单抗制备流程2
单抗生产工艺及原理
单抗生产工艺及原理
单抗生产工艺是指生产单克隆抗体的过程，其主要原理是利用免疫学技术和生物工程技术，通过体外培养和筛选，获得具有高度特异性和亲和力的单克隆抗体。
单抗生产工艺一般包括以下几个步骤：
1. 免疫动物：将抗原注射到动物体内，刺激其免疫系统产生抗体。
一般采用小鼠或兔子作为免疫动物。
2. 细胞融合：将免疫动物的脾细胞与肿瘤细胞（如骨髓瘤细胞）进行融合，形成杂交瘤细胞。
3. 筛选：通过筛选技术，筛选出具有高度特异性和亲和力的单克隆抗体阳性细胞系。
4. 克隆化培养：将单克隆抗体阳性细胞系进行克隆化培养，使其快速增殖并产生大量单克隆抗体。
5. 分离纯化：将培养液中的单克隆抗体分离纯化，得到高纯度的单克隆抗体。
6. 制剂：将单克隆抗体进行制剂处理，如灭菌、稀释等，制备成最终产品。
单抗生产工艺的关键在于筛选出具有高度特异性和亲和力的单克隆抗体，这需要利用免疫学技术和生物工程技术，结合细胞融合和克隆化培养等手段，进行高效的筛选和纯化。
单抗生产工艺的成功应用，为单克隆抗体的广泛应用提供了
重要的技术支持。
单克隆抗体的制作流程
单克隆抗体的制作流程一、前期准备工作1. 确定目标抗体：根据研究需求确定需要制备的单克隆抗体。
2. 筛选免疫原：选择适合的免疫原，如蛋白质、多肽、细胞等。
3. 动物选择：选择适合的动物，如小鼠、大鼠、兔子等。
4. 免疫计划设计：设计出合理的免疫计划，包括免疫剂量、次数、间隔时间等。
二、免疫过程1. 免疫原制备：将所选的免疫原纯化或合成后进行检测和确认。
2. 免疫动物注射：将免疫原与佐剂混合后注射到动物体内，按预定计划进行多次注射。
3. 血清采集：在最后一次注射后采集动物血清，检测抗体滴度是否达到预期水平。
三、杂交细胞制备1. 细胞系选择：选择适合的细胞系如SP2/0或NS0等。
2. 细胞培养：将细胞系培养至稳定生长状态，并进行筛选和确认。
3. 细胞融合：将免疫小鼠脾细胞与SP2/0或NS0细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤筛选：利用HAT培养基对杂交瘤进行筛选，筛选出产生单克隆抗体的杂交瘤。
四、单克隆抗体制备1. 单克隆细胞培养：将单个杂交瘤细胞进行单克隆分离和培养。
2. 单抗酶标法检测：利用ELISA等技术检测单克隆抗体的特异性和亲和力。
3. 大规模培养：将筛选出的单克隆细胞进行大规模培养，得到足够多的单克隆抗体。
4. 纯化和鉴定：通过亲和层析、离子交换层析等技术对单克隆抗体进行纯化，并进行质量鉴定。
五、应用1. 体外实验应用：如ELISA、Western blotting等技术中作为检测试剂使用。
2. 体内实验应用：如流式细胞术、组织切片染色等技术中作为荧光标记或特异性结合试剂使用。
3. 临床应用：如治疗肿瘤、自身免疫性疾病等方面的治疗药物。
六、总结单克隆抗体的制备流程包括前期准备工作、免疫过程、杂交细胞制备、单克隆抗体制备和应用等环节。
其中，前期准备工作和免疫过程是制备成功的关键，而单克隆抗体制备需要经过多次筛选和鉴定才能得到高质量的单克隆抗体。
单克隆抗体在医学和生命科学领域有着广泛的应用前景，对于推动科学发展具有重要意义。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）是指由单一B细胞克隆分离得到的抗体，其具有高特异性和高亲和力。
制备单克隆抗体的方法主要有杂交瘤技术和重组DNA技术。
以下是单克隆抗体制备的步骤及注意事项。
步骤一：抗原免疫1.选择合适的抗原：根据需要检测的分子或细胞表面标志物，选择合适的抗原。
2.免疫动物：常用的动物有小鼠、兔子等。
选择适合的动物后，根据抗原的种类和免疫动物对该抗原的敏感性，设计免疫方案。
3.免疫计划：免疫计划包括免疫剂量、免疫途径和免疫次数等。
通常先进行原位免疫，然后再以单体或混合抗原进行体内免疫。
步骤二：细胞融合1.收集脾细胞：在最佳时期，解剖免疫动物，取出脾脏。
2.细胞培养：将收集的脾细胞在无菌条件下分散成单个细胞，并在培养基中培养，以供细胞融合使用。
3.准备骨髓瘤细胞：选择合适的骨髓瘤细胞，例如NS0或SP2/0等。
将其培养至对数生长期。
