PCR法筛选重组克隆
重组菌有效鉴定的方法 资料搜集解析
蓝白斑筛选：蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。
野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。
有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。
设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。
阳性克隆含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子。
TA载体TA载体是基因工程中用于转导目的基因的一种载体。
TA载体用于TA 克隆，有以下几个特点：（1）快速克隆基因。
仅需5 分钟反应的时间；（2）便于筛选重组子，高克隆效率。
提供氨苄青霉素和卡那霉素两种筛选标记。
当某个基因来源于含有氨苄青霉素基因质粒时，可以选择卡那霉素筛选标记；当某个基因来源于含有卡那霉素质粒时，可以选择氨苄青霉素筛选标记，降低了克隆背景，对照插入片段克隆效率达95％以上。
（3）容易判断载体中有无外源基因的插入。
包含lacZ 基因，在含有IPTG，X-gal 的平板培养基上，进行蓝白斑筛选，很容易判断载体中有无外源基因的插入。
常见问题分析（1）克隆效率低影响克隆效率有许多因素，如扩增目的基因所用引物，基因的结构，插入片段和载体的比例等。
如发现克隆效率低，尝试用下列方法提高克隆效率。
a. 纯化PCR 产物。
b. 如插入片段的浓度太低，增加插入片段的量（1～4 µl）。
c. 延长反应时间。
d. 重新设计引物，5′端包含“G”，以增加PCR 产物3′末端“A”的效率。
（2）PCR 鉴定重组子失败用PCR 方法鉴定重组子，没有得到目的扩增产物，又没有载体自连，说明PCR反应失败。
重新优化PCR 反应条件或提取质粒，以质粒作模板扩增或酶切鉴定包含重组子的克隆。
（3）重组克隆呈现淡蓝色.这是由于插入片段没有影响lacZ 基因读码框，这种情况下菌落呈现淡蓝色。
14 第十四讲(2) 重组子的筛选和鉴定
2 营养缺陷型检测法
如果目的基因产物能降解某些药物使菌 株呈现抗性标记，或者基因产物与某些药物 作用是显颜色反应，则可根据抗性或颜色直 接筛选含目的基因的克隆子。
亮氨酸(leu)为leu菌所必须 。 在不含leu的基本培养基中，只有重组子 表达的leu才能被leu缺陷菌所利用而能生 长，形成菌落。 因此，能生长的菌落是阳性的重组子克 隆，没有重组子的leu缺陷菌在不含leu的 培养基中不能生长，不能形成菌落。
催化4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸， 产生萦光物质4-甲基伞形花酮，以此筛选 含gus基因的转化子。 尤其是gus基因的3’端与其他结构基因连接 产生的嵌合基因仍能正常表达，产生的融 合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在 转化生物体中的定位分析。
Hale Waihona Puke 萤火虫萦光素酶基因（luc）
luc表达产物萤火虫萦光素酶（LUC）在 Mg2+的作用下，可以与萦光素和ATP底物发 生反应，形成与酶结合的腺苷酸萦光素酰 化复合物，经过氧化脱羧作用后，该复合 物转变成为处于激活状态的氧化萦光素， 可以用萦光测定仪快速灵敏地检测出产生 的萦光，是目前研究动植物转基因很好用 的一种报告基因。
3 依赖于重组子结构特征分析的筛选法
⑴ 快速裂解菌落鉴定分子大小 主要是根据有外源DNA片段插入载体后的 重组DNA与载体DNA之间的大小差异来鉴 定重组子。 分别提取不同转化子的DNA，经琼脂糖凝 胶电泳，在琼脂糖凝胶板上出现的DNA带 中，落后的带是重组DNA的带。 此方法只用于重组子的初步鉴定。
7 插入失活法
基本原理： 是将特定的DNA随机插入到重组DNA分子 中，获得一系列插入重组子，根据其突变 的类型鉴定失活的基因，进一步利用此插 入DNA作为标记物，对失活基因进行定位。
DNA重组技术(Recombinant DNA)实验原理、用品和步骤
DNA重组技术(Recombinant DNA)实验原理、用品和步骤【实验原理】1．DNA重组技术重组DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。
它包括以下几个步骤：1）重组DNA分子的构建：即将目的基因（DNA或cDNA片段）与载体DNA重组，应用TA 克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。
该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下，目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。
2）将重组DNA分子转化宿主细胞。
3）克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组DNA（TA克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落。
挑取菌落，置液体培养基中培养，得到大量含重组DNA的细菌。
