芜菁皱缩病毒P38蛋白的原核表达及抗血清的制备
Ｐｒ ｏ ｋａ ｒ ｙ ｏ ｔ ｉ ｃ ｅ ｘ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｐ３ ８ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｔｕ ｒ ｎｉ ｐ Ｃｒ ｉ ｎ ｋｌ ｅ Ｖｉ ｒ ｕ ｓ ａ ｎｄ ｐｒ ｅ ｐａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｉ ｔ ｓ ｐｏ ｌ ｙ ｃ ｌ ｏ ｎ ａ ｌ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙ
张 静 朱 峰 ，陈应 娟 ，邓 星 光 ，刘 健 ，林 宏 辉 ，席德 慧
，
（ 四川 Ｉ 大 学 生 命 科 学 学 院生 物 资 源 与 生 态 环 境 教 育 部 国家 重 点 实 验 室 ，成 都 ６ １ ０ ０ ６ ４ ）
摘 要 ： 从 感 染 芜菁 皱缩 病毒 （ ＴＣ Ｖ） 的 拟 南 芥 中提 取 总 Ｒ ＮＡ，通过 反 转 录 Ｐ Ｃ Ｒ（ ＲＴ — Ｐ Ｃ Ｒ）
Ｇ Ｃ ＴＴ ＧＣ ＡＡ 一 ３ （ 划 线部分 为 Ｓ ａ ｃ 工酶 切 位 点 ） ． 用下游 引 物 Ｒ将 植 物 总 Ｒ ＮＡ反 转 录 后 ，加 入 Ｆ ， Ｒ扩 增 目 的 片 段． Ｐ Ｃ Ｒ 条 件 为 ：９ ４ ℃ 预变 性 ５ ｍｉ ｎ ， ９ ４ ℃５ ０ ｓ ， ５ ２ ℃４ ５ ｓ ，７ ２ ℃ｌ ｍｉ ｎ ，３ ２ 个 循环 后 ，
点 ） ； Ｒ： ５ Ｃ ＧＡＧ Ｃ Ｔ Ｃ Ｃ ＴＡＡＡＴ ＴＣ Ｔ ＧＡＧＴ —
Ｔ Ｃ Ｖ的 Ｐ ３ ８可 特异 性地 抑 制 Ｄ Ｃ Ｌ ４的活性 ＿ ７ ］ ．但
后来 的研 究表 明 ，在拟 南 芥 中 ，Ｐ ３ ８ 作 用 于 ＤＣ Ｌ ４ 的 表 象 只 是 其 抑 制 ＡＧＯ１蛋 白的 一 个 间 接 性 结 果 ．Ｐ ３ ８的 ＧＷ 基 序可直 接 与 ＡＧＯ１ 特 异性 结合 ，
扩 增得 到 ＴＣ Ｖ 的 外 壳蛋 白基 因 Ｐ３ ８ ．在 目的 基 因 Ｏ ＲＦ框 两 边 引入 酶 切 位 点 Ｂ ａ ｎＨ Ｉ和 ｒ
Ｓ ａ ｃ Ｉ ，并 连 接 到 表 达 我 体 ｐ Ｅ Ｔ ３ ０ 一 ａ上 ，导 入 大 肠 杆 菌 Ｂ Ｌ ２ １ （ Ｄ Ｅ ３ ） 中 ，３ ７℃ 经 ０ ． ５ ｍＭ ／ Ｌ Ｉ Ｐ ＴＧ 诱 导 ６ ｈ后 获 得 了 分 子 量 约 为 ４ ８ ｋ Ｄ 的 融 合 蛋 白 ．经 Ｎｉ — Ｎ ＴＡ 纯 化 目 的 蛋 白 ，注 射 大
Ｔａ ｋ ａ ｒ ａ 公 司 ，表 达 载 体 ｐ Ｅ Ｔ ３ ０ 一 ａ由 本 实 验 室 保
存．
２． ３ ＲＴ— ＰＣＲ
ｄ ｅ ｄ Ｒ ＮＡ） 大 小 的方 式 与 ｄ ｓ Ｒ ＮＡ结 合 ，从 而 阻碍
ｄ ｓ Ｒ ＮＡ 被 剪 切 成 ｓ ｉ Ｒ ＮＡ （ ｓ ｍａ ｌ ｌ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｆ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ
０ ． ５ ｒ ｎ Ｍ／ Ｌ Ｉ Ｐ ＴＧ ａ ｔ ３ ７℃ ｆ ｏ ｒ ６ ｈ ．Ｔｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｅ ｄ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｗａ ｓ ｐ ｕ ｒ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ ｂ ｙ Ｎｉ — ＮＴＡ ａ ｎ ｄ ａ ｎ ｔ ｉ — Ｐ ３ ８ ｐ ｏ ｌ ｙ ｃ ｌ ｏ ｎ ａ ｌ
参 与［ ２ 。 ］ ．Ｐ ３ ８也 是 Ｔｃ Ｖ 的沉 默 抑 制 子 ］ ，可 通 过作 用 于 基 因 沉 默 （ ＲＮＡ ｓ ｉ ｌ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｇ ） 过 程 中 的
Ｒ ＮＡ 或者 蛋 白因子抑 制宿 主 的基 因沉 默 ．在 拟 南 芥中， Ｐ ３ ８能 以一种 独 立于 ｄ ｓ Ｒ ＮＡ（ ｄ ｏ ｕ ｂ ｌ ｅ ｓ ｔ ｒ ａ ｎ —
ｔ ｅ ｃ ｔ ｔ ｈｅ ｅ ｘ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏｆ Ｐ３ ８ ｉ ｎ ｉ ｎｆ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ Ａｒ ａｂ ｉ ｄｏ ｐｓ ｉ ｓ ｔ ｈ ａｌ ｉ ａｎ ａ．
Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄｓ ：ＴＣＶ ；Ｃｏ ａ ｔ ｐｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ；Ｐｒ ｏ ｋａ ｒ ｙ ｏ ｔ ｉ ｃ ｅ ｘ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏｎ；Ｐｒ ｅ ｐａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏｎ ｏ ｆ ａ ｎｔ ｉ ｓ ｅ ｒ ｕｍ
Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｌｉ ｆ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ，Ｓ ｉ ｃ ｈ ｕ ａ ｎ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｃｈ ｅ ｎ ｇ ｄ ｕ ６ １ ０ ０ ６ ４，Ｃｈ ｉ ｎ ａ ）
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｔｈ ｅ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｏ ｔ ｉ ｄ ｅ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ａ ｔ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ（ Ｐ ３ ８ ）ｇ ｅ ｎ ｅ ｏ ｆ Ｔｕ ｒ ｎ ｉ ｐ ｃ ｒ ｉ ｎ ｋ ｌ ｅ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｗａ ｓ ｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎ ｅ ｄ
Ｉ ａ ｎ ｄ Ｓ ａ ｃ １ ｗｅ ｒ ｅ ｉ ｎ ｔ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ＯＲＦ ｆ ｒ ａ ｇ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｐ３ ８ ． Ｔｈ ｅ ｎ ｔ ｈ ｅ ｆ ｒ ａ ｇ ｍｅ ｎ ｔ ｗａ ｓ ｌ ｉ ｎ ｋ ｅ ｄ ｔ ｏ ｇ ｅ ｔ ｈ ｅ ｒ ｗｉ ｔ ｈ
（ ３ １ １ ７ １ ８ ３ ５ ， ３ １ ２ ７ ０ ２ ９ ０ ） ；四川省 应 用 基 础项 目（ ２ ０ １ ２ Ｊ Ｙ０ ０ ７ ８ ） ；中央 高校 基 本 科研 业 务 费 （ ２ ０ １ １ Ｓ Ｃ Ｕ０ ４ Ｂ ３ ４ ）
作者简介 ： 张静（ １ ９ ８ ７ 一） ， 女 ，￣ ｌ Ｊ ｌ ｌ 遂 宁 人 ，硕 士 研 究 生 ， 主 要 从 事 植 物 病 毒 学 研 究 ．Ｅ — ｍａ ｉ ｌ ： ２ ９ １ ０ ２ ８ ３ ９ ８ ＠ｑ ｑ ． ｃ ｏ ｎ ｒ
对 感染 ＴＣ Ｖ 的拟 南芥 提 取 总 ＲＮＡ．Ｐ Ｃ Ｒ 引
物由 Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ公 司合 成 ，上 游 引 物 Ｆ和 下 游 引 物 Ｒ 分别 引入 酶切 位 点 Ｂ ａ ｎＨ 工， ｒ Ｓ ａ ｃ Ｉ，引 物
序 列 为 Ｆ： ５ ｒ ＿ Ｃ ＧＧＧ ＡＴＣ Ｃ Ａ ＴＧＧ ＡＡＡＡＴＧＡＴ Ｃ －
ＺＨ ＡＮ Ｇ Ｊ ｉ ｎ ｇ ，ＺＨ Ｕ Ｆｅ ｎ ｇ ，ＣＨ ＥＮ ｇ ｉ ｎ ｇ — Ｊ ｕ ａ ｎ，Ｄ ＥＮ Ｇ Ｘｉ ｎ ｇ ～ Ｇｕ ａ ｎ ｇ， ＬＩ Ｕ Ｊｉ ａ ｎ，ＬＩ Ｎ Ｈｏ ｎ ｇ — Ｈｕ ｉ ，Ｘ Ｉ Ｄｅ － Ｈｕ ｉ
（ Ｋｅ ｙ Ｌａｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏｒ ｙ ｏｆ Ｂｉ ｏ — ｒ ｅ ｓ ｏｕ ｒ ｃ ｅ ｓ ａ ｎｄ Ｅｃ ｏ — ｅ ｎ ｖｉ ｒ ｏｎｍ ｅ ｎｔ ｏｆ Ｍｉ ｎｉ ｓ ｔ ｒ ｙ ｏ ｆ Ｅｄｕｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ，
１ 引
芜菁 皱缩 病毒 （ Ｔ ｕ ｒ ｎ ｉ ｐ Ｃ ｒ ｉ ｎ ｋ ｌ ｅ Ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ，ＴＣ Ｖ） 属 于番 茄 丛矮 病毒 科 （ Ｔ ｏ ｍｂ ｕ ｓ ｖ ｉ ｒ ｉ ｄ ａ ｅ ） 香石 竹 斑驳
轻 微 扭 曲 ，有 时 出 现 更 严 重 的植 株 畸 形 或 丛 矮 ．
白兔制 备抗 血 清．Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 结果表 明制备好 的抗血 清 能成功检 测感 染 ＴＣ Ｖ 的拟 南芥．