4.细胞融合：在抗原刺激下，将脾细胞与骨髓瘤细胞以一定比例混合，用聚乙烯醇或其他化合物促进细胞融合。
步骤三：细胞筛选与扩展1. HT增重培养：用含有hprt缺陷的培养基筛选融合细胞，以选择杂交瘤细胞。
2. Limited Dilution扩展：以一细胞一孔的方式将杂交瘤细胞进行有限稀释，使其实现单克隆化。
3.细胞培养：将单克隆细胞株移植到培养瓶中，进行培养和扩增。
步骤四：单克隆抗体鉴定1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：用ELISA方法筛选单克隆细胞株，检测其抗原特异性。
2.免疫组织化学检测：将单克隆抗体应用于细胞和组织切片，检测其在特定细胞或组织中的反应。
3.流式细胞术：通过流式细胞仪检测单克隆抗体与特定细胞表面标志物的结合情况。
步骤五：单克隆抗体生产与纯化1.细胞培养：将单克隆细胞株培养扩增至一定程度。
2.抗体收集：将培养上清液进行抗体收集。
3.纯化与浓缩：利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等技术，对抗体进行纯化和浓缩。
单抗制备步骤及注意事项
单抗制备步骤及注意事项
一、炸药的制备步骤
第一步：配置原料
配置炸药的原料需要根据成品的要求来进行，不同炸药原料的浓度需
要根据不同要求进行调整，在比例配置完成后，进行细微的调整，以确保
最终制备的炸药具有最佳的性能。
第二步：切削加工
将粉末原料放入切削机中，在经过一系列的切削加工后，以细微的粉
末状态释放到搅拌缸中，以保证原料的包覆度和流动性。
第三步：搅拌拌和
将原料从搅拌机中放入搅拌缸中，并加入水蒸汽搅拌和，直至原料能
够形成均匀的湿粉末，以此来保证炸药最终成型、装填后能够获得最佳性能。
第四步：成型
将拌和好的湿粉末倒入到成型模具中，按照要求压制成型，将其制成
规格的形状，放入冷却箱中进行冷却，以保证温度可以调整到最佳值，最
终获得最佳的性能参数。
第五步：装填
将冷却好的炸药片放入装填机中进行装填，经过装填机的装填处理后，炸药片形状不会受到外界影响，完成装填，将炸药片放入压力和温度控制
的室中进行烘干，以确保炸药片的稳定性。
二、炸药的抗制备前的注意事项
1、配置原料时，应精确到毫克，以确保炸药性能的最佳；
2、在进行切削加工时。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程单克隆抗体是一种来源于单一B细胞克隆的抗体，具有高度的特异性和亲和力，被广泛应用于生物医药领域。
其制备流程主要包括免疫原制备、动物免疫、细胞融合、筛选和鉴定等步骤。
下面将详细介绍单克隆抗体制备的流程。
1. 免疫原制备。
首先需要准备纯化的抗原蛋白，可以是蛋白质、多肽、细胞膜蛋白等。
抗原蛋白的纯度和活性对单克隆抗体的制备至关重要，因此需要进行严格的纯化和活性检测。
通常采用亲和层析、离心、电泳等方法进行抗原蛋白的提取和纯化。
2. 动物免疫。
将纯化的抗原蛋白注射到小鼠或兔子等动物的体内，诱导其产生特异性抗体。
在免疫过程中，需要注意控制免疫程序，监测抗体滴度，以及合理调整免疫方案，以提高单克隆抗体的产量和质量。
3. 细胞融合。
从免疫动物中获取脾细胞或骨髓细胞，与骨髓瘤细胞（如SP2/0、NS-1等）进行融合，得到杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有较高的产抗体能力，能够长期稳定地分泌单克隆抗体。
4. 筛选和鉴定。
通过ELISA、免疫印迹、细胞免疫荧光等方法对杂交瘤细胞培养上清液进行筛选和鉴定。
筛选出特异性较强的单克隆抗体阳性杂交瘤细胞，并进行亚克隆的鉴定，最终获得单克隆抗体细胞株。
5. 扩大培养和纯化。
将筛选出的单克隆抗体细胞株进行扩大培养，获得大量的单克隆抗体上清液。
然后采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等方法对单克隆抗体进行纯化，获得高纯度的单克隆抗体制剂。
总结。
单克隆抗体制备流程是一个复杂而又精细的过程，需要在每个环节都严格控制条件，确保单克隆抗体的产量和质量。
通过上述步骤的实施，可以获得高效、高纯度的单克隆抗体，为生物医药领域的研究和应用提供有力支持。