4）收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子（质粒），并纯化，获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。
2．质粒DNA的小量制备常见的质粒DNA提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。
本实验采用的是碱裂解法，碱裂解法的原理：在PH 12.0~12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒（CC）DNA仍为自然状态。
将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。
大部分染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。
通过离心，将可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收质粒DNA。
3．质粒DNA的限制性内切核酸酶（限制酶）切分析限制酶存在于原核生物体内，根据其结构和功能特性分为：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。
克隆筛选技术的使用中常见问题
克隆筛选技术的使用中常见问题克隆筛选技术是分子生物学领域中常用的实验技术之一，它可以帮助研究人员选择特定DNA片段并扩增出来。
然而，在使用克隆筛选技术的过程中，常常会遇到一些问题和挑战。
本文将讨论一些克隆筛选技术的常见问题，并提供相应的解决方法。
一、低转化效率克隆筛选技术中，低转化效率是常见的问题之一。
转化是指将外源DNA引入到宿主细胞中的过程，而低转化效率会降低筛选到感兴趣的克隆的机会。
解决方法：1. 优化DNA质量：使用高质量、无降解、无重组和合成错误的DNA样品。
可以通过限制酶切、纯化和鉴定DNA来确保DNA质量。
2. 优化化学转化：调整化学转化的条件，如细胞密度、含钙离子浓度、转化时间和温度等。
同时，合理选择适用的化学转化试剂，如CaCl2 或PEG方法。
3. 使用电转化：电转化可以提高转化效率。
调整电转化的条件和参数，如电压、电容、脉冲数和电极间距等。
二、错误克隆的选择在克隆筛选的过程中，有时会选择错误的克隆。
这可能是因为使用的筛选方法不够精确或特异，或者因为实验操作中的一些技术问题导致克隆选择的错误。
解决方法：1. 优化筛选方法：选择合适的筛选方法，如DNA序列比对、限制酶切分析、PCR检测等。
结合不同的筛选方法，可以提高克隆的选择精度。
2. 设计合理的筛选引物：设计筛选引物时，应确保其特异性和灵敏度。
可以利用特异性引物来筛选特定片段，提高筛选的准确性。
3. 重复实验：进行多次重复实验，并剔除出现重复错误的情况。
通过重复实验可以排除实验误差和技术问题，提高克隆的选择准确性。
三、背景杂交背景杂交是克隆筛选过程中常见的问题，它会导致背景杂交信号过多，干扰到感兴趣的克隆的筛选。
解决方法：1. 设计合适的防背景杂交措施：在实验中采取一些预防措施，如增加DNA浓度、优化杂交温度和时间、添加DNA相互竞争物等，可以减少背景杂交的发生。
2. 使用高质量探针：合理选择和设计探针，确保其特异性和灵敏度。
pcr融合基因的方法
PCR融合基因的方法引言PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学领域中广泛应用的技术，它具有高度敏感性和特异性，并被用于许多实验室中的基因克隆和定量分析。
PCR融合基因技术是一种通过PCR反应将两个或多个不同的DNA片段融合成一个新的基因序列的方法。
本文将介绍PCR融合基因的方法及其在研究和应用中的意义。
PCR融合基因的方法PCR融合基因的方法主要分为两个步骤：设计引物和进行PCR反应。
设计引物在PCR融合基因的方法中，引物的设计非常关键。
引物应选择在目标序列的两个端部，以确保能够扩增目标序列的全部部分。
此外，引物的序列应该避免出现互相配对的碱基，以防止引物之间的互补物相互结合而不是与目标序列结合。
引物的长度一般在18到30个碱基对之间。
在设计引物时，可以借助计算机软件进行序列分析和模拟实验，以确保引物的质量和特异性。
进行PCR反应PCR反应是将引物与模板DNA一起加入PCR反应体系，通过循环进行一系列的温度变化，最终在产物中扩增目标序列。
PCR反应一般包括以下几个步骤：1.Denaturation（变性）：在高温下，模板DNA的双链结构被分离成两条单链。
2.Annealing（退火）：温度降低，引物与目标序列的互补碱基对结合。
3.Extension（延伸）：在适合DNA聚合酶活性的温度下，DNA聚合酶开始合成新的DNA链。
4.循环：重复上述步骤，以连续扩增目标序列。
PCR融合基因的应用PCR融合基因的方法在基因工程和分子生物学研究中具有广泛的应用。
基因克隆PCR融合基因技术可以用于构建重组蛋白、工程酶或其他基因组的目的。
通过PCR 融合基因的方法，研究人员可以将不同的基因片段拼接在一起，形成一个新的功能基因。
重组表达蛋白PCR融合基因技术还可以用于重组表达蛋白的研究。
研究人员可以使用PCR融合基因的方法将目标基因和表达载体连接在一起，然后将其转化到宿主细胞中，使宿主细胞表达目标蛋白。
物种鉴定PCR融合基因技术也被应用于物种鉴定中。
目的基因T载体克隆实验步骤
目的基因T载体克隆实验步骤pcr产物的t载体克隆一.重组质粒的构建：重组的dna分子就是在dna连接酶的促进作用下，存有mg切的载体分子与外源dna分子进行连接。