关 键词 ：芜菁 皱 缩病毒 ；外 壳蛋 白 ；原核表 达 ； 抗 血 清制备
中图分 类号 ： Ｑ ７ ８ 文 献标 识码 ： Ａ 文章 编 号 ： ０ ４ ９ ０ — ６ ７ ５ ６ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ２ — ０ ４ ４ １ — ０ ５
Ｐ ＥＴ３ ０ 一 ａ ａ ｎ ｄ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ Ｅ． ｃ ｏ ｌ ｉ ＢＬ２ １ （ ＤＥ ３ ） ． Ｔｈ ｅ ｔ ａ ｒ ｇ ｅ ｔ ｆ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ（ ４ ８ ｋ Ｄ） ｗａ ｓ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ ｂ ｖ
或者 在本 生烟 中的 细胞 间运 动都 需 要 Ｐ ３ ８蛋 白 的
为分析 纯．
２ ． ２ 菌 株 和载体
克 隆载 体 ｐ ＭＤ １ ９ 一 Ｔ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ，克 隆菌 株 大 肠 杆
菌 ＤＨ５ ａ ，表达 菌株 大 肠 杆 菌 Ｂ Ｌ ２ １ （ Ｄ Ｅ ３ ） 均购 自
Ｒ ＮＡ） ， 干 扰宿 主基 因沉 默ｌ ５ ］ ， Ｐ ３ ８还 能 抑 制初 级
ｓ ｉ Ｒ ＮＡ 的活 性 ，并 且 这 种抑 制 需 要一 种 乙烯 诱 导 的转 录 因 子 Ｒ ＡＶ２的 协 助 ］ ． 以前 有 研 究 显 示
Ｃ ＴＡＧＡＧ ＴＣ 一 ３ （ 划线部分为 Ｂ ａ ｍＨ 工酶 切 位
ｕｓ ｉ ｎｇ ＲＴ— ＰＣＲ ｆ ｒ ｏｍ Ａｒ ａｂ ｉ ｄｏ ｐｓ ｉ ｓ ｔ ｈａｌ ｉ ａｎ ａ ｉ ｎｆ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ ＴＣＶ． Ｒｅ ｓ ｔ ｒ ｉ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅ ｃ ｕｔ ｔ ｉ ｎｇ ｓ ｉ ｔ ｅ ｓ ｏ ｆ Ｂａｍ Ｈ
通讯作者 ： 席 德 慧 ．Ｅ － ｍａ ｉ ｌ ：ｘ ｉ ｄ ｈ ＠￥ Ｃ Ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ
４ ４ ２
四 川 大 学 学报 （ 自然 科 学版 ）
第 ５ ２卷
将其基 因组 包裹 于 内形 成直 径 为 ３ ０ ｎ ｍ的 １ ２面体 的病毒 粒子 口 ；Ｔ Ｃ Ｖ 在很 多宿 主 中 的系统 性 移 动
第 ５ ２卷 第 ２期
Ｖｏ １ ． ５ ２ ＮＯ ． ２
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． ０ ４ ９ ０ — ６ ７ ５ ６ ． ２ ０ １ ５ ． ０ ２ ． ０ ３ ９
芜菁 皱 缩 病 毒 Ｐ ３ ８蛋 白的原 核 表 达 及 抗 血 清 的制 备
２ ０ １ ５年 ３ 月
四 川 大 学 学报 （ 自然科 学 版 ）
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ １ ｏ ｆ Ｓ ｉ ｃ ｈ ｕ ａ ｎ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ（ Ｎａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｅｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ）
鲤春病毒血症病毒基质蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制备
且 ｅ ｌ ｕ ｒｓ ｎ ｅ ｔ ｎ．ｐ ｒｆ ａ ｏ ｆｉ ｃ ｕ ｉｎ ｂ ｄ ｅ ｎ — Ｔ Ｈｉ・ ｉｄ Ｒ ｓｎ ｐ ｒ ｃ ｔ ｎ ｏｉ ｈ ａ ｏ ａ ｏ ｉ ｉ ｕ ｉ ｃ ｔ ｎ ｏ ｌｓｏ ｏ ｉ ｓａ ｄ ＮｉＮ Ａ ｓｂ ｎ ｅ ｉ ｕ ｉ ａ ｏ ．Ｐ ｒ ｅ ｐ ｏｅ ｎ ｗａ ｅ ｍ－ ｉ ｉ ｎ ｉ ｆ ｉ ｕ ｉ ｄ Ｍ ｒｔｉ ｓ ｕ ｄ ｔ ｉ ｉ ｆ ｓ ｏ
福 建 福 州 ３００ ； ． ５０３ ３ 深圳 出入境检 验检疫局动植物检验检 疫技术 中心 ， 东 深圳 ５８０ ） 广 １０１
摘要 ： 根据鲤春病毒血症病毒 （ Ｖ Ｖ） 因组序列 （ ｅＢ ｎ ： Ｃ ０ ２０ ） 人工合成 Ｍ 基因开放 阅读 框序列 ， ＳＣ 基 Ｇ ｎ ａｋ Ｎ ＿０ ８ ３ ， 克隆至原 核
ｓｒ ｔ ｎ ｄ ｇ ｓ ｏ ｄ ｓ ｑ ｅ ｃ ｅｉ ｃ ｔ ｎ，ｔ ｅｆａ ｍｅ ｔｏ ｐ ｏｔ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｖ ｃｏ Ｅ ｔ ｃｉ ｉ ｅ ｔ ｎ ａ ｅ ｉ ｏ ｉ ｎ ｕ ｎ ｅ ｖ ｒ ｉ ａ ｏ ｈ ｒ ｇ ｎ ｆＭ ｒ ｔｉ ｅ ｅ ｗ ｓｃ ｏ ｅ ｎ ｏ ｔ ｒ ｋ ｒ ｏｉ ｅ ｐ ｓ ｅ ｔ ｒｐ Ｔ－ ｆ ｉ ｈ ｃ ｅ ｏ
Ａ ａｅ ｙｏ ｇｉｕ ｕａ Ｓｉｎｅ，Ｆｚ ｏ ， ｕｉ ５０ ３ ｈｎ ； ． ｅａｔ ｎ ｆ ｕ ｅｖ ｉｎｏ ｎｍ ｎ ｌ ｔ ｃｄｍ ｆ ｒ ｌ ｒ ｅｃｓ ｕｈｕ Ｆ ｊ ｎ３ ０ ０ ，Ｃ ｉａ ３ Ｄ ｐｒ Ａ ｃｔ ｌ ｃ ａ ｍｅｔ ｐ ｒｉｏ ｎＡ ｉ ａ ａｄＰａ ｏＳ ｓ ｌ ｎ
肿瘤型丙酮酸激酶的原核表达及单克隆抗体的制备
Ｍ２ ． Ｐ Ｋ．Ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｒ ＮＡ ｗａ ｓ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ ｈ ｕ ｍａ ｎ ｏ ｖ ａ ｒ ｉ ａ ｎ ｃ ａ ｒ ｃ ｉ ｎ ｏ ｍａ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ（ Ｓ ＫＯ Ｖ３）
ａ ｎ ｄ ｒ ｅ ｖ ｅ ｒ ｓ ｅ ｔ ｒ ａ ｎｓ ｃ ｒ ｉ ｂ ｅ ｄ ｂ ｙ Ｐ ＣＲ ａ ｍｐ ｌ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ．ＴＵ Ｍ２一 ＰＫ ｇ ｅ ｎ ｅ ｗａ ｓ ｉ ｎ ｓ ｅ ｒ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｓ ｐ ＥＴ一 ３ ２ ａ ｏ ｆ Ｈｉ ｓ ｔ ａ ｇ ａ ｎ ｄ ＰＧＥＸ－ ４ Ｔ一 １ ｏ ｆ ＧＳ Ｔ Ｔａ ｇ．ａ ｎ ｄ ｃ ｌ ｏ ｎ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ＤＨ５ ｏ Ｌ ．Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂｉ ｎａ ｎ ｔｔ ｉ ｃ ｅ ｘ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｔ ｕｍ ｏ ｒ ｔ ｙ ｐ ｅ Ｍ ２－ ｐｙ ｒ ｕｖ ａ ｔ ｅ ｋｉ ｎａ ｓ ｅ ａ ｎ ｄ ｐ ｒ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｉ ｔ ｓ ｍｏ ｎｏ ｃ ｌ ｏ ｎａ ｌ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄｙ
ＺＨＡＮＧ Ｔｉ ａ ｎ — ｚ ｈｕ，ＬＩ Ｓ ｈ ｕ— ｚ ｈ ｅ ｎ，Ｌ Ｉ Ｍｅ ｉ ，ＹＵ Ｈｕ ａ — ｓ ｈ ｉ ，Ｓ ＵＮ Ｘｉ ａ ｏ — ｌ ｉ ｎ，Ｔ ＡＮＧ Ｘｉ ａ ｏ — ｂ ｏ
纳豆激酶原核表达纯化及多克隆抗体的制备
纳豆激酶原核表达纯化及多克隆抗体的制备朱立成;张耀洲【期刊名称】《浙江大学学报（理学版）》【年(卷),期】2006(033)004【摘要】纳豆激酶是一种源于日本传统食品纳豆且具有强烈溶栓作用的丝氨酸蛋白酶.本研究将编码信号肽、前导肽和成熟肽在内的纳豆激酶基因克隆到原核表达载体pET28a+中,获得重组表达质粒pETNK.将此重组表达载体质粒转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达.SDS-PAGE结果显示纳豆激酶在大肠杆菌中成功表达,表达的纳豆激酶融合蛋白分子量大约为31kD.亲和层析法纯化表达产物,并以此纯化产物作为免疫原免疫新西兰大白兔,制备兔抗纳豆激酶血清,用ELISA和Western blotting对制备的兔抗血清中的多克隆抗体进行了鉴定.纤维蛋白平板实验显示,表达的纳豆激酶融合蛋白具有较好的溶纤活性.【总页数】4页(P447-450)【作者】朱立成;张耀洲【作者单位】浙江大学,生命科学学院,浙江,杭州,310029;浙江理工大学,生命科学学院,浙江,杭州,310018【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.卵形鲳鲹TNFSF6的原核表达、纯化与多克隆抗体的制备 [J], 王鹭;李海平;周永灿;孙云;曹贞洁2.双孢蘑菇中精氨酸酶的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 [J], 奚志嫒;杨可心;孟德梅3.牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白原核表达纯化及多克隆抗体的制备 [J], 周子恒;张哲;肖盛中;蔡卓轩;李岩;张彦红;杨艳;陈创夫;盛金良4.Cpf1核酸酶的原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定 [J], 董彬;王君;孙静;王报贵;孙春龙;吴涛5.绵羊FHL2蛋白原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体的制备 [J], 聂晓宁;李闰婷;陈龙欣;李玉华;聂文营;张丽萌;王林青因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪丁型冠状病毒S_基因的原核表达及多克隆抗体的制备
