胞群体：在一个细胞群体中的目的基因正常表达，在另一个细胞群体中的目的基因不表达。在这种情况下便可制备两种不同的mRNA提取物。其一是含有目的基因的mRNA的总mRNA，另外一种是不含有目的基因mRNA的总mRNA。因此，可以通过这两种mRNA的cDNA拷贝为探针，对由表达目的基因的细胞总mRNA 构建的克隆库进行筛选。

思路：

将来自一种细胞的mRNA反转录形成cDNA的第一链，用这种细胞的cDNA与另一种细胞过量表达的mRNA进行杂交。如果在第一种细胞中是特异表达的mRNA，则会产生特

异的cDNA链，不会与第二种细胞的mRNA杂交。通过羟基磷灰石柱层析，洗脱未形成杂交体的cDNA，它代表第一种细胞中特异表达的基因。以该链为探针，第一种细胞的cDNA文库的重复拷贝杂交，跟探针能够杂交克隆的是在组织细胞中特异表达的mRNA。再对这样的克隆进行测序比较，鉴定，就分离得到这种组织特异表达的基因，所有包含重组体的菌落，阳性反应在X射线上呈现黑色的点。比较这两种底片对照原平板。便可以挑选所有含有

目的基因的菌落，供进一步研究使用。