dna连接酶存有两种：t4噬菌体dna连接酶和大肠杆菌dna连接酶。
两种dna连接酶都存有将两个具有相同粘性末端的dna分子连在一起的功能，而且t4噬菌体dna连接酶除了一种大肠杆菌dna连接酶没的特性，即为能够并使两个平末端的双链dna分子连接起来。
但这种相连接的效率比粘性末端的相连接率为高，通常可以通过提升t4噬菌体dna 连接酶浓度或减少dna浓度去提升平末端的相连接效率。
t4噬菌体dna连接酶催化剂dna 连接反应分成3步：首先，t4dna连接酶与辅因子atp构成酶-atp复合物；然后，酶-atp 复合物再融合至具备5’磷酸基和3’羟基切口的dna上，并使dna腺苷化；最后产生一个代莱磷酸二酯键，把切口封出来。
连接反应通常将两个相同大小的片断相连。
很多dna聚合酶在进行pcr扩增时会在pcr产物双链dna每条链的3’端加上一个突出的碱基a。
pucm-t载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的t。
这样，pucm-t载体的两端就可以和pcr产物的两端进行正确的at配对，在连接酶的催化下，就可以把pcr产物连接到pucm-t载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有助于连接酶的活性。
但是在这个温度下黏末端的氢键融合就是不稳定的。
因此实行折衷的温度，即12-16℃，相连接12-16h（过夜），这样既可以最大限度地充分发挥连接酶的活性，又兼具至较长时间接合结构的平衡。
2、atp存有的相连接缓冲器系统中，将分别经酶二.感受态制备原理细菌在0ccacl2低渗溶液中胀变成球形，遗失部分膜蛋白，沦为难稀释外源dna的状态。
三.β-半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理lacz基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。
重组质粒的PCR实验
重组质粒的PCR实验李笃财 201200140048 生科一班一．实验目的1．学习利用PCR产物回收试剂盒回收PCR产物；2．掌握基因克隆的基本操作过程3．了解利用T载体进行PCR产物克隆的基本原理4．进一步巩固PCR扩增及电泳检测技术二．实验原理（一）重组质粒酶切鉴定将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。
（二）PCRPCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。
这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。
本次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。
1.聚合酶链式反应原理PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法。
反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。
置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。
由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。
PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。
16-重组体的筛选和鉴定
高度灵敏性 不影响碱基配对 不影响探针分子的主要理化特性 使用酶促方法时,不影响酶活性 检测方法的灵敏性和特异性高 化学稳定性高 操作的安全性
标记方法
内标记
切口平移法 随机引物法 单链DNA探针 cRNA探针标记
末端标记
切口平移法：dsDNA，掺入率高，最常用
37℃ 15min 限速步骤 37℃ 2～3h
含有完整标记基因的λ-载体进入受体细胞后， 建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；
当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活， λ-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。
①筛选植物细胞报告基因（reporter gene)：NPTⅡ, HPT, LUC 报告基因：是某种生物的特定基因，装配在载体上成为载体结 构的一部分，具有指示的功能；常与目的基因融合表达，以示 踪目的基因的表达和位置。
•以tk－为受体，载体中加入tk基因， •HAT选择培养基中tk+细胞成活，tk-细胞不能成活 •则阳性重组子可在HAT中成活。
1、快速裂解菌落直接电泳检测法
原理：有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分 子量大。
方法：从转化后的菌体克隆中分 离质粒，电泳、比较其分子量。
凝胶电泳分离：质粒DNA的电 泳迁移率与其相对分子质量大 小成反比。
4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷 类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。
抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。
77
重组质粒DNA携带抗药性基因，转化后受体菌在含有相应抗生 素的培养基上生长，而不含此载体DNA的受体菌不能存活。 88
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验三PCR法筛选重组克隆
【实验目的】
1.学习和了解常用重组克隆筛选方法的原理；
2.掌握PCR法快速筛选重组克隆的操作方法。
【实验原理】
重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。
不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。
从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。
常用的筛选方法有两类。
一类是针对遗传表型改变筛选法，以－半乳糖苷酶系统筛选法为代表。
另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交（见实验十一）等方法。
1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）
使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。
这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。
lacZ编码－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。
重组子由于外源片断的插入使肽基因失活不能形成互补作用，也就是说，宿主细胞表现为－半乳糖苷酶失活。
因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。
这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。
2．快速裂解菌落鉴定质粒大小
从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。
本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。
3．限制酶图谱鉴定
对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。
4．Southern 印迹杂交
为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。
5．PCR法
用PCR对重组子进行分析，不但可以迅速扩增插入片段，而且可以直接进行DNA 序列分析。
因为对于表达型重组子，其插入片断的序列的正确性是非常关键的。
PCR法既适用于筛选含特异目的基因的重组克隆，也适用于从文库中筛选含感兴趣的基因或未知的功能基因的重组克隆。
前者采用特异目的基因的引物，后者采用载体上的通用引物。
6．菌落（或噬菌斑）原位杂交
菌落或噬菌斑原位杂交技术是将转化菌DNA转移到硝酸纤维膜上，用放射性同位素或非放射性标记的特异DNA或RNA探针进行分子杂交，然后挑选阳性克隆。
这种方法能进行大规模操作，是筛选基因文库的首选方法。
本实验采用PCR法对重组子（pT-EF1，见实验）进行筛选。
使用引物为基因特异引物（见实验）。
【试剂与器材】
（一）试剂
1.LB液体培养基
2.30%（V/V）甘油：用水配制后，高压蒸汽灭菌。
3.PCR反应体系（TaKaRa公司）
（二）器材
PCR仪、水平电泳装置、电泳仪、水浴锅、恒温振荡器、台式高速离心机、微量移液器、凝胶成像系统等。
（三）菌株
大肠杆菌DH5α转化菌。
【操作方法】
1.从转化平板上挑取单菌落，每个单菌落分别接入两支装有1mL 培养基的EP管中（一支检测用，一支保种用），强烈震荡培养过夜。
2.将保种用菌液于超净台内加入等体积30%甘油，―20℃冰箱保存。
3.将检测用菌液室温10,000r/min，离心1min，收集菌体。
4.弃上清，加入200μL 无菌ddH2O中，充分涡旋，悬浮菌体。
5.将EP管置沸水中煮10min~15min，至出现白色絮状沉淀。
6.10,000r/min，室温离心1min。
7.吸取上清作为PCR检测的样品。
8.琼脂糖电泳检测PCR结果，对照marker估计外源片段的大小，选择出含合适大小DNA 片段的克隆，保存菌种（日后提纯质粒作测序用）。
【注意事项与提示】
1.在沸水中一定要煮至出现白色絮状沉淀，此时质粒释放于上清中。
2.用煮沸法作PCR反应模板，受质粒的浓度和纯度等未知条件限制，有时需要优化PCR条件。
3.本方法既适合筛选含特异目的基因的重组克隆，也适合于从文库中筛选含感兴趣的基因或未知的功能基因的重组克隆。
前者采用特异目的基因的引物，后者采用载体上的通用引物。
【实验安排】
第一天上午配试剂和培养基，下午从转化平板挑取单菌落接种；
第二天上午用煮沸法裂解细菌取上清作PCR反应。
下午琼脂糖电泳检测结果并保存阳性菌种。
【实验报告要求与思考题】
1．用PCR法快速筛选重组克隆，应注意哪些操作环节？
2．提交PCR法快筛选重组克隆的电泳图，并分析结果。
附录1：
本实验流程：
从转化平板挑取单菌落接种第一天下午
过夜培养
煮沸法裂解细菌，取上清作PCR反应第二天上午
琼脂糖电泳检测结果第二天下午
保存阳性菌种。