广 西 农 学 报Journal of Guangxi Agriculture 第38卷 第5期Vol.38，No.5312023年10月October，2023动物科学收稿日期：2023-07-26 修回日期：2023-07-29基金项目：广西重点研发计划项目（桂科AB23026082）；广西自然科学基金项目（2021GXNSFAA196067）；广西大学巴马产教融合研究院专项项目（巴人科20220015）；大学生创新创业项目（202210593121）；广西百人计划项目。
第一作者简介：张政（2002—），男，本科，研究方向为动物医学。
共同第一作者：秦秋英（1998—），女，硕士研究生，研究方向为预防兽医。
*通讯作者：欧阳康(1985—)，男，博士，中美联合培养博士后，副教授，主要从事预防兽医方向研究工作。
猪丁型冠状病毒S 基因的原核表达及多克隆抗体的制备张政1Δ 秦秋英1Δ 洪大林1 覃先锦1 樊柳忻1刘科勉1 陈樱1，2，3 韦祖樟1，2，3 黄伟坚1，2，3 欧阳康1，2，3*（1.广西大学动物科学技术学院 广西高校动物疫病预防与控制重点实验室，广西 南宁 530005；2.广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心，广西 南宁 530005；3.广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室，广西 南宁 530005）摘要：纤突（Spike ， S ）蛋白是猪丁型冠状病毒（Porcine deltacoronavirus ， PDCoV ）诱导机体产生抗体的主要抗原，为制备其重组蛋白和多克隆抗体，本实验对分离株CHN/20GXNN-1/2020的S 基因进行序列分析，选择抗原指数较高的b 区S1b ，克隆至表达载体pET-32a 进行原核表达，重组蛋白S1b 主要以包涵体形式表达，大小约为34.1 kDa 。
利用Ni-NTA 琼脂糖树脂纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体。
通过间接ELISA 测定多克隆抗体的效价高于1∶128 000，Western blot 和IFA 均证明其可以与病毒S 蛋白特异性结合。
小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备鲍俊峰;王胜军;马洁;崔大伟;杨先知;毛朝明;仝佳;邵启祥;许化溪【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2008(018)004【摘要】目的:体外原核表达小鼠Foxp3蛋白,并以其免疫家兔,制备多克隆抗体.方法:从质粒Foxp3-pMD-18T扩增小鼠Foxp3 全长基因,亚克隆至原核表达载体pET-32a,转化E.coli BL-21;IPTG诱导表达目的蛋白,Ni2+-NTA柱纯化及蛋白质印迹鉴定蛋白;纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,ELISA法检测抗体效价,蛋白质印迹检测抗体特异性.结果:成功构建了Foxp3-pET-32a原核表达载体,表达和纯化了目的蛋白;ELISA法检测抗体效价为1∶ 20 000,蛋白质印迹检测结果显示抗体特异性与小鼠Foxp3蛋白结合.结论:成功表达小鼠Foxp3蛋白并制备了多克隆抗体.【总页数】4页(P310-313)【作者】鲍俊峰;王胜军;马洁;崔大伟;杨先知;毛朝明;仝佳;邵启祥;许化溪【作者单位】江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013;无锡市妇幼保健院,江苏,无锡,214001;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏,镇江,212013【正文语种】中文【中图分类】R392.1【相关文献】1.黄瓜S期激酶相关蛋白Skp1的原核表达及其多克隆抗体的制备 [J], 孙新艳;魏莹;韩晓玉;王振跃;陈琳琳;燕照玲;施艳2.小鼠骨形成蛋白BMP3的原核表达及多克隆抗体制备与鉴定 [J], 刘祥3.小鼠Foxp3融合蛋白的原核表达及纯化 [J], 胡水清;危华峰;张大鹏;史菊鲜;樊克兴;王皓;戴建新;郭亚军;张雁云4.小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的原核表达及多克隆抗体制备 [J], 展德文;张玉静;刘昌;袁盛凌;刘纯杰;张兆山5.小鼠骨桥蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定 [J], 刘祥;陈春琳;王杨科;俱雄;吴三桥;张涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
免疫电镜技术在植物病毒研究中的应用
免疫电镜技术在植物病毒研究中的应用李文财;周常勇【摘要】免疫电镜技术通过将免疫学与超微结构形态学相结合,利用抗原-抗体的专化性反应对抗原或抗体进行精确定位.介绍免疫电镜技术的原理、发展阶段及其在植物病毒研究中的应用.【期刊名称】《南方农业》【年(卷),期】2011(005)003【总页数】3页(P84-86)【关键词】免疫电镜技术;病原检测;病毒定位【作者】李文财;周常勇【作者单位】西南大学植物保护学院,重庆,400716;西南大学植物保护学院,重庆,400716;中国农业科学院柑橘研究所,重庆,400716【正文语种】中文【中图分类】S432.41免疫电镜技术（Immune electron microscopy，IEM）又称为免疫细胞化学技术（Immunocytochemistry），出现于20世纪50年代。
Singer（1959）首次将铁蛋白作为标记物，用于透射电镜观察取得了成功。
随后，Nakane和Pierce(1966)成功使用辣根过氧化酶（HRP）标记抗体来显示抗原—抗体反应部位。
随着电镜技术的不断发展和完善，免疫电镜技术已被广泛应用于病害诊断、病原鉴定和机理研究等许多领域。
本文主要就免疫电镜技术的原理、发展阶段及其在植物病毒研究中的应用等进行概述。
1 免疫电镜技术的原理与分类1.1 原理利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合形成具有一定的电子密度的复合物，其能在电镜下观测出相应抗原所在部位。
1.2 发展阶段免疫电镜技术的发展经历了3个阶段：铁蛋白标记免疫电镜技术、酶免疫电镜技术和胶体金免疫电镜定位技术。
（1）铁蛋白标记免疫电镜技术。
铁蛋白是一种含铁量约23%，直径为12～14 nm，大小约750 kDa的球形蛋白，其核心是由4个铁亚基组成的高电子密度氢氧化铁胶态分子团，外层由24个蛋白质亚单位组成近似球形的外壳[1～2]。
铁蛋白通过双功能交联剂与抗体、葡萄球菌A蛋白（SPA）等共价结合，具有分辩率高、散射能力强、可对抗原抗体复合物定位进行准确描述等特点[3]。
肠道病毒71型重组VPl蛋白的原核表达及初步鉴定
抗体 （ 国 Ｓｇ ， ： ０ ） ３ 美 ｉｍａ １ ２０ ０ ，７Ｃ孵 育 ｌ ， Ｂ Ｔ洗 ５ ｈＰ Ｓ 次后 用显 色液显 色 ，Ｍ Ｏ 终止 反 应 ， ２ Ｈ Ｓ 酶标 仪 检 测 吸光度 Ａ值 。 １ ６ ２ Ｗｅｔｒ ｌｔ 定 ： 纯 化 的 蛋 白经 Ｓ Ｓ ． ． ｓｅｎ Ｂ ｏ 鉴 将 Ｄ — Ｐ ＡＧＥ电泳后 ， 移 至 硝 酸纤 维 素膜 上 。 用 ３ 脱脂 转 ％ 奶 室温封 闭 １ ， 入病人 血清 （ ：０ ） 温轻柔 振荡 １ ｈ加 １５０ 室
１ 江 苏省 疾病预 防控 制 中心 ， ． 南京 ２ ０ ０ ；． １ ０ ９ ２ 南京 医科 大 学公 共卫 生 学院 ， 南京 ２ ０ ２ ； １０ ９ ３ 南京农业 大 学兽 医学 院， ． 南京 ２ ０ ９ １０ ５
摘 要： 目的 利 用 大 肠 杆 菌原 核表 达 系 统 表 达 并 纯 化 肠 道 病 毒 ７ ｌ型 （ Ｖ７ ） １蛋 白 ， 对 重 组 蛋 白 功 能 进 行 初 步 鉴 Ｅ １ ＶＰ 并
ｈ Ｐ Ｓ洗 ３次 每 次 洗 １ ｎ ，Ｂ ０ ｍｉ。加 入 ＨＲＰ标 记 抗 人
ＩＧ 全 抗 （ ： ０ ） 温轻 柔振 荡 １ｈ后 ， Ｂ ｇ １ ２０ ０ 室 Ｐ Ｓ洗 ３次
后 Ｄ ＡＢ 显 色 。
上清 收 获 细 胞 待 用 。采 用 Ｇ ＡＧ Ｎ 公 司 的 Ｒ ａｙ Ｉ Ｅ Ｎｅｓ
ｐ ｅ ｓ ｄ ａｎ ｒ ｓ ｅ ｄ ｐｕｒｆｅ ． Ｔ ｈ ｅ ｏ ｂｉ ｎｔＶ Ｐ１ｃ ｎ ｂ ｏ ｄ ｂ ｉｉ ｄ ｅ ｒ ｃ ｍ ｎａ ａ ｅ ｆ ｕｎ ｙ ＥＶ ７１ ｐ ｉｉ ｅ ａ ｗ ｉｈ ｈｇｈ ａｆｉ ｔ ｎｄ ｓ ｅ ｉｉｉｙ ｉ ＳＡ ｎｄ ｏｓｔｖｅｓ ｒ ｔ ｉ ｆｎｉｙ ａ ｐ ｃｆｃｔ ｎ ＥＩＩ ａ
acrA和acrB基因的原核表达、抗体制备及初步应用
acrA 和acrB 基因的原核表达、抗体制备及初步应用1吕殿红1, 2，蒋红霞1，陈杖榴1 ，曾振灵11.华南农业大学兽医学院，广州 (510642)2.广东省农业科学院兽医研究所，广州 (510640)Email ：lvdianhong@摘 要：[目的]对大肠杆菌 AcrAB 外排泵系统 acrA 、acrB 基因进行原核表达，获得的表达产物AcrA 、AcrB 蛋白分别免疫兔，制备相应的抗体，建立ELISA 检测方法检测兽医临床分离的大肠杆菌外排泵表达水平。
