免疫共沉淀Co-Immunoprecipitation的实验操作流程

免疫共沉淀所需试剂：

1、Protein A 与Protein G 的选择：

（1）Rabbit 来源的抗体的使用Protein A

（2）大部分Mouse 来源的抗体Protein A 与Protein G 均可使用，但是mouse IgG1 和mouse 多抗来源的抗体必须使用Protein G

2、细胞裂解液：

Tris-triton：40mM Tris

120mM NaCl

1%Triton X-100

Tris-triton：50mM Tris

150mM NaCl

1%Triton X-100

Tris-NP40：50mM Tris

150mM NaCl

1% NP40

（该裂解液用于普通IP ）

HEPES-CHAPS ：40mM HEPES

120mM NaCl

0.3% CHAPS

（该裂解液用于mTOR 复合物的特殊蛋白与蛋白间的IP ）

对于核蛋白，Thermo有不破坏蛋白生物活性的提取核蛋白的试剂盒（PIERCE 78833，78835），但所得的蛋白为高渗溶液，直接做CO-IP会造成假阳性，需用透析管或透析卡透析后，方可用于后续实验。

使用时均加入:

1mM的NaF （200×）200mM NaF

1mM的Na3 VO4 （200×）200mM Na 3 VO4

1×Cocktail （50×）Cocktail

可选择性加入：EDTA

PMSF

七、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）

1. 裂解细胞：取两盘长的较满的细胞，放在冰上，用冰的PBS 洗3 遍，吸净剩余的PBS 残液，加入1ml 的细胞裂解液，在冰上晃动30min ，最后用细胞刮刮取，收集细胞裂解液到两个EP管中（必要时快速过1ml的注射器针头）；

2. 离心：14000g，4°C ，离心15min 。离心空当时( 以每ml裂解液入40ul

的protein A 或protein G)，用上述的细胞裂解液1ml洗涤protein A 或protein

G ，洗涤3 次，放入冰箱备用；

3. Pre-clear ：吸取上清液每管50-100ul 到新的EP管中，作为Input，放入冰箱-20°C备用，将剩余的上清液吸入含有预处理过的protein A 或protein G 的EP管中，做pre-clear （去除与protein A 或protein G 非特异结合的蛋白），在4°C 摇床上反应1h；

4. 离心：快速离心20-30s ，使protein A 或protein G 沉淀下来，吸取上清到新的EP管中，弃去protein A 或protein G ；

5. 抗体反应：加入相应的抗体及同源的对照抗体，4°C 摇床过夜；

6. 加入新的预处理过的protein A 或protein G ：4°C 摇床上反应1h；

7. 离心：快速离心30s 使protein A 或protein G 沉淀，弃上清，用裂解液洗涤protein A 或protein G 3 次。最后用细枪头将裂解液尽量的去除干净；

8. 蛋白变性：加入1×loading buffer 50-100μl ，95°C煮10min ，同时可将Input加入loading buffer 一起煮，使蛋白变性；

9. 将上清液吸入新的的EP管中，待测；

10. We s t e r n检测（同western blot 过程）。