简述单克隆抗体的制备过程
简述单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的制备过程主要分为以下几个步骤：
1. 免疫原制备：首先需要准备免疫原，即待检测的抗原物质。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类等各种生物分子。
在免疫原制备的过程中，需要注意选择合适的纯度、稳定性、活性等因素，并对其进行适量的处理和加工，以确保其具有较好的免疫原性能。
2. 动物免疫：将免疫原注入到动物体内（如小鼠、兔子等），让其自身免疫系统产生抗体。
免疫的方式可以是皮下、腹腔或肌肉注射等，不同的免疫方式会对抗体的种类和数量产生影响。
此外，需要注意控制免疫过程中的免疫原剂量和免疫频率，以免对动物造成损伤。
3.细胞融合：在免疫后，从免疫动物的脾脏等免疫器官中抽取免疫细胞（主要是B细胞）和肿瘤细胞进行细胞融合（如用聚乙二醇等），以形成杂交瘤细胞。
由于肿瘤细胞具有无限增殖能力，可以保证后续获得足够的单克隆抗体。
4.筛选单克隆：在进行细胞融合之后，需要进行筛选并获得单克隆抗体。
筛选包括对细胞培养物中的单克隆进行筛选和鉴定，主要有免疫荧光筛选、酶联免疫吸附测定、流式细胞术等方法。
在筛选过程中，需要对单克隆进行鉴定，包括对其亲和力、特异性、精确度等性质进行测定。
5.大规模生产：最后，需要进行大规模单克隆抗体的生产。
通常
采用的是培养杂交瘤细胞，以获得足够的单克隆抗体。
在培养过程中，需要注意细胞培养条件和产物提取方法，以保证单克隆抗体的质量和
效能。
总之，单克隆抗体的制备过程相当复杂且耗费时间，需要经过多
个环节的把控。
最终获得的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，可
以被广泛应用于生命科学、医药等领域。
单抗制备步骤及注意事项
单抗制备步骤及注意事项脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：•免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B 淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：•常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
•骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
•骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
•一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
•一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
•保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
单抗制备的详细步骤
单抗制备的详细步骤单抗（monoclonal antibody）是由单一细胞母克隆细胞系产生的抗体，具有高度特异性和一致性。
单抗制备的过程通常包括免疫原的选择、动物免疫、细胞融合、克隆筛选和克隆扩增等步骤。
下面将详细介绍这些步骤。
第一步，免疫原的选择。
免疫原是制备单抗必不可少的关键组成部分。
免疫原的选择应基于目标抗体的特异性和重要性。
常用的免疫原包括蛋白质、多肽、多糖、细胞表面分子等。
为了提高免疫原的免疫原性，可以将免疫原与佐剂混合，以增强其免疫原性。
第二步，动物免疫。
将选择的免疫原注射到合适的动物体内。
常用的免疫动物包括小鼠、大鼠、兔子等。
在免疫过程中，通常需要多次免疫，在每次免疫之间有一定的间隔时间，以增强免疫效果。
在免疫的过程中，可以通过采血检测免疫反应的进展，并决定最佳的免疫时间点。
第三步，细胞融合。
在免疫过程中，免疫细胞会产生针对免疫原的抗体。
为了制备单抗，需要将这些抗体产生的免疫细胞与癌细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