[方法]扩增AcrAB 外排泵系统acrA 、acrB 基因片段，扩增片段分别与原核表达载体 pET-41a(+)连接构建重组质粒，于BL21（DE3）中进行诱导表达。
表达产物 AcrA 、AcrB 纯化后分别免疫新西兰大白兔，获得抗 AcrA 、AcrB 抗血清。
表达产物经Western blot 鉴定分析。
AcrA 、AcrB 蛋白分别按不同的浓度包被酶标板，与不同稀释倍数的抗血清反应，通过ELISA 检测确定最佳抗原包被浓度及抗体稀释度。
用建立的ELISA 检测方法，检测10株多重耐药大肠杆菌外排泵表达水平。
[结果]成功克隆和表达了 acrA 、acrB 基因片段，经 SDS-PAGE 检测表明两种表达产物 AcrA 、AcrB 均以可溶性蛋白形式存在。
AcrA 、AcrB 抗原蛋白最佳包被浓度分别为 1.0 µg·mL -1和0.5 µg·mL -1，抗 AcrA 、AcrB 血清的最佳稀释度分别为 1800∶和1400∶。
用初步建立的ELISA 方法检测10株大肠杆菌多重耐药菌株外排泵表达水平，结果表明分别用两种蛋白做包被抗原检测外排泵表达水平的结果一致，大部分菌株外排泵表达水平增高。
[结论]本研究通过原核表达的方法获得可溶性蛋白AcrA 、AcrB 并制备了相应的抗体，分别用两种蛋白做包被抗原建立的ELISA 检测方法检测外排泵表达水平，检测结果一致。
非洲猪瘟病毒p22蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(１０):１４０~１４５ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.１０.０１９收稿日期:２０２２－１２－２８基金项目:山东省重点研发计划项目(２０２０ＣＸＧＣ０１０８０１ꎬ２０２２ＴＺＸＤ００４１ꎬ２０２２ＣＸＰＴ０１０ꎬ２０２１ＬＺＧＣ００１)ꎻ山东省现代农业产业技术体系(ＳＤＡＩＴ－０８－０１)ꎻ山东省农业科学院农业科技创新工程项目(ＣＸＧＣ２０２３Ｆ１０ꎬＣＸＧＣ２０２３Ａ２１ꎬＣＸＧＣ２０２３Ａ２１)ꎬ泰山学者工程项目作者简介:矫健(１９９８ )ꎬ男ꎬ山东青岛人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事动物病毒学与免疫学研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:１１７４６２９５６１＠ｑｑ.ｃｏｍ李建达(１９９２ )ꎬ男ꎬ山东济南人ꎬ博士ꎬ主要从事动物微生物与免疫学研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｌｊｄ４４５３＠１６３.ｃｏｍ∗同为第一作者ꎮ通信作者:于江(１９８５ )ꎬ女ꎬ山东莱州人ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ研究方向为动物病原学与免疫学ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｙｕｊｉａｎｇ＿２２１３＠１６３.ｃｏｍ吴家强(１９７５ )ꎬ男ꎬ山东诸城人ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ研究方向为动物病原学与免疫学ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｗｕｊｉａｑｉａｎｇ２０００＠ｓｉｎａ.ｃｏｍ非洲猪瘟病毒ｐ２２蛋白单克隆抗体的制备及鉴定矫健１ꎬ２ꎬ李建达２∗ꎬ韩先杰１ꎬ张琳２ꎬ张玉玉２ꎬ任素芳２ꎬ刘飞２ꎬ陈智２ꎬＮａｔａｌｉｉａＨｒａｂｃｈｅｎｋｏ２ꎬ张文娟３ꎬ于江１ꎬ２ꎬ吴家强１ꎬ２(１.青岛农业大学动物医学院ꎬ山东青岛㊀２６６１０９ꎻ２.山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室/农业农村部畜禽生物组学重点实验室ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ３.山东碧蓝生物科技有限公司ꎬ山东泰安㊀２７１４００)㊀㊀摘要:非洲猪瘟(ＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒꎬＡＳＦ)是由非洲猪瘟病毒(ＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓꎬＡＳＦＶ)引起的一种高度传染性病毒性疾病ꎬ发病率和死亡率高达１００％ꎬ对我国的生猪养殖业造成了毁灭性打击ꎮｐ２２蛋白为ＡＳＦＶ的结构蛋白ꎬ本研究构建了重组原核表达质粒ｐＥＴ－３２ａ－ｐ２２ꎬ将其转化至大肠杆菌ＢＬ２１(ＤＥ３)感受态细胞表达重组ｐ２２蛋白并纯化ꎬ经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定证实重组ｐ２２蛋白与ＡＳＦＶ阳性血清有良好的免疫反应性ꎮ利用重组ｐ２２蛋白免疫Ｂａｌｂ/ｃ小鼠并通过间接ＥＬＩＳＡ方法筛选到２株能够稳定分泌ｐ２２蛋白单克隆抗体(ＭＡｂ)的杂交瘤细胞株２Ｄ６和５Ｅ７ꎮ经抗体亚型鉴定两株抗体均为ＩｇＧ１型ꎻ经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定ꎬ两株抗体能够特异性识别过表达的ｐ２２蛋白ꎮ综上ꎬ本研究成功表达并纯化了ｐ２２重组蛋白ꎬ制备了ｐ２２单克隆抗体ꎬ为进一步探讨ｐ２２蛋白的结构功能及其在ＡＳＦＶ中的感染致病机制提供了基础条件ꎮ关键词:非洲猪瘟病毒ꎻｐ２２蛋白ꎻ单克隆抗体ꎻ原核表达中图分类号:Ｓ８５２.６５＋１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)１０－０１４０－０６ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔｐ２２ＰｒｏｔｅｉｎｏｆＡｆｒｉｃａｎＳｗｉｎｅＦｅｖｅｒＶｉｒｕｓＪｉａｏＪｉａｎ１ꎬ２ꎬＬｉＪｉａｎｄａ２∗ꎬＨａｎＸｉａｎｊｉｅ１ꎬＺｈａｎｇＬｉｎ２ꎬＺｈａｎｇＹｕｙｕ２ꎬＲｅｎＳｕｆａｎｇ２ꎬＬｉｕＦｅｉ２ꎬＣｈｅｎＺｈｉ２ꎬＮａｔａｌｉｉａＨｒａｂｃｈｅｎｋｏ２ꎬＺｈａｎｇＷｅｎｊｕａｎ３ꎬＹｕＪｉａｎｇ１ꎬ２ꎬＷｕＪｉａｑｉａｎｇ１ꎬ２(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＱｉｎｇｄａｏＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＱｉｎｇｄａｏ２６６１０９ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＳｈａｎｄｏｎｇＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｉｍａｌＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＬｉｖｅｓｔｏｃｋａｎｄＰｏｕｌｔｒｙＭｕｌｔｉ￣ｏｍｉｃｓꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＳｈａｎｄｏｎｇＧｒｅｅｎＢｌｕｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｍｐａｎｙＬｉｍｉｔｅｄꎬＴａｉａｎ２７１４００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ(ＡＳＦ)ｉｓａｈｉｇｈｌｙｃｏｎｔａｇｉｏｕｓｖｉｒａｌｄｉｓｅａｓｅｃａｕｓｅｄｂｙＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ(ＡＳＦＶ)ｗｉｔｈｔｈｅｍｏｒｂｉｄｉｔｙａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙｕｐｔｏ１００％ꎬｗｈｉｃｈｈａｓｃａｕｓｅｄａｄｅｖａｓｔａｔｉｎｇｂｌｏｗｔｏＣｈｉｎａ ｓｐｉｇｆａｒｍｉｎｇｉｎｄｕｓｔｒｙ.Ｔｈｅｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎｉｓａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｏｆＡＳＦＶ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ￣３２ａ￣ｐ２２ｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１(ＤＥ３)ｒｅｃｅｐｔｉｖｅｃｅｌｌｓｔｏｅｘｐｒｅｓｓｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｐｕｒｉｆｙｉｔ.Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎｈａｄｇｏｏｄｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｗｉｔｈＡＳＦＶｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｒｕｍ.Ｂａｌｂ/ｃｍｉｃｅｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈｔｈｅｒｅ￣ｃｏｍｂｉｎａｎｔｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｔｗｏｈｙｂｒｉｄｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓ２Ｄ６ａｎｄ５Ｅ７ꎬｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｓｅｃｒｅｔｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ(ＭＡｂ)ｔｏｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎꎬｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡ.Ｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙｓｕｂｔｙｐｅｓｏｆｔｈｅｔｗｏｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉ￣ｆｉｅｄａｓＩｇＧ１ｔｙｐｅ.Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｗｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｃｏｕｌｄｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｒｅｃｏｇｎｉｚｅｔｈｅｏｖｅｒｅｘ￣ｐｒｅｓｓｅｄｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎ.Ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎꎬｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬａｎｄｔｈｅｐ２２ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄꎬｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｄｏｎｅｏｆｔｈｅｂａｓｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｆｕｒ￣ｔｈｅｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎꎬａｎｄａｌｓｏｉｔｓｒｏｌｅｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆＡＳＦＶｉｎ￣ｆｅｃｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓꎻｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎꎻＭｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙꎻＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ㊀㊀非洲猪瘟(ＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒꎬＡＳＦ)是由非洲猪瘟病毒(ＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓꎬＡＳＦＶ)引起的一种高度传染性㊁出血性疾病ꎬ临床上以高热㊁皮肤发绀㊁淋巴结及脏器广泛出血为主要特征ꎬ如肾瘀斑㊁皮肤红斑㊁肺水肿㊁弥散性血管内凝血等[１]ꎮＡＳＦＶ主要通过接触性传播ꎬ家猪和野猪都是其主要宿主ꎬ一旦侵入家猪ꎬ便可在猪群中快速传播ꎬ发病率和死亡率高达１００％[２－３]ꎬ感染性病毒在组织中能够存在较长时间ꎬ尤其是淋巴结和扁桃体[４]ꎮ此外ꎬ该病毒也是唯一已知的ＤＮＡ虫媒病毒ꎬ能够通过软蜱进行传播[５]ꎮＡＳＦ于１９２１年首次在肯尼亚报道ꎬ随后传入其他非洲国家[６]ꎮ２００７年ꎬ在格鲁吉亚发现了毒力更高的ＡＳＦＶⅡ型ꎬ并迅速传播[７]ꎮ２０１８年８月ꎬ我国沈阳首次暴发ＡＳＦꎬ随后迅速蔓延到全国所有省份[８]ꎬ对我国乃至全世界的养猪业造成了严重的经济损失ꎮＡＳＦＶ是Ａｓｆａｒｖｉｒｉｄａｅ科中Ａｓｆａｒｖｉｒｕｓ属的唯一成员[９]ꎬ是一种有囊膜的双链ＤＮＡ病毒ꎮＡＳＦＶ粒子是具有多层结构的二十面体ꎬ直径约为２００ｎｍꎬ病毒粒子结构自内向外依次为类核㊁核壳㊁内囊膜㊁衣壳㊁外囊膜[１０－１１]ꎮＡＳＦＶ基因组长度约为１７０~１９４ｋｂꎬ目前已从其中鉴定出结构蛋白６８种ꎬ部分蛋白的功能尚不清楚[１２]ꎮ这些结构蛋白分布在不同的区域ꎬ在病毒黏附与入侵㊁病毒基因组复制和转录㊁病毒包装与出芽以及免疫逃避等病毒感染的不同方面发挥着重要的作用[５]ꎮ由于ＡＳＦＶ结构复杂繁冗ꎬ对其功能的了解也十分有限ꎬ到目前为止还没有完全有效的ＡＳＦＶ商业疫苗ꎬ因此鉴定病毒结构蛋白的免疫原性在探讨病毒与宿主相互作用中至关重要[１３]ꎮＡＳＦＶｐ２２蛋白由ＫＰ１７７Ｒ基因编码ꎬ分子量为２２ｋＤａꎮｐ２２最初被描述为一种早期诱导的跨膜结构蛋白ꎬ位于病毒颗粒外部ꎬ能够从病毒颗粒表面溶解释放出来[１４]ꎮ然而ꎬ进一步的研究发现ꎬｐ２２蛋白位于病毒颗粒的内膜和感染细胞的表面[１５]ꎮ目前ꎬｐ２２蛋白在ＡＳＦＶ感染致病过程中的作用仍不清楚ꎮ本研究通过大肠杆菌原核表达系统成功表达并纯化出ｐ２２重组蛋白ꎬ通过免疫Ｂａｌｂ/ｃ小鼠成功制备了其单克隆抗体(ＭＡｂ)ꎬ为进一步探究ｐ２２蛋白的生物学作用奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀细胞㊁菌株㊁载体及实验动物大肠杆菌Ｔｒａｎｓ５α㊁ＢＬ２１(ＤＥ３)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司ꎻ骨髓瘤细胞ＳＰ２/０㊁ｐＥＴ－３２ａ载体均由本实验室保存ꎻＡＳＦＶ标准阳性血清购自中国兽医药品监察所ꎻＳＰＦ级５~８周龄Ｂａｌｂ/ｃ雌性小鼠购自济南朋悦试验动物繁育有限公司ꎮ１.２㊀主要试剂质粒小提试剂盒㊁胶回收试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司ꎻ限制性核酸内切酶㊁Ｔ４ＤＮＡ连接酶㊁蛋白Ｍａｒｋｅｒ均购自赛默飞世尔科技公司ꎻＮｉ￣ＮＴＡＡｇａｒｏｓｅ购自德国Ｑｉａｇｅｎ公司ꎻ单抗亚型鉴定试剂盒购自美国ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ公司ꎻＥＣＬ发光液㊁羊抗鼠ＨＲＰ－ＩｇＧ㊁羊抗猪ＨＲＰ－ＩｇＧ购自Ｂｅｙｏｔｉｍｅ公司ꎮ１.３㊀ＡＳＦＶｐ２２蛋白的原核表达１.３.１㊀重组表达质粒ｐＥＴ－３２ａ－ｐ２２的构建㊀根据ＡＳＦＶｐｉｇ/ＨＬＪ/２０１８株基因序列(ＧｅｎＢａｎｋＮｏ.ＭＫ３３３１８０.１)的ＫＰ１７７Ｒ基因序列进行引物设１４１㊀第１０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀矫健ꎬ等:非洲猪瘟病毒ｐ２２蛋白单克隆抗体的制备及鉴定计ꎬ正向引物(ｐ２２－Ｆ)序列:５ᶄ－ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴ￣ＧＣＧＴＧＴＴＴＡＴＧＡＴＴＡＣ－３ᶄ(包含ＸｈｏⅠ酶切位点)ꎬ反向引物(ｐ２２￣Ｒ)序列:５ᶄ－ＧＧＡＴＣ￣ＣＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡ－３ᶄ(包含ＢａｍＨⅠ酶切位点)ꎬ由生工生物工程(上海)股份有限公司合成ꎮ以合成的密码子优化后的ｐ２２基因序列为模板ꎬ使用引物扩增目的基因片段ꎬＰＣＲ反应程序为９５ħꎬ５ｍｉｎꎻ９４ħꎬ４５ｓꎬ５８ħꎬ４５ｓꎬ７２ħꎬ４５ｓꎬ３２个循环ꎻ７２ħꎬ１０ｍｉｎꎻ４ħ结束ꎮ将扩增产物进行１％的琼脂糖凝胶电泳并纯化回收ꎬ用Ｔ４ＤＮＡ连接酶分别将ＫＰ１７７Ｒ基因与ｐＥＴ－３２ａ载体连接ꎬ将连接产物转化到感受态细胞Ｔｒａｎｓ５α中ꎮ挑取单克隆摇菌ꎬ菌液经ＰＣＲ鉴定为阳性后ꎬ送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序ꎮ测序成功后将阳性重组质粒命名为ｐＥＴ－３２ａ－ｐ２２ꎮ１.３.２㊀ＡＳＦＶｐ２２重组蛋白的表达和纯化㊀将阳性重组质粒ｐＥＴ－３２ａ－ｐ２２转化至大肠杆菌ＢＬ２１(ＤＥ３)感受态细胞ꎬ挑取单克隆至ＬＢ培养基中３７ħ培养过夜ꎬ取１ｍＬ菌液接种至氨苄青霉素(ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎꎬＡｍｐ)抗性的１００ｍＬＬＢ液体培养基中ꎬ３７ħ㊁２２０ｒ/ｍｉｎ摇床培养至ＯＤ６００值达到０.６~０.８时ꎬ添加终浓度为１ｍｍｏｌ/Ｌ的ＩＰＴＧ诱导目的蛋白表达ꎬ诱导４ｈ后ꎬ收集菌体沉淀ꎬ使用裂解液(３００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌꎬ５０ｍｍｏｌ/ＬＮａＨ２ＰＯ４ꎬｐＨ＝７.４)重悬菌体ꎬ进行超声破碎ꎬ４ħ㊁４０００ｒ/ｍｉｎ离心ꎬ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴定后使用０.４５μｍ滤膜过滤ꎬ与蛋白纯化填料４ħ过夜结合ꎮ采用亲和层析的方式纯化ꎬ收集洗脱产物ꎬ用于ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定ꎬ使用超滤管将有单一目的蛋白条带的洗脱产物浓缩并置换到ＰＢＳ中ꎬ－８０ħ保存ꎮ１.３.