斑马鱼(Danio rerio)胚胎免疫反应:补体基因在早期胚胎以及LPS刺激胚胎中的表达
斑马鱼胚胎的显微注射
斑马鱼胚胎的显微注射 实验四斑马鱼胚胎的显微注射 08生物科技刘佳 一、实验目的 1.练习针刺细胞（未受精卵、去核卵、早期胚胎细胞或体外培养细胞）；2.实践微量移液管准备；
3、掌握细胞显微移植技术（细胞核、外源基因）；4、了解显微注射的应用及注意事项。
二、 实验设备和材料 斑马鱼胚胎、酚红、显微镜；显微操作仪；拉针仪 三、 实验原理和步骤 显微注射（microinjection）技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育，从而获得转基因动物。它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载体dna片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制,可达100kb；实验周期相对比较短。
注射过程：1。注射针中的液体：使用无菌微量取样器从微量注射针背面添加一滴要注射的酚红。2.注射针的安装和定位：（1）将充液针的自由端安装在连接器上，然后拧紧连接器以固定注射针，然后将其固定在微操作器的针管上；（2） 将含有待注射样品的培养皿放在显微镜台上，用低倍物镜聚焦细胞；（3） 移动针头并在显微镜下调整微操作器，直到针头的阴影高于视野中心；（4） 使用工作放大镜调整单元的焦距并找到针尖。3.微量注射：（1）将针尖与待注射细胞的部分对齐（细胞和针尖位于同一焦平面上），旋转旋钮和针头进入细胞（卵膜、细胞膜和核膜）；（2） 旋转取样旋钮以添加样品并离开试管。
四、实验结果观察 注射前、注射中和注射后 五、注意事项 在实验过程中，针头应锋利且易于折断胚胎。断针应放在有海平面或泡沫的盘子中，以防止针滑动和断裂。在整个过程中，注射针尖应远离实验室的人员和仪器。当注射针未牢固安装在针座上时，注射器、管和注射针中的压力可能会注射注射针。反向加注液体时，在显微镜下适当观察注射针尖，以确定加压过程中注射针头是否堵塞或倾斜。通常可以通过将针尖轻轻敲击夹具来缓解阻塞。针尖歪斜的注射针适用于微量注射，但其使用应稍微调整或补偿注射过程中增压引起的额外偏转。注射速度过快会干扰细胞质成分、细胞溶解或细胞从底层移位。当注射体积小于估计细胞体积的10%，且注射样品的流速几乎不会导致可见的细胞质移位时，注射效果最佳。
两个Sox9基因在斑马鱼胚胎发育和成体性腺中的动态表达特征
两个Sox9基因在斑马鱼胚胎发育和成体性腺中的动态表达特征作者：梁清仪王心仪孙冬捷等来源：《山东农业科学》2014年第07期摘要：通过整体原位杂交和切片原位杂交技术系统全面地比较分析了斑马鱼胚胎四个发育时期（12、24、48 hpf和4 dpf）和成熟性腺中Sox9a和Sox9b基因的表达模式。
结果显示，两个Sox9基因在脑和眼中持续表达，但在耳囊、头部软骨、胸鳍芽和体节中差异性表达。
Sox9a 特异性地在侧线、尾部神经嵴、原肾管和精巢支持细胞中表达，而Sox9b在卵巢的卵黄颗粒中大量表达。
与已发表的研究结果相比，本研究更广泛地揭示了Sox9a和Sox9b的动态差异表达模式，且更清楚地显示了其在性腺中的表达特征。
关键词：Sox9a；Sox9b；斑马鱼；胚胎发育；成体性腺中图分类号：Q959.46+8∶Q786文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）07-0020-05AbstractUsing whole mount and tissue section in situ hybridization techniques， the expression patterns of two Sox9 homologues genes，Sox9a and Sox9b，were comprehensively compared and analyzed in four stages of developing embryo （12， 24， 48 hpf and 4 dpf） and mature gonads of zebrafish （Danio rerio）. The two genes were persistently