常用的癌细胞包括骨髓瘤细胞、葡萄膜炎细胞等。
第四步，克隆筛选。
将细胞融合密度适宜的细胞悬浮液均匀分配到培养皿中，使单个杂交瘤细胞分布在不同的培养皿中。
培养皿中含有特定选择性培养基，使只有杂交瘤细胞能够存活和生长。
在适当的条件下，杂交瘤细胞会形成一个细胞克隆。
然后，可以通过ELISA、细胞培养和动物注射等方法对克隆的细胞上清液进行筛选，以检测是否含有特定的抗体。
第五步，克隆扩增。
通过继续培养和传代，可以扩增含有特定抗体的细胞克隆。
克隆扩增的时间可能需要数周或数月，具体取决于细胞系的生长速度和特性。
最后，可以将克隆扩增的细胞培养液进行纯化和浓缩，以获得高纯度的单抗。
通常使用亲和层析、离心、电泳等技术进行单抗的纯化。
单抗制备的最终产品可以用于医学研究、诊断和治疗等领域。
尽管以上步骤可以概括标准的单抗制备过程，但实际制备中可能因为不同的实验目的和具体需求而存在一些变化。
制备单抗是一个复杂而耗时的过程，需要专业的实验技术和丰富的经验。
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单克隆抗体制备标准化操作方案第一章小鼠免疫小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证。
好的免疫效果：血清效价达一万以上，脾脏粘连且大小是正常鼠的两倍以上。
小鼠的选择：选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠，鼠龄在8～12周。
为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。
免疫原：免疫原的纯度一般并不重要。
但有时免疫原纯度也会造成很大影响，若杂质存在使免疫反应减弱，或筛选方法不能区分对特意性成分反应的抗体及对杂质反应的抗体，以及有些抗原的免疫原性十分强，即便痕迹量的存在，也会影响对所识别抗原的免疫反应。
上述诸情况下使用纯化抗原会更有利。
常用的免疫方案：（一）可溶性抗原初次免疫： 50～100μg蛋白抗原加等体积福氏完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠，四周后进行第二次免疫第二次免疫：50～100μg（25～50ug，为初免剂量一半）蛋白抗原（与初免等量），加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠两周后采小鼠尾静脉血离心取血清测效价（用ELISA方法检测）效价达一万以上的小鼠融合前三天取抗原25μg（50～100ug，与初免剂量相同）加强免疫，尾静脉注射，注射体积200μl/只300ul/只，效价在一万以下的小鼠继续第三次免疫第三次免疫：50μg蛋白抗原加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠腹腔注射，注射体积500μl/只，小鼠融合前三天取抗原25μg加强免疫，注射体积200μl/只。
（二）颗粒性（细胞）抗原可用5×106~2×107细胞与完全佐剂混合，作皮下或腹腔注射，2~3周后重复一次，但佐剂改为不完全佐剂，再待2~3周后用同样剂量细胞或半量细胞静脉注射，3~4天后取脾融合。
为挑选免疫反应较好的动物进行融合，第二次免疫后10天左右应从尾部取血，检查抗体滴度。
另外，还有脾内注射法和体外培养法。
第二章饲养细胞的制备体外培养细胞时，一般单个或极少数分散状态细胞是不能存活的（或生长不良）必需加入一定量的其他细胞达一定的密度才能生长得好，加入的细胞称为饲养细胞。
用细胞融合术建立杂交瘤细胞时，饲养细胞的加入是不可缺少的，常用的有正常小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞、胸腺细胞，也有人用经过照射或丝裂霉素处理的纤维母细胞，如3T3或Putler等。
一、实验材料1.1 RPMI-1640完全培养液：具体配法见实验方法—细胞融合2.3。
1.2 HAT培养液或HT培养液：具体配法见实验方法—细胞融合2.4和2.5。
1.3 实验动物： Balb/c或昆明种健康小鼠（雌雄均可）1只，6～10周龄，体重18～ 22克，本院动物中心繁殖和饲养。