３㊀ＡＳＦＶｐ２２重组蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定㊀重组ｐ２２蛋白纯化后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳ꎬ随后转移到ＰＶＤＦ膜上ꎬ经５％脱脂奶粉封闭后ꎬ以ＡＳＦＶ标准阳性血清(１ʒ１０００)作为一抗孵育２ｈꎮ清洗后ꎬ加入ＨＲＰ标记的羊抗猪ＩｇＧ二抗(１ʒ８０００)孵育１ｈꎬ进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定ꎮ１.４㊀ＡＳＦＶｐ２２单克隆抗体的制备１.４.１㊀Ｂａｌｂ/ｃ小鼠的免疫及血清效价的测定㊀纯化后的重组ｐ２２蛋白与等体积弗氏完全佐剂乳化后ꎬ对４只５~８周龄Ｂａｌｂ/ｃ小鼠进行背部多点皮下注射ꎬ免疫剂量为１００μｇ/只ꎬ每１４ｄ免疫一次ꎬ共免疫３次ꎮ最后一次免疫７ｄ后从小鼠尾静脉取少量血ꎬ分离血清ꎬ通过间接ＥＬＩＳＡ方法检测血清中的抗体效价ꎮ将纯化的ｐ２２重组蛋白以２ｇ/ｍＬ的浓度包被到聚苯乙烯９６孔反应板(１００μＬ/孔)ꎬ４ħ放置过夜ꎻ次日用ＰＢＳＴ洗板３次后进行封闭(ｌ５０μＬ/孔封闭液)ꎬ室温放置０.５ｈꎻ用样品稀释液将小鼠血清按１ʒ２０００ꎬ１ʒ４０００ꎬ１ʒ８０００ꎬ１ʒ１６０００ꎬ１ʒ３２０００ꎬ１ʒ６４０００ꎬ１ʒ１２８０００ 进行倍比稀释ꎬ洗板３次后加入稀释好的血清并设置空白血清做阴性对照(１００μＬ/孔)ꎬ室温孵育１ｈꎻ洗板３次后加入ＨＲＰ标记的鼠二抗(１ʒ５０００ꎬ１００μＬ/孔)ꎬ３７ħ孵育４０ｍｉｎꎻＰＢＳＴ洗板５次并拍干ꎬ加入ＴＭＢ(１００μＬ/孔)ꎬ室温避光显色１０~１５ｍｉｎꎻ加入终止液(５０μＬ/孔)ꎬ用酶标仪测定４５０ｎｍ处各孔的吸光值ꎮ１.４.２㊀细胞融合及亚克隆筛选㊀按照标准流程取免疫后的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞ＳＰ２/０融合ꎬ通过间接ＥＬＩＳＡ方法检测筛选阳性杂交瘤细胞ꎬ使用有限稀释法对单克隆阳性孔进行３次亚克隆ꎮ筛选出稳定表达ｐ２２的阳性孔ꎬ进行扩大培养ꎮ１.４.３㊀腹水制备㊀将阳性杂交瘤细胞扩大培养并注射至Ｂａｌｂ/ｃ小鼠的腹腔(经弗氏不完全佐剂乳化)ꎬ７~１０ｄ后观察小鼠腹部隆起状况ꎬ并及时抽取腹水ꎮ１２０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ收集上清ꎬ－７０ħ冻存备用ꎮ１.５㊀ＡＳＦＶｐ２２单克隆抗体的鉴定１.５.１㊀单克隆抗体效价鉴定㊀将进行不同比例稀释后的腹水作为一抗ꎬＨＲＰ标记的羊抗鼠ＩｇＧ作为二抗ꎬ用重组ｐ２２蛋白建立的间接ＥＬＩＳＡ方法进行效价的测定(方法同１.４.１)ꎮ１.５.２㊀单克隆抗体亚型鉴定㊀用小鼠抗体亚型鉴定试剂盒对杂交瘤细胞制备的腹水抗体进行亚型测定ꎮ准备好包被有重组ｐ２２蛋白的板条(５０ｎｇ/孔)ꎬ每个克隆收集６００μＬ腹水上清ꎬ分别滴加到６个对应的酶标孔中(１００μＬ/孔)ꎬ３７ħ孵育１ｈꎻＰＢＳＴ洗板３次ꎬ将稀释好的分型二抗抗ＩｇＭ㊁ＩｇＡ㊁ＩｇＧ１㊁ＩｇＧ２ａ㊁ＩｇＧ２ｂ㊁ＩｇＧ３的抗体加入６个孔中ꎬ３７ħ孵育１ｈꎻＰＢＳＴ洗板３次ꎬ加入ＴＭＢ显色ꎬ有信号反应的孔对应的鉴定二抗亚型即为２４１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀该抗体的亚型ꎮ１.５.３㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定单克隆抗体的免疫原性㊀纯化的重组ｐ２２蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳后ꎬ转移至ＰＶＤＦ膜上ꎬ使用５％脱脂奶粉封闭２ｈꎻＰＢＳＴ洗膜后ꎬ加入单克隆抗体(１ʒ１０００)ꎬ４ħ孵育过夜ꎻ清洗后ꎬ加入ＨＲＰ标记的羊抗鼠ＩｇＧ二抗孵育１ｈꎬ充分清洗后使用ＥＣＬ发光液进行曝光ꎬ观察结果ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀重组表达质粒ｐＥＴ３２ａ－ｐ２２的构建用ｐ２２－Ｆ/ｐ２２－Ｒ引物对优化的ｐ２２基因进行扩增ꎬ结果显示ꎬＰＣＲ扩增后的ｐ２２基因片段约为４４７ｂｐꎬ大小符合预期(图１)ꎮ通过酶切酶连将ｐ２２扩增产物连接到ｐＥＴ－３２ａ质粒中ꎮ经测序分析后ꎬ基因测序结果完全正确ꎮ２.２㊀重组ｐ２２蛋白的表达和纯化ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳结果显示ꎬ与未诱导组相比ꎬ诱导组可见与预期大小一致的３７ｋＤａ融合蛋白ꎬ经超声破碎后可溶性分析发现ꎬ重组ｐ２２蛋白条带出现在超声后上清中ꎬ表明重组ｐ２２蛋白为可溶性表达(图２Ａ)ꎮ进一步大量诱导ｐ２２重组蛋白的表达ꎬ并与ＨｉｓＮｉ－ＮＴＡＡｇａｒｏｓｅ亲和层析柱结合ꎬ使用不同浓度梯度的咪唑洗脱液洗脱蛋白ꎬ收集洗脱液ꎬ随后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴定ꎮ结果显示ꎬ使用高浓度洗脱液时ꎬ在３７ｋＤａ处出现单一条带(图２Ｂ)ꎬ纯化后纯度大于９５％ꎮ１:ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００ꎻ２:阴性对照ꎻ３:目的基因ＰＣＲ产物ꎮ图１㊀ｐ２２基因ＰＣＲ扩增目的片段２.３㊀重组ｐ２２蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定对重组ｐ２２蛋白进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定ꎬ通过Ｈｉｓ标签抗体孵育后ꎬ在３７ｋＤａ处检测到嵌合Ｈｉｓ标签的ｐ２２蛋白ꎻ而使用ＡＳＦＶ阳性血清孵育后ꎬ发现重组ｐ２２蛋白能够与ＡＳＦＶ阳性血清发生特异性结合(图２Ｃ)ꎬ表明该抗原具有良好免疫原性ꎮＡ:１.预染蛋白质分子质量标准ꎬ２~５.诱导组ꎬ超声破碎后上清ꎬ超声破碎后沉淀ꎬ未诱导组ꎻＢ:１.预染蛋白质分子质量标准ꎬ２.超声破碎后上清ꎬ３.流穿液ꎬ４~９.２０㊁４０㊁５０㊁１００㊁１００㊁２００ｍｍｏｌ/Ｌ咪唑洗脱液ꎻＣ:１㊁３.预染蛋白质分子质量标准ꎬ２.Ｈｉｓ抗体孵育重组ｐ２２蛋白ꎬ４.阳性猪血清孵育重组ｐ２２蛋白ꎮ图２㊀重组ｐ２２蛋白的表达(Ａ)㊁纯化(Ｂ)及鉴定(Ｃ)２.４㊀单克隆抗体的制备及鉴定２.４.１㊀血清效价的测定㊀三免７ｄ后通过间接ＥＬＩＳＡ方法检测接种小鼠血清效价ꎬ测得１㊁２㊁３号小鼠的血清效价为１ʒ１２８０００ꎬ４㊁５号小鼠的血清效价为１ʒ６４０００(图３Ａ)ꎮ选取１㊁２㊁３号小鼠进行加强免疫ꎮ２.４.２㊀单克隆抗体效价测定㊀在骨髓瘤细胞和脾细胞融合后ꎬ进行融合筛选ꎬ对筛选的阳性孔进行３次亚克隆后ꎬ经间接ＥＬＩＳＡ方法检测ꎬ最终筛选到了两株能够稳定分泌重组ｐ２２ＭＡｂ的杂交瘤细胞株ꎬ通过小鼠腹腔注射两种杂交瘤细胞株ꎬ制备了小鼠腹水ꎬ通过间接ＥＬＩＳＡ方法测定腹水的效价分别为１ʒ５１２０００和１ʒ２５６０００(图３Ｂ)ꎬ将获得的单克隆抗体命名为２Ｄ６和５Ｅ７ꎮ３４１㊀第１０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀矫健ꎬ等:非洲猪瘟病毒ｐ２２蛋白单克隆抗体的制备及鉴定图３㊀小鼠血清效价(Ａ)及单克隆抗体效价(Ｂ)的测定２.４.３㊀单克隆抗体亚型鉴定㊀采用美国ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ公司的单抗亚型鉴定试剂盒分别对ｐ２２ＭＡｂ２Ｄ６和５Ｅ７的亚型进行检测ꎬ结果显示两种ＭＡｂ的亚型均为ＩｇＧ１(表１)ꎮ㊀㊀表１㊀单克隆抗体亚型鉴定细胞株编号亚型轻链类型２Ｄ６ＩｇＧ１Ｋａｐｐａ５Ｅ７ＩｇＧ１Ｋａｐｐａ２.４.４㊀单克隆抗体的免疫反应鉴定㊀为了鉴定ＭＡｂ２Ｄ６和５Ｅ７的免疫反应性ꎬ通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测了其对外源性ｐ２２蛋白的反应性ꎮ结果显示ꎬ两株ＭＡｂ均能够在３７ｋＤａ处与ｐ２２蛋白发生特异性反应(图４)ꎮ１:预染蛋白质分子质量标准ꎻ２:重组ｐ２２蛋白ꎮ图４㊀单克隆抗体２Ｄ６(Ａ)和５Ｅ７(Ｂ)的免疫反应鉴定３㊀讨论与结论自２０１８年ＡＳＦ传入中国并迅速传播以来ꎬＡＳＦ对生猪生产造成了重大的经济威胁ꎬ目前ꎬ在中国传播的ＡＳＦＶ类型主要为一种高毒力的基因型Ⅱ毒株[１６]ꎬ基因型Ⅰ毒株也有报道[１７]ꎮＡＳＦＶ在环境中具有高传染性和稳定性ꎬ可通过与受感染的猪或其产品直接接触或通过软蜱进行传播[１８]ꎮ直到目前ꎬ仍然没有针对ＡＳＦＶ的有效商业疫苗ꎬ使得非洲猪瘟的预防㊁控制和治疗变得十分艰难[１９]ꎬ因此ꎬ筛选ＡＳＦ免疫原性蛋白ꎬ鉴定免疫相关基因ꎬ将有助于ＡＳＦ疫苗的开发ꎮ另外ꎬ需要对ＡＳＦＶ的结构功能等基础研究进行攻克ꎬ以期为ＡＳＦ疫苗或诊断试剂的研发提供更多理论依据ꎮ相关研究表明ꎬ鉴定最具抗原性的病毒蛋白对改进血清学诊断试验具有重要作用ꎬ在ＡＳＦＶ血清诊断试验中使用重组蛋白作为抗原来源可避免操纵活病毒的潜在风险[２０]ꎮｐ２２蛋白为ＡＳＦＶ的结构蛋白ꎬ根据序列分析比较ꎬ东欧等地区ＡＳＦＶ分离株中的ｐ２２序列保守ꎬ证明ｐ２２蛋白是抗原稳定的ꎬ因此适合用作开发新的血清诊断试验的工具[２１]ꎮ目前对于ｐ２２蛋白的功能研究尚不完善ꎬ其生物学功能仍待阐明ꎮ原核表达系统具有操作简单㊁表达量高的特点ꎬ本研究中所用的原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ可在ＢＬ２１(ＤＥ３)细菌中高度表达ꎬ并且可以在裂解物的上清液中检测到大量目标蛋白ꎬ大大简化了纯化过程ꎬ同时避免了由包涵体的变性和复性可能引起的活性损失[２２]ꎮ虽然从构象结构上看ꎬ原核表达与真核表达的抗原会有差异ꎬ但不会影响抗原的线性表位[２３]ꎬ因此ꎬ使用原核表达系统制备单克隆抗体仍可继续进行线性表位的筛选ꎬ为ＡＳＦＶ结构功能的研究提供生物学材料ꎮ单克隆抗体(ＭＡｂ)是诊断病毒感染的关键试剂ꎮ与多克隆抗体相比ꎬＭＡｂ在现代免疫诊断的应用中表现出特异性强㊁灵敏度高等优势ꎬ在疾病预防㊁诊断㊁治疗和流行病学调查等研究中发挥了巨大作用ꎮ张冯禧等[２４]通过原核表达系统获４４１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀得ＡＳＦＶｐ３０重组蛋白并制备了ＭＡｂꎬ效价为１ʒ１０２４００ꎬ表明该蛋白有良好的免疫原性ꎮ齐艳丽等[２５]通过原核表达系统表达纯化了ＡＳＦＶｐ５４重组蛋白并制备了ＭＡｂꎬ抗体ＥＬＩＳＡ效价均高于１ʒ２５６００且特异性良好ꎮ本研究通过大肠杆菌表达系统成功表达并纯化出一种可溶性重组蛋白ｐ２２ꎬ并制备了两株针对该蛋白的ＭＡｂꎮ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ共同分析ꎬ重组蛋白大小约为３７ｋＤａꎬ将纯化的重组蛋白做免疫原免疫小鼠ꎬ得到抗体的ＥＬＩＳＡ效价不低于１ʒ２５６０００ꎬ说明制备的ＭＡｂ具有良好的免疫原性ꎬ为ｐ２２蛋白的结构功能等基础研究以及ＡＳＦＶ免疫类诊断试剂产品的开发提供了重要的生物材料ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＺｈｕＸꎬＦａｎＢꎬＺｈｏｕＪꎬｅｔａｌ.Ａｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｍｅｔｈｏｄｔｏａｎ￣ａｌｙｚｅｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎｏｆＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｉｎｖｉｔｒｏ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２１ꎬ８:７１９－８５９.[２]㊀王清华ꎬ任炜杰ꎬ包静月ꎬ等.我国首例非洲猪瘟的确诊[Ｊ].中国动物检疫ꎬ２０１８ꎬ３５(９):１－４.[３]㊀吴萌萌ꎬ张栋良ꎬ孙彩虹ꎬ等.非洲猪瘟研究进展[Ｊ].畜牧兽医杂志ꎬ２０２２ꎬ４１(１):４３－４７.[４]㊀ＷｉｌｋｉｎｓｏｎＰＪꎬＷａｒｄｌｅｙＲＣꎬＷｉｌｌｉａｍｓＳＭ.ＳｔｕｄｉｅｓｉｎｐｉｇｓｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ(Ｍａｌｔａ/７８)[Ｃ]ʊＥｘ￣ｐｅｒｔＣｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎｏｎＡｆｒｉｃａｎＳｗｉｎｅＦｅｖｅｒＲｅｓｅａｒｃｈꎬ１９８３:７４－８４.[５]㊀ＤｉｘｏｎＬＫꎬＣｈａｐｍａｎＤＡＧꎬＮｅｔｈｅｒｔｏｎＣＬꎬｅｔａｌ.Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｏｍｉｃｓ[Ｊ].ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１３ꎬ１７３(１):３－１４.[６]㊀Ｇａｖｉｅｒ￣ＷｉｄéｎＤꎬＳｔåｈｌＫꎬＤｉｘｏｎＬ.ＮｏｈａｓｔｙｓｏｌｕｔｉｏｎｓｆｏｒＡｆｒｉ￣ｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０２０ꎬ３６７(６４７８):６２２－６２４. [７]㊀ＤｉｘｏｎＬＫꎬＳｕｎＨꎬＲｏｂｅｒｔｓＨ.Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ[Ｊ].Ａｎｔｉｖｉ￣ｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１９ꎬ１６５:３４－４１.[８]㊀ＧｅＳꎬＬｉＪꎬＦａｎＸꎬｅｔａｌ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓꎬＣｈｉｎａꎬ２０１８[Ｊ].ＥｍｅｒｇｉｎｇＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａ￣ｓｅｓꎬ２０１８ꎬ２４(１１):２１３１－２１３３.[９]㊀ＡｌｏｎｓｏＣꎬＢｏｒｃａＭꎬＤｉｘｏｎＬꎬｅｔａｌ.ＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍꎬＩＲＩＣＴＶｖｉ￣ｒｕｓｔａｘｏｎｏｍｙｐｒｏｆｉｌｅ:Ａｓｆａｒｖｉｒｉｄａｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉ￣ｒｏｌｏｇｙꎬ２０１８ꎬ９９:６１３－６１４.[１０]ＷａｎｇＧꎬＸｉｅＭꎬＷｕＷꎬｅｔａｌ.Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｉｖｅｒ￣ｓｉｔｉｅｓｏｆＡＳＦＶｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｖｉｒｕｓｅｓꎬ２０２１ꎬ１３(１１):２１２４. [１１]ＷａｎｇＮꎬＺｈａｏＤꎬＷａｎｇＪꎬｅｔａｌ.ＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｏｆＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓａｎｄｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｖｉｒａｌａｓｓｅｍｂｌｙ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１９ꎬ３６６(６４６５):６４０－６４４.[１２]郭怡德ꎬ李冰ꎬ蔡汝健ꎬ等.非洲猪瘟病毒蛋白功能研究进展[Ｊ].动物医学进展ꎬ２０２０ꎬ４１(１０):９６－１０１. [１３]ＤíａｚＣꎬＳａｌáｔＪꎬＫｏｌａｒ㊅ｏｖáＤＢꎬｅｔａｌ.Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｉｍｍｕｎｏ￣ｇｅｎｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｎｔｉｇｅｎｓｂａｓｅｄｏｎｐ２２ｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＲｅ￣ｓｅａｒｃｈꎬ２０２２ꎬ６６(３):２９７－３０４.[１４]ＣａｍａｃｈｏＡꎬＶｉñｕｅｌａＥ.Ｐｒｏｔｅｉｎｐ２２ｏｆＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉ￣ｒｕｓ:ａｎｅａｒｌｙｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｔｈａｔｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｍｅｍｂｒａｎｅｏｆｉｎｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ１９９１ꎬ１８１(１):２５１－２５７.[１５]ＡｌｅｊｏＡꎬＭａｔａｍｏｒｏｓＴꎬＧｕｅｒｒａＭꎬｅｔａｌ.ＡｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｔｌａｓｏｆｔｈｅＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｐａｒｔｉｃｌｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２０１８ꎬ９２(２３):ＤＯＩ:１０.１１２８/ｊｖｉ.０１２９３－１８.[１６]ＭｏｎｔｅａｇｕｄｏＰＬꎬＬａｃａｓｔａＡꎬＬóｐｅｚＥꎬｅｔａｌ.ＢＡ７１ΔＣＤ２:ａｎｅｗｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｉｖｅａｔｔｅｎｕａｔｅｄＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｗｉｔｈｃｒｏｓｓ￣ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ９１(２１):ＤＯＩ:１０.１１２８/ｊｖｉ.０１０５８－１７.[１７]ＳｕｎＥꎬＨｕａｎｇＬꎬＺｈａｎｇＸꎬｅｔａｌ.ＧｅｎｏｔｙｐｅＩＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅ￣ｖｅｒｖｉｒｕｓｅｓｅｍｅｒｇｅｄｉｎｄｏｍｅｓｔｉｃｐｉｇｓｉｎＣｈｉｎａａｎｄｃａｕｓｅｄｃｈｒｏ￣ｎｉｃｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＥｍｅｒｇｉｎｇＭｉｃｒｏｂｅｓ＆Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓꎬ２０２１ꎬ１０(１):２１８３－２１９３.[１８]ＲｅｖｉｌｌａＹꎬＰｅｒｅｚ￣ＮｕｎｅｚＤꎬＲｉｃｈｔＪＡ.Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉ￣ｒｕｓｂｉｏｌｏｇｙａｎｄｖａｃｃｉｎｅａｐｐｒｏａｃｈｅｓ[Ｊ].ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＶｉｒｕｓＲｅ￣ｓｅａｒｃｈꎬ２０１８ꎬ１００:４１－７４.[１９]ＷｕＫꎬＬｉｕＪꎬＷａｎｇＬꎬｅｔａｌ.ＣｕｒｒｅｎｔｓｔａｔｅｏｆｇｌｏｂａｌＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖａｃｃｉｎｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｕｎｄｅｒｔｈｅｐｒｅｖａｌｅｎｃｅａｎｄｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆＡＳＦｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅｓꎬ２０２０ꎬ８(３):５３１.