expressed in brain and eyes，but differentially expressed in otic vesicle， head cartilage， pectoral fin buds and somites. Distinct from high expression of Sox9b in the yolk granules of oocytes， Sox9a was specifically expressed in lateral line， tail neural crest， primary renal tubular and Sertoli cells in testis. Compared with other published results， the present data revealed a more extensive differential expression profile of two Sox9 genes in the developing embryo and gonads of zebrafish.Key wordsSox9a； Sox9b；Zebrafish（Danio rerio）； Embryonic development； GonadSox9被普遍认为是雄性睾丸决定必须基因，但其功能并不局限于性腺。
Izumo1基因在斑马鱼精卵识别和融合过程中的功能研究
分类号：Q785密级：U D C ：577学号：2111501027硕士学位论文Izumo1基因在斑马鱼精卵识别和融合过程中的功能研究杜文文指导教师：邵华副教授申请学位类别：农学硕士专业名称：水产养殖研究方向：水产动物分子育种学院名称：水产学院中国·湛江2018年6月Izumo1基因在斑马鱼精卵识别和融合过程中的功能研究摘要生物体的生殖包括有性生殖和无性生殖两种。
在有性生殖过程中，受精作用涉及到一系列复杂精密的过程，其中精、卵细胞膜的识别与融合是受精过程中非常关键的一步，是有性生殖生命发生的第一个过程。
因此，明确其分子机制对理解生命个体的发生意义重大！精卵识别与融合过程涉及到大量的精、卵细胞膜上的蛋白。
目前，科学研究者们在精子和卵子细胞膜表面发现了许多与精、卵细胞融合相关的蛋白分子，在这些已获得的蛋白分子中，位于精子细胞膜上的IZUMO1蛋白已经被证明是精、卵细胞融合的关键分子。
近年来，斑马鱼（Barchydanio rerio var）因其特有的优势及其生物学特性，已经成为脊椎动物中一种新型的模式生物，广泛应用于分子生物学、环境毒理学等方面的研究。
因此本研究以斑马鱼为研究对象，拟通过对斑马鱼Izumo1基因的研究，为鱼类的受精机制提供理论基础。
本文以斑马鱼作为研究对象，开展了对与精卵识别与融合过程相关的Izumo1基因的研究，进行了Izumo1基因的克隆、组织表达、真核表达载体的构建以及胚胎的显微注射等工作。
结果如下：采用RT-PCR技术克隆了斑马鱼Izumo1基因的cDNA，并通过生物信息学软件对其序列以及编码的蛋白质进行分析。
结果表明：克隆得到的斑马鱼Izumo1基因cDNA的全长是1112 bp，开放阅读框（ORF）为1011 bp，编码336个氨基酸，含有信号肽序列和一次跨膜螺旋区，脂肪系数高达97.98，亲水性总平均值（GRA VY）为-0.233，预测显示该蛋白有IZUMO结构域以及免疫球蛋白超家族结构域，三级结构预测结果显示其空间结构与人和小鼠的Izumo1蛋白的空间结构相似，蛋白质系统进化分析显示，IZUMO1蛋白在同一目内的动物间具有很高的相似性。
华中农大：斑马鱼养殖综述
斑马鱼(Danio rerio)养殖综述Christian Lawrence布莱根妇女医院卡帕研究实验室马萨诸塞州美国收稿日期：2007年7月16日；改修日期：2007年8月24日；接受日期：2007年8月25日。
摘要：斑马鱼(Danio rerio)是脊椎动物研究的模式生物。
斑马鱼的优良性状有利于研究人类疾病的发生与传播。
较强的繁殖力、短小的体型、繁殖周期短、胚胎早期光学透明性强等特性使得斑马鱼成为许多研究者研究其他项目青睐的对象，包括研究动物行为、鱼类生理机能和水产养殖毒性试验。
尽管如此，科学严谨的斑马鱼养殖技术还是很不发达。
尽管斑马鱼有很大的需求量，包括直接或者间接养殖。