每只小鼠可取得3～5×106 的滋养细胞，可供铺6块板用，应在融合或克隆前1～2天制备。
1.4 离心机一台，血细胞计数板，无菌塑料离心管，96孔细胞培养板。
小鼠解剖台板或平皿；无菌眼科剪刀、镊子各数把；大镊子一个；止血钳两个。
一次性5ml注射器2套。
二、实验方法2.1 将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精5分钟，随即放入超净工作台内，腹部朝上放于平皿内或固定于解剖板上。
2.2 用眼科镊子夹起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外流。
然后用剪刀向上下两侧做钝性分离，充分暴露腹膜。
用酒精棉球擦拭腹膜消毒。
2.3 用注射器吸取5ml RPMI-1640基础培养液，注入小鼠腹腔，注射器停留不动，晃动小鼠或反复抽吸几次。
用原注射器抽回腹腔内液体，注入离心管。
如此反复操作3～4次。
2.4 1000rpm离心10min，弃上清。
2.5 用20～50ml完全培养液重悬细胞，100μl/孔滴加到培养板，置培养箱备用。
2.6 观察饲养细胞的生长状态，一般生长良好的饲养细胞和巨嗜细胞呈梭形或多角形、细胞透亮、折光性强。
第三章细胞融合细胞融合是人工定向制造新细胞品系的重要手段，也是制造单克隆细胞系的关键技术。
在保证有良好的亲本细胞、稳定和良好的培养体系的条件下，细胞融合的成败和融合率则取决于融合剂和操作技巧。
细胞融合的助融剂和助融手段主要有三种；生物学方法：用仙台病毒或鸡新城疫病毒作助融剂。
物理学方法：用电融合仪发出的脉冲电流使相邻的两细胞穿孔而融合。
化学方法：用聚乙二醇或血卵磷脂作助融剂。
PEG作助融剂是比较方便简单的操作方法，具体方法如下：一、实验材料1.1 眼科镊子、剪刀数把、固定板。
1.2 37℃温水。
1.3 酒精灯、离心管架、离心管、离心机、5-10ml吸管、1ml吸管、滴管、计数池、平皿数个。
二、实验试剂2.1 融合剂：50%PEG W=3000PEG3000 1gRPMI1640 1ml8-10磅灭菌2.2 基础培养液（RPMI1640）RPMI1640 一包 (10.4g)L-G （L-谷氨酰胺） 0.3gHEPES 3.0g碳酸氢钠 3.0g庆大霉素一支三蒸水加至 1000ml2.3 1640完全培养液基础培养液 180ml胎牛血清 20ml2.4 HT培养液（终浓度H为1×10-4M，T为1.6×10-5M）基础培养液 197.5mlHT浓缩液（100×） 2.5ml胎牛血清 50ml一次融合约配250毫升2.5 HAT培养液（终浓度A为4×10-7M）基础培养液 197.5mlHAT浓缩液（100×） 2.5ml胎牛血清 50ml2.6 细胞冻存液1640完全培养液 70mlDMSO 10ml胎牛血清 20ml2.7 3%醋酸溶液30%乙酸 10mldH2O 90ml三、实验步骤3.1 脾细胞制备：取加强免疫小鼠一只，眼眶采血后脱臼处死，在75%酒精中消毒后取脾脏，去除结缔组织，制备脾细胞悬液，转移到50ml离心管中，加RPMI1640至30ml，1500~2000rpm 离心5分钟，弃上清，加RPMI1640至30ml，白细胞稀释液稀释20倍，计数，取1×108个细胞待用。
3.2 骨髓瘤细胞制备：取3瓶生长状态良好的（活细胞数>95%）骨髓瘤细胞，将之完全吹下，转移到50ml离心管中，加RPMI1640至30ml，1500~2000rpm离心5分钟，弃上清，加RPMI1640至30ml，RPMI1640稀释10倍，计数，取2×107个细胞待用。
3.3 细胞混合：脾细胞:骨髓瘤=5：1，混合，1500~2000rpm离心5分钟。
注意：由于细胞融合是个随机过程，母细胞比例不一，会影响融合产物；或是两种母细胞融合而成的杂交细胞，或是一种细胞自身融合产物。
多数实验者采用骨髓瘤细胞：脾细胞＝1：5，也有人采取其他比例，如骨髓瘤细胞：脾细胞＝1：5，甚至是1：1。
减少脾细胞用量目的是降低脾细胞自身融合的机率。
3.4 细胞融合：将离心上清倒干，把沉淀细胞块弹成糊状，置37℃水浴，3.5 细胞培养：轻轻将细胞弹匀，缓缓加入HAT培养液至所需体积，将细胞重悬，轻轻地将之混匀，加到预先准备好的饲养细胞板中。
