临床免疫学荧光免疫技术

第九章荧光免疫技术本章考点1.荧光的基本知识2.荧光抗体技术3.荧光免疫测定荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。

很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

Coons等于l941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。

这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescent antibody technique）。

由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。

近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。

第一节有关荧光的基本知识一、荧光现象一些化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。

荧光指的是当一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻发光，停止能量供给，发光瞬间即停止的一种发光。

荧光产生的原理：荧光物质的分子在特定条件下吸收激发光能量后，分子呈激发态而极不稳定，当其迅速回到基态时，以电磁辐射形式释放出所有的光能，这种幅射现象称为发光。

荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光。

而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。

可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。

由化学反应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。

荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。

二、荧光物质（一）荧光色素许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。

只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。

常用的荧光色素有：1.异硫氰酸荧光素（FITC）：为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。

分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。

其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感；②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。

2.四乙基罗丹明（RB200）：为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。

性质稳定，可长期保存。

最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。

2563.四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）：最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。

与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。

其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。

4.藻红蛋白（R-RE）：本品为无定形，褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。

最大吸引光波长为565nm，最大发射光波长为578nm，呈明亮的橙色荧光。

与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色的荧光抗体的双重染色。

（二）其他荧光物质1.酶作用后产生荧光的物质：某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。

例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷，受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。

其他如碱性磷酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。

2.镧系螯合物：某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。

Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。

三、荧光技术中有关的概念和参数发射光谱：指固定激发波长，在不同波长下所记录到的样品发射荧光的相对强度。

激发光谱：指固定检测发射波长，在不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。

荧光效率：荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。

荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。

荧光效率=发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度），发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。

各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。

选择激发光波长最接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波长在接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。

荧光寿命：指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰减到一定程度时所用的时间。

荧光的猝灭：指荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间照射后会发生减弱的现象。

这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。

一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。

因此荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。

第二节荧光抗体技术一、荧光抗体的制备（一）抗体的荧光素标记用于标记的抗体，要求是高特异性和高亲和力的。

所用抗血清中不应含有针对标本中正常组织的抗体。

一般需经纯化提取IgG后再作标记。

作为标记的荧光素应符合以下要求：①应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。

②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。

③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。

④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。

⑤标记方法简单、安全无毒。

⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。

常用的标记蛋白质的方法有搅拌法和透析法两种。

以FITC（异硫氰酸荧光素）标记为例，搅拌标记法为：先将待标记的蛋白质溶液用0.5ml／L pH9.0的碳酸盐缓冲液平衡，随后在磁力搅拌下逐滴加入FITC溶液，在室温持续搅拌4～6h后，离心，上清即为标记物。

此法适用于标记体积较大，蛋白含量较高的抗体溶液。

优点是标记时间短，荧光素用量少。

但本法的影响因素多，若操作不当会引起较强的非特异性荧光染色。

透析法适用于标记样品量少，蛋白含量低的抗体溶液。

此法标记比较均匀，非特异染色也较低。

方法为：先将待标记的蛋白质溶液装入透析袋中，置于含FITC （异硫氰酸荧光素）的0.01mol／L pH9.4碳酸盐缓冲液中反应过夜，以后再对PBS透析法去除游离色素。

低速离心，取上清。

标记完成后，还应对标记抗体进一步纯化以去除未结合的游离荧光素和过多结合荧光素的抗体。

纯化方法可采用透析法或层析分离法。

（二）荧光抗体的鉴定荧光抗体在使用前应加以鉴定。

鉴定指标记包括效价及荧光素与蛋白质的结合比率。

抗体效价可以用琼脂双扩散法进行滴定，效价大于1：16者较为理想。

荧光素与蛋白质结合比率（F／P）的测定和计算的基本方法是：将制备的荧光抗体稀释至A2801≈1.0，分别测读A280（蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰，按公式计算。

F／P值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。

一般用于固定标本的荧光抗体以F／P=1.5为宜，用于活细胞染色的以F／P=2.4为宜。

抗体工作浓度的确定方法类似ELISA间接法中酶标抗体的滴定。

将荧光抗体自1：4～1：256倍比稀释，对切片标本作荧光抗体染色。

以能清晰显示特异荧光、且非特异染色弱的最高稀释度为荧光抗体工作浓度。

荧光抗体的保存应注意防止抗体失活和防止荧光猝灭。

最好小量分装，-20℃冻存，这样就可放置3～4年。

在4℃中一般也可存放1～2年。

二、免疫荧光显微技术免疫荧光显微技术的基本原理是：使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。

（一）标本的制作荧光显微技术主要靠观察切片标本上荧光抗体的染色结果作为抗原的鉴定和定位。

因此标本制作的好坏直接影响到检测的结果。

在制作标本过程中应力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和封埋过程中不发生溶解和变性，也不扩散至邻近细胞或组织间隙中去。

标本切片要求尽量薄些，以利抗原抗体接触和镜检。

标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去，有传染性的标本要注意安全。

常见的临床标本主要有组织、细胞和细菌三大类。

按不同标本可制作涂片、印片或切片。

组织材料可制备成石蜡切片或冷冻切片。

石蜡切片因操作烦琐，结果不稳定，非特异反应强等已少应用。

组织标本也可制成印片，方法是用洗净的玻片轻压组织切面，使玻片粘上1～2层组织细胞。

细胞或细菌可制成涂片，涂片应薄而均匀。

涂片或印片制成后应迅速吹干、封装。

置-10℃保存或立即使用。

（二）荧光抗体染色于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体。

置湿盒内，在一定温度下温育一定时间，一般可用25℃～37℃，30min，不耐热抗原的检测则以4℃过夜为宜。

用PBS充分洗涤，干燥。

（三）荧光显微镜检查经荧光抗体染色的标本，需要在荧光显微镜下观察。

最好在染色当天即作镜检，以防荧光消退，影响结果。

荧光显微镜检查应在通风良好的暗室内进行。

首先要选择好光源或滤光片。

滤光片的正确选择是获得良好荧光观察效果的重要条件。

在光源前面的一组激发滤光片，其作用是提供合适的激发光。

激发滤光片有两种。

MG为紫外光滤片，只允许波长275～400nm的紫外光通过，最大透光度在365nm；BG为蓝紫外光滤片，只允许波长325～500nm的蓝外光通过，最大透光度为410nm。

靠近目镜的一组阻挡滤光片（又称吸收滤光片或抑制滤光片）的作用是滤除激发光，只允许荧光通过。

透光范围为410～650nm，代号有OG（橙黄色）和GG（淡绿黄色）两种。

观察FITC标记物可选用激发滤光片BG12，配以吸收滤光片OG4或GG9。

观察RB200标记物时，可选用BG12与OG5配合。

（四）实验的类型1.直接法：用特异荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合。

本法操作简便，特异性高，非特异荧光染色因素少；缺点是敏感度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。

说明：此辅导中图片均引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社，1995年9月第1版第4次印刷（版权归原作者，此处仅为授课之用，不作为出版物）2.间接法：可用于检测抗原和抗体。

本法有两种抗体相继作用，第一抗体为针对抗原的特异抗体，第二抗体（荧光抗体）为针对第一抗体的抗抗体。

本法灵敏度高，而且在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。

说明：此辅导中图片均引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社，1995年9月第1版第4次印刷（版权归原作者，此处仅为授课之用，不作为出版物）3.补体结合法：本法是在间接法的第一步抗原抗体反应时加入补体（多用豚鼠补体），再用荧光标记的抗补体抗体进行示踪。

本法敏感度高，且只需一种抗体。