斑马鱼的养殖缺乏应用养殖标准。
本文试图将已有的关于斑马鱼生物学和养殖的科学信息进行综述，可以用来提高这一重要的模型动物使用检索的效率。
本研究还强调了该领域还需要进一步研究的内容。
关键词：斑马鱼；Danio rerio；饲养；水产养殖；管理目录：1、引言 (2)2、斑马鱼自然生活史 (3)2.1、分布和栖息地 (3)2.2、生殖和行为 (3)2.3、寿命 (5)2.4、食物 (5)3、斑马鱼养殖 (5)3.1、水化学参数 (5)3.1.1、温度 (6)3.1.1、pH (6)3.1.3、硬度 (7)3.1.4、盐度 (7)3.1.5、溶解氧 (8)3.1.6、含氮废弃物 (8)4、营养、食物、投喂方式 (8)4.1、营养需求 (8)4.2、食物 (9)4.3、投喂 (11)5、繁殖和育种技术 (11)5.1、繁殖 (11)5.2、育种技术 (12)5.3、产卵效率 (13)6、幼鱼饲养 (13)6.1、幼鱼生物学 (13)6.2、食物和营养 (13)6.3、水质 (14)6.4、生长率和存活率 (15)7、成鱼培育 (15)7.1、放养密度 (15)7.2、遗传育种 (16)8、结语 (16)鸣谢 (16)参考文献 (16)1、引言在过去的二十年间，斑马鱼(Danio rerio)广泛作为遗传学和发育学研究的优良模式生物(Fishman,2001)，最近斑马鱼还应用于的人类疾病和治疗药物筛选的研究当中(Penberthy et al.,2002;Sumanasa and Lin, 2004)。
PP2A-Aα_β在金鱼及斑马鱼发育中的分化表达模式
水 生 生 物 学 报
ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA
Vol. 35, No.3 May, 2011
DOI: 10.3724/SP.J.1035.2011.00393
PP2A-Aα/β 在金鱼及斑马鱼发育中的分化表达模式
刘 姣 1* 付淑君 1* 胡雯峰 1 刘方元 1 傅永明 1 刘文彬 1 肖亚梅 1 刘 筠 1 李万程 1,2 唐鸿钊 1
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9 种组织中也有较强表达且在大脑中表达最强 , 但 在其他组织中和 PP2A-Aα 的表达存在一定的差异 : 在其他组织中 PP2A-Aβ 基因 mRNA 表达水平差别不 大 , 卵巢和肾脏表达水平相近约为大脑的 70%, 略 高于肝脏、精巢、鳃、鳍和肌肉 , 心脏中表达最低 为大脑表达量的 37%(图 1)。在斑马鱼 9 种组织中 , PP2A-Aα 在大脑中表达水平最高 , 其次为精巢是大 脑表达量的 71%略高于卵巢、心脏和鳍 , 肝脏和肌 肉中的表达明显较低为大脑表达水平的 40% 左右 , 肾 脏 和 鳃 表 达 最 低 仅 为 大 脑 表 达 水 平 的 26%; PP2A-Aβ 在斑马鱼大脑中表达水平最高 , 卵巢次之 , 肌肉和精巢稍低 , 心脏和鳍中表达水平明显下降为 大脑中的 40%, 肾脏和鳃中只有微弱表达仅为大脑 表达水平的 4%—10%(图 2)。 2.2 PP2A-Aα/β 在金鱼、斑马鱼 9 种组织中蛋白水 平的差异性表达 本实验通过 Western Blot 检测了 PP2A-Aα/β 基 因在金鱼、斑马鱼 9 种组织中蛋白水平的表达情况 (图 3、图 4)。利用灰度分析软件 Un-Scan-It gel 6.1 对图 (A) 进行半定量分析 , 通过计算得到泳道中特 定基因与对应 β-actin 的灰度比值 , 并据此绘出基因 表达的柱型图图 (B)。 实验结果表明 , Western Blot 检测到蛋白表达水 平上 PP2A-Aα/β 基因在金鱼、斑马鱼各组织中的表 达情况相近 : 在各组织中均有表达 , 其中肝脏、精 巢、大脑中的表达水平相对较高 ,精巢中的表达比卵 巢中强 , 肾脏中只检测到较微弱表达 , 各组织间的
发育生物学研究领域中的模式生物——综述
发育生物学研究领域中的模式生物——综述摘要：模式生物在生命科学研究中有重要的作用，不仅能回答最基本的生物学问题，对人类的疾病治疗也有借鉴意义。
近年来随着分子生物学、发育生物学的发展及功能基因组计划的开展，模式生物的作用便显得越来越重要。