[２０]ＧａｌｌａｒｄｏＣꎬＢｌａｎｃｏＥꎬＲｏｄｒíｇｕｅｚＪＭꎬｅｔａｌ.Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｐｒｏｐｅｒ￣ｔｉｅｓａｎｄｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｐｒｏｔｅｉｎｐｐ６２ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｉｎｓｅｃｔｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉ￣ｏｌｏｇｙꎬ２００６ꎬ４４(３):９５０－９５６.[２１]ＶｌａｓｏｖａＮＮꎬＫａｚａｋｏｖａＡＳꎬＶａｒｅｎｔｓｏｖａＡＡꎬｅｔａｌ.Ｃｏｍｐａｒａ￣ｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｏｕｔｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆＡｆｒｉ￣ｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｇｉｏｎｓｏｆＲｕｓｓｉａｎＦｅｄｅｒａｔｉｏｎａｎｄＡｒｍｅｎｉａ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ１(１):１－１１.[２２]ＸｕＬꎬＣａｏＣꎬＹａｎｇＺꎬｅｔａｌ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｉｔｅｉｎｔｈｅＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｐ５４ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｉｔｓｐｒｅｌｉｍｉ￣ｎａｒｙａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎａｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌａｓｓａｙ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ２３(４):ｅ５５.[２３]于浩洋ꎬ王彩霞ꎬ吴绍强ꎬ等.非洲猪瘟病毒ｐ３０蛋白单克隆抗体的制备及阻断ＥＬＩＳＡ检测方法的建立[Ｊ].中国兽医科学ꎬ２０２２ꎬ５２(１):４８－５５.[２４]张冯禧ꎬ肖琦ꎬ朱家平ꎬ等.非洲猪瘟病毒Ｐ３０蛋白单克隆抗体制备㊁鉴定及阻断ＥＬＩＳＡ方法的建立[Ｊ].中国农业科学ꎬ２０２２ꎬ５５(１６):３２５６－３２６６.[２５]齐艳丽ꎬ刘桃雪ꎬ于海深ꎬ等.非洲猪瘟病毒ｐ５４蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定[Ｊ].畜牧兽医学报ꎬ２０２３ꎬ５４(１):２８１－２９２.５４１㊀第１０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀矫健ꎬ等:非洲猪瘟病毒ｐ２２蛋白单克隆抗体的制备及鉴定。
人巨细胞病毒UL135蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备和鉴定
人巨细胞病毒UL135蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备和鉴定胡盈盈;郭刚强;叶思思;孙祥威;毛晨晨;薛向阳;吕杰强【期刊名称】《温州医学院学报》【年(卷),期】2017(047)005【摘要】目的:制备人巨细胞病毒(HCMV)UL135原核表达蛋白及其多克隆抗体.方法:生物信息学分析HCMV UL135蛋白的跨膜区结构,经原核密码子优化后对胞外序列进行全基因合成,将序列克隆至原核表达载体构建pET21a(+)/HCMV UL135重组质粒,IPTG诱导蛋白表达后,Ni-NTA亲和层析法纯化UL135重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA、Western blot法检测抗体灵敏度和特异性.结果:HCMV的UL135基因在原核表达系统中成功表达,经Ni-NTA亲和纯化后获得高纯度的目的蛋白;免疫新西兰兔诱导产生特异性的多克隆IgG抗体,且效价为1:12800;经ELISA以及Western blot证实制备的兔抗多克隆抗体可特异性识别UL135蛋白.结论:成功实现了HCMV UL135的重组表达并制备了UL135兔多克隆抗体,为进一步研究UL135蛋白的生物学功能奠定基础.%Objective: To construct a prokaryotic expression vector expressing UL135 protein of human cytomegalovirus (HCMV) and prepare a UL135 specific polyclonal antibody.Methods: Bioinformatics methods were used to analyze the transmembrane domain of UL135 protein, and then the cytoplasmic domain synthesized by fully-synthetic gene was cloned into vector pET21a (+) after the prokaryotic codon optimization. The pET21a (+)/UL135 recombinant plasmid was transformed intoE.coli BL21 (DE3) and theninduced by isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). To prepare specific polyclonal antibody, New Zealand rabbits were immunized by the UL135 recombinant protein which was purified by Ni-NTA affinity chromatography primarily. The sensitivity and the specificity of the antibody were determined by ELISA and Western blot assays.Results: HCMV UL135 protein was successfully expressed in prokaryotic system and highly purified target protein was obtained through Ni-NTA affinity chromatography. New Zealand rabbits could generate specific polyclonal IgG antibody after im-munized. ELASE and Western blot analysis determined that the preparative polyclonal IgG antibody could spe-cifically identify the UL135 protein.Conclusion: HCMV UL135 protein is successfully expressed in prokaryotic expression system, and anti-UL135 rabbit polyclonal antibody is successfully prepared for the further research.【总页数】6页(P336-341)【作者】胡盈盈;郭刚强;叶思思;孙祥威;毛晨晨;薛向阳;吕杰强【作者单位】温州医科大学附属第二医院妇产科,浙江温州 325027;温州医科大学分子病毒与免疫研究所,浙江温州 325035;温州医科大学分子病毒与免疫研究所,浙江温州 325035;温州医科大学附属第一医院胃肠外科,浙江温州 325015;温州医科大学附属第一医院胃肠外科,浙江温州 325015;温州医科大学分子病毒与免疫研究所,浙江温州 325035;温州医科大学附属第二医院妇产科,浙江温州325027【正文语种】中文【中图分类】R373.9【相关文献】1.人巨细胞病毒UL135蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备和鉴定 [J], 胡盈盈;郭刚强;叶思思;孙祥威;毛晨晨;薛向阳;吕杰强;2.莱茵衣藻BBSome蛋白BBS2原核表达、纯化和多克隆抗体的制备及鉴定 [J], 董彬;吴松;程荣强;孟德梅;樊振川3.中华蜜蜂NPC1蛋白AcNPC1的原核表达、多克隆抗体制备及功能鉴定 [J], 刘永梅;史红霞;李颜;马振刚;王林玲;许金山;周泽扬;党晓群4.非洲猪瘟病毒B438L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定 [J], 刘雪婷;王召阳;鑫婷;郭晓宇;姜一曈;崔帅;于海男;朱鸿飞;贾红5.1型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定 [J], 刘莉;顾玲玲;张硕;谢军;朱善元;王安平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。