10ml吸管滴加1滴（配8ml/板），排枪滴加80~100微升（配10ml/板），37℃，CO2培养箱培养、观察。
3.6 细胞培养、换液：细胞融合后第一天开始，对细胞进行仔细观察，记录好细胞的生长状态、每孔杂交细胞瘤个数、块数、培养液有无污染、饲养细胞的状况。
培养3~5天HAT培养液换液一次，10天换HT培养液培养至20天，换1640完全培养液。
四．HAT选择培养液的作用在细胞融合时，可以出现：脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，脾细胞之间的融合，骨髓瘤之间融合，此外还有大量的未融合细胞。
如何除去大量未融合及自身融合的细胞呢？下面简介HAT液作用。
谷氨酰胺（L-Glutamine），尿核苷单磷酸都是正常细胞及肿瘤细胞用来合成DNA的重要成分（主要途径），但是这条途径可以被氨基喋呤（Aminopterin）切断。
另外还有一条应急途径即细胞内的HGPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转化酶）利用（H）和TK（胸腺嘧啶激酶）利用（T）合成DNA。
骨髓瘤细胞株是经过8-偶氮鸟嘌呤筛选出来的，不含HGPRT，因此不能借用应急途径合成DNA，只能靠主要途径合成DNA。
骨髓瘤细胞在HAT液中，因缺少HGPRT和TK，不能利用H·T 合成DNA，主要途径又被氨基喋呤阻断，因此细胞死亡。
免疫鼠脾细胞，虽含有HGPRT但不适应体外培养，一般十天左右自然灭亡。
杂交细胞，在融合时脾细胞的HGPRT被带入，通过应急途径利用H·T合成DNA，并继承骨髓瘤细胞体外繁殖的特性，所以能存活。
一般融合后常用含20%胎牛血清培养液，通过筛选，亚克隆选出有关杂交细胞后，则可换成含10%胎牛血清培养液。
对已确定的杂交瘤株，则可换成含5%胎牛血清的培养液培养。
第四章筛选分泌抗体的杂交瘤细胞融合后当杂交细胞集落生长到一定大小，培养液开始变黄，便可开始筛选抗体活性。
许多方法都可以用来筛选，但应注意到筛选单克隆抗体时的一些特点；首先，培养上清中的抗体含量低于高效抗血清的抗体含量。
其次，与普通抗血清不同，单克隆抗体不能多价地识别抗原。
所以用来筛选单克隆抗体的方法应照顾到单克隆抗体的特点，而且要准确、迅速和方便。
此外应根据所需要抗体的特点，选择不同类型的方法。
一般常用的有：免疫荧光、放射免疫（RIA）、组织化学法和酶联免疫分析（ELISA）法等。
最经常用方法是ELISA法。
在收集上清时，应在上次换液后3-4天进行，以便抗体积累。
上清可不经稀释或1：5~1：10稀释后再测抗体活性，用稀释抗体进行筛选时可以筛掉弱阳性的抗体，也可以去掉因高本底所造成的假阳性。
融合后第一次筛选出的阳性克隆可能因阴性克隆或其他阳性克隆的过度生长而丢失，故应尽早亚克隆。
第一次筛选后也可能没筛选到阳性抗体，这可能由于分泌阳性抗体的细胞为数尚少，应重复测定活性2-3次。
现将ELISA法检测杂交瘤细胞抗体的方法介绍如下：（一）实验试剂6．终止液（2M H2SO4 ）取浓H2SO4 27.62ml，缓缓加入到473ml的蒸馏水中，混匀即可。
注意在加入硫酸的过程中，不要加得太快，以免过热。
8．辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG（已商品化）。
（二）实验步骤1．抗原包被：纯抗原浓度一般为1~2μg/ml，用包被液稀释后取100μl加入聚苯乙烯酶联检测板各孔中，4℃过夜后，洗液洗涤3次。
建议4℃包被过夜2．封闭：每孔加200μl或加满封闭液，4℃过夜或37℃两小时后，洗涤3次，拍干。
置4℃冰箱保存备用。
3．ELISA检测（1）加待测样品：检测融合板时，无菌条件下取细胞上清，50~100μl/孔加样到包被好的酶标板中，同时，每板分别选取无细胞生长的两孔为阴性对照，另选取无细胞生长的两孔加入阳性血清作为阳性对照；检测血清或腹水效价时，对血清或腹水做倍比稀释，100μl/孔，以正常小鼠血清为阴性对照，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干。