目前公认的用于生命科学研究的常见模式生物有噬茵体、大肠杆茵、酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、拟南芥等。
这8种常用模式生物对生命现象的揭密和人类疾病治疗的探索等都所做出了重大贡献。
对其在生命科学研究中的历史轨迹、各自优势、技术手段、热点研究、发展前景等系统而又简要的了解，有助于具体而又生动地体察到模式生物在今天生命科学发展中的重要地位和推动生命科学及医学进步的不可替代的巨大潜力。
关键词：模式生物；发育生物学；分子生物学；功能基因组；引言：在生物学发展之初，人们发现如果把关注的焦点集中在相对简单的生物上则发育的现象难题可以得到部分解答。
因为这些生物的细胞数量更少，分布相对单一，变化也较好观察。
并且由于进化的原因，细胞生命在发育的基本模式方面具有相当大的同一性，所以利用较低等级的物种来研究发育的共通规律是具有一定的可行性。
尤其是当我们在有不同发育特点的生物中发现共同的形态形成和变化特征时，就可以以此来建立发育的普遍原理，因此这种生物就显得尤为重要，我们称之为“模式生物”。
模式生物作为研究材料不仅能回答生命科学研究中最基本的生物学问题，对人类一些疾病的治疗也有借答意义。
目前，在重要杂志上刊登的有关生命过程和机理的重大发现，大多都是通过模式生物来进行研究的，常见的模式生物有病毒中的噬菌体(Bacteriophage)，原核生物中的大肠杆菌(Escherichia coli)，真菌中的酿酒酵母(Sacharo mycescerevisiae)，低等无脊椎动物中的秀丽新小杆线虫(Caenorhabditiselegans)，昆虫纲的黑腹果(Drosophilamelanogaster)，鱼纲的斑马鱼(Danio rerio)，哺乳纲的小鼠(Mus musculus)以及植物中的拟南芥(Arabidopsisthaliana)等。
斑马鱼简介
它是发育生物学家的得力助手，是医学研究的后起之秀，是环境监测的哨兵，是指示兵，是药物研发的新宠，它就是脊椎类模式动物明星斑马鱼（zebrafish，Danio rario）。
一、斑马鱼基本特点：原产地：热带淡水鱼，原产于喜马拉雅山南麓的印度、巴基斯坦、孟加拉和尼泊尔等南亚国家。
成鱼体长3-100px，略呈纺锤形，头小而稍尖，吻较短，身躯玲珑而纤细，因其体侧具有像斑马一样纵向的暗蓝色与银色相间的条纹而得名。
http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DEVO_03/ch03f09.jpg 斑马鱼是体外受精发育，胚体透明。
胚胎发育快，受精后3天左右孵化出膜，天左右开口进食，约3个月达到性成熟，寿命可达2年以上。
斑马鱼可常年产卵，繁殖周期3-4天，一对成年斑马鱼每次可产卵200-300枚，受精率通常在70%以上。
养殖温度一般在23-31℃，15℃左右仍可存活，最佳养殖温度在25-28摄氏度之间，pH值在6.8~7.8，硬度在2~6之间。
二、斑马鱼作为模式生物的起源和发展1938年，美国布朗大学Roosen-Rung教授首次报道斑马鱼发育形态学研究成果。
1950年代，美国罗格斯大学K. Kenneth Hisaoka教授首次报道斑马鱼毒理学研究成果。
1972年，美国俄勒冈大学George Streisinge教授开始斑马鱼发育生物学研究和模式动物建立工作。
1989年，美国俄勒冈大学Monte Westerfield教授出版斑马鱼研究圣经The Zebrafish Book第一版。
1998年，首个斑马鱼模式生物数据库ZFIN成立（）。
1998年，全球第一家斑马鱼药物研发服务外包公司成立。
2004年，斑马鱼国际资源中心（ZIRC）在俄勒冈大学成立。
2007年，美国环境保护署（EPA）将斑马鱼技术列入其转化毒理学研究项目ToxCast TM。
2009年，斑马鱼药物毒理学评价技术首次通过FDA和EMA的GLP认证，这标志着斑马鱼模型的安全药理学和毒理学评价结果可以作为正式材料纳入临床试验申报资料。
细菌脂多糖处理对斑马鱼免疫球蛋白亚型表达水平的影响
细菌脂多糖处理对斑马鱼免疫球蛋白亚型表达水平的影响王志平;胡庆玲;郝转【摘要】The healthy zebrafish were immersed in 20μg/mL LPS solution for 24 h ,and the expressions of IgM ,IgD and IgZ were analyzed by real‐time fluorescent quantitative PCR .In the control group ,the ex‐pression levels of IgZ and IgD were similar ,lower than that of IgM ,indicating a possible heighted role for the IgM isotype .After LPS challenge ,the expression of all Ig isotypes was significantly increased with a peak in 12 h .However ,the increase range of IgM and IgZ significantly exceeded that of IgD ,and their ex‐pression remained higher level than that in the control until24h ,indicating that IgM and IgZ played more important immunological role in response to antigen invasion .Moreover ,IgM up‐regulated its expression a bit more rapidly than IgZ did ,hinting at the clue that the humoral immune system might respond to LPS challenge a bit faster than the mucosal immune system .%以20μg／mL的细菌脂多糖溶液对斑马鱼进行浸泡处理24 h ，用实时荧光定量PCR技术分析斑马鱼IgM、IgD和IgZ基因表达水平的变化。
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斑马鱼(Danio rerio)胚胎免疫反应：补体基因在早期胚胎以及LPS刺激胚胎中的表达李宗耀;杨雨佳;张士璀;汲广东【摘要】以模式生物斑马鱼(Danio rerio)为研究对象,使用原位杂交及实时荧光定量PCR方法,对斑马鱼补体基因(C3,C4,C9,Bf1,Bf2,Bf3)及其调节因子(RCA2.1,RCA2.2)在早期胚胎中的时空表达模式及LPS刺激后表达量的变化进行了研究.结果表明,上述基因在胚胎早期(卵裂期至体节期)均为泛表达,从受精后24h至幼鱼阶段特异性表达于肝脏及消化道等器官.对胚胎显微注射LPS后,C3、C9、Bf1、Bf2、Bf3基因在早期胚胎中表达上调,RCA2.1基因表达下调,这与斑马鱼成鱼受到革兰氏阴性菌感染后补体分子(C3,C9,B因子等)的反应类似,表明其参与补体激活途径、溶膜途径及补体调节,提示斑马鱼可在胚胎发育早期构建补体系统,参与急性期反应等免疫反应.【期刊名称】《海洋与湖沼》【年(卷),期】2015(046)006【总页数】7页(P1444-1450)【关键词】补体;斑马鱼;胚胎;LPS;表达模式【作者】李宗耀;杨雨佳;张士璀;汲广东【作者单位】中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛 266003;中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛 266003;中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛 266003;中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛266003【正文语种】中文【中图分类】Q786斑马鱼(Danio rerio)是脊椎动物的模式生物,与大多数鱼类相似,均为体外受精并发育。
在胚胎发育过程中,鱼卵暴露于水中,同水中大量的病原微生物直接接触。
这就引出一个问题,鱼类胚胎在发育过程中是如何保护自身免受外源微生物入侵的？鱼类的特异性免疫于脊椎动物中发育程度较低,免疫球蛋白种类和数量均有限,已有的研究表明,与鱼类特异性免疫相关的基因(Rag2,AID,TCRAC,IgLC-1,mIg,sIg,IgZ和DAB)直到胚胎受精后8天才对LPS诱导有强烈反应(Li et al,2011),说明在胚胎发育早期,特异性免疫尚未成熟,非特异性免疫尤其是补体系统在胚胎发育中的构建对其抵御外界病原体的入侵具有重要的意义。
补体系统由 30多种可溶蛋白及膜蛋白构成,在机体非特异性免疫及特异性免疫防御中均起到重要的作用,例如,可以参与细菌裂解,免疫调理、免疫粘附和炎症介质等一系列反应。
在这些反应过程中,补体可以通过三条途径激活: 经典途径,凝集素途径和替代途径。
经典途径由抗原抗体复合物激活 C1q,C1q进一步激活 C1r、C1s,裂解 C4形成 C4b,同时与被酶解的C2结合形成C3转化酶C4b2a,C4b2a活化C3,激活过程需要Ca2+及Mg2+。
凝集素途径类似经典途径,始于甘露糖结合凝集素(MBL)活化,进一步活化C4及C2成分,产生C3转化酶C4b2a,过程仅需Mg2+参与(Leslie et al,2013)。
替代途径无需C1、C2、C4成分,可由细菌脂多糖、肽聚糖等活化C3,形成的C3b同B因子结合形成C3转化酶C3bBb,仅需Ca2+参与(Boshra et al,2006)。
上述C3转化酶可裂解C3为C3b,C3b同C3转化酶结合,形成C5转化酶,后共用一套终末途径,即 C5转化酶裂解 C5形成的C5b顺次与C6,C7,C8以及C9结合形成攻膜复合体引起细胞溶解(Kuo et al,2000)。
随着对鱼类补体系统的研究已日益深入,鉴定了大量的补体蛋白和基因,研究了鱼类补体的信号通路,发现在鱼类中存在较为完备的补体系统。
鱼类的补体系统同其他脊椎动物相比,具有更低的耐热性,如虹鳟、罗非鱼等鱼补体在 40—50°C即可灭活(Sakai,1981),而哺乳动物通常需要更高温度;由于基因组复制,具有多个 C3、C4、Bf/C2、C5、C7、MBL、B因子和I因子亚型(Holland et al,2002),近来亦有研究鉴定出了斑马鱼的H因子(Sun et al,2010)、RCA2.1、RCA2.2 (Wu et al,2012)等补体调节因子基因。
许多研究已经表明成体鱼类的补体系统分子功能与哺乳动物的类似,但补体系统在鱼类早期胚胎发育中的功能研究较少。
补体及其调节因子在早期胚胎发育中的表达模式,以及早期发育的胚胎对外来免疫原刺激的反应报道较少。
因此研究鱼类早期胚胎发育过程中补体系统的功能对鱼类免疫系统发生及水产苗种抗病繁育和养殖等都具有重要的理论意义和实用价值。
由于 C3、C4、C9、Bf/C2是补体反应和膜攻击阶段非常重要的分子,其中 C3为三条激活通路所共同经过的核心因子,更是调节蛋白作用的核心因子之一;C4为经典及凝集素激活途径反应必须的重要因子;虽然在鱼类中Bf/C2不能相互区分为C2及B因子,但其多种亚型在不同通路中均是构成 C3转化酶的关键分子;C9是攻膜复合体中形成孔洞来裂解细胞的重要分子;而RCA2.1、RCA2.2可以通过作用C3转化酶调控补体反应的强度。
本文用胚胎整体原位杂交技术研究了斑马鱼补体 C3、C4、C9、Bf/C2及其亚型、补体调节因子RCA2.1、RCA2.2基因在早期胚胎中的表达模式;利用实时荧光定量 PCR技术,对 LPS刺激下胚胎各补体基因表达量的变化进行了研究,以期为斑马鱼早期胚胎发育过程中补体系统的构建及形成机制,提供理论依据。
1 材料与方法1.1 实验动物斑马鱼本实验选用的 4—10月龄野生型斑马鱼购自青岛市南山水产市场。
斑马鱼饲养水温为28°C,自然光周期处理,每日投喂两次饵料。
成熟斑马鱼按照雌雄比例2: 1配鱼,给予光照刺激,促使斑马鱼交配产卵。
收集鱼卵后,使用胚胎培养液(MgSO4·7H2O 0.163 mg/mL,KCl 0.03 mg/mL,NaCl 1mg/mL,CaCl2 0.04 mg/mL)在28°C 下自然光周期培养。
1.2 斑马鱼胚胎总RNA提取及cDNA制备在9个时期(4cell,3hpf,5hpf,10hpf,15hpf,24hpf,48hpf,72hpf,96hpf)中,每个时期取25个胚胎,加入1mL TRIZOL 研磨,存–80°C 备用。
使用总RNA提取试剂盒(Total RNA Kit I,OMEGA),按照说明书提取胚胎总RNA。
使用反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser,TaKaRa)制备反转录体系,于 PCR仪中对总 RNA进行反转录,得到 cDNA 模板,保存于–20°C,以备目的基因片段的扩增。
1.3 斑马鱼补体基因片段克隆从NCBI网站(http: ///)获取相关基因信息,依据各基因片段使用 Primer Premier program (version 5.0,Canada)设计引物,表1为引物信息。
表1 补体基因原位杂交实验用引物Tab.1 Primers of complement genes used for in situ hybridizationGene NCBI Reference Sequence Forward primer C3 NM_131243.1 GGACAAGCCCATCTACACG C4 XM_005157372.2 AAGCCAGATTGCGGGACA C9 XM_005171868.2 TGAGACAAAGGTGGAAGAGAG Bf1 XM_009291351.1 GCAGCCGCTTGATTTACC Bf2 XM_005161333.1 TACTTGCACTGATATGTCCTCTC Bf3 NM_001083858.1CCTCTCATAATAGGTGCACCACCC RCA2.1 NM_001013494.2 TGATTTCGTTGAGGGTTGTAG RCA2.2 XM_688820.7 AGGGTTATTTATTGGCATCG Reverse primer TCCTCCCTTTCCATCAACC TGGGAGAAATGCCAACAGC TGGCAGAATGGTGATGGT GGCGACCTTCTTCAACCT CCCATGCTGATCATCTTCAAACC ACATTGTGGCTCTGTTCCTGAC TTGATTGACAGTATTCCAGCAT AATATTGCAAAGTTATGGAAGC以上述cDNA为模板,PCR反应扩增补体相关基因片段。
反应体系: 向 0.2mL PCR 管中加入5μL 10×Ex buffer (Mg2+),1μL cDNA (50 ng/μL)模板,引物各1.5μL (20 mmol /L),4μL dNTP (10mmol/L),0.25μL Ex Taq DNA 聚合酶,用三蒸水将体系补至50μL;PCR反应的程序为: 95°C预变性5min;95°C变性30s,55—60°C 退火30s,72°C 延伸 30—60s,35个循环;72°C延伸7min。
反应结束后取4μL PCR产物进行琼脂糖(1%)凝胶电泳,观察结果,并进行PCR产物纯化。
1.4 基因探针合成将纯化片段连接到PGEM-Teasy载体中,然后转化到大肠杆菌感受态细胞(Trans5α,TransGen)中进行克隆,通过蓝白斑筛选和菌落PCR挑选阳性克隆,提取质粒DNA (Plasmid Mini Kit I,OMEGA),并测序。
在确定扩增序列正确及插入载体方向后,选择反义探针和正义探针的酶切位点。
完全切开并纯化后,以其为模板转录合成地高辛标记的 RNA探针[DIGRNA Labelling Kit (SP6/T7),Roche]。
1.5 原位杂交取上述发育阶段(4cell,3hpf,5hpf,10hpf,15hpf,24hpf,48hpf,72hpf,96hpf)的斑马鱼胚胎和幼鱼,对胚胎进行剖膜。
然后在上述样品中加入 4%多聚甲醛固定,置–4°C 过夜。
参照 Thisse等(2007)方法进行实验。
具体如下:取上述固定胚胎用2×PBST溶液复水,用蛋白酶K消化后,将胚胎置于杂交炉中65°C预杂交 4h,后加入预热的反义RNA探针70°C杂交过夜(约 16h)。
第 2天回收探针,用梯度 SSCT溶液清洗胚胎,室温下加入含有5%山羊血清的PBST封闭2h,后加入0.05%anti-Dig-AP (Roche)浓度的封闭液室温放置 3h。
用2×PBST溶液清洗未结合的抗体,用Coloration Buffer清洗胚胎,后用2% NBT/BCIP的Detection Buffer显色液,在黑暗中显色。