淋巴细胞杂交瘤克隆抗体技术
杂交瘤技术制备单克隆抗体
杂交瘤技术制备单克隆抗体1975年Koehler和Milstein在体细胞融合技术的基础上创立了淋巴细胞杂交瘤（hybri-doma)技术，他们将丧失合成次黄嘌吟-鸟嘌吟磷酸核糖转移酶的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞举行融合，融合的细胞不仅可以延续传代，而且能分泌抗绵羊红细胞的单克隆抗体，这项技术开创了医学与生物学基础讨论的新纪元。
杂交瘤技术具有周期长，高度延续的特点，涉及大量组织细胞培养，细胞免疫学和免疫化学等办法。
一、杂交瘤技术的原理 B淋巴细胞接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，是重要的体液免疫细胞。
B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再举行细胞分裂。
骨髓瘤细胞是恶性增殖的转化细胞，通过细胞融合技术将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，所产生的融合细胞既具有亲本骨髓瘤细胞的无限繁殖的生物学特性，又具有另一亲本B淋巴细胞合成、分泌特异性抗体的能力。
B淋巴细胞杂交瘤技术的原理可以从以下三个关键之处来阐明：首先是细胞融合剂的挑选，用法细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于互相粘连而融合在一起。
最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。
（PEG1000～2000）是目前最常用的细胞融合剂，普通应用浓度为40% (W/V)。
第二，细胞融合的挑选培养基中有3种关键成分：次黄嘌呤( hypoxanthine, H )、甲氨蝶吟( aminopterin, A）和(thymidine, T )，所以取三者的字头称为HAT培养基。
甲氨蝶吟是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT-细胞株，所以不能在该培养基中生长。
惟独融合细胞具有亲代双方的遗传性能，能在HAT培养基中长久存活与繁殖。
第三，细胞融合是随机的过程，在已经融合的细胞中有相当比例的无关细胞的融合体，需经筛选去除。
筛选过程普通分为两步举行：一是融合细胞的抗体筛选，二是在此基础上举行的特异性抗体筛选，从而找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后举行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养，这一过程称作克隆化。
杂交瘤细胞
杂交瘤技术杂交瘤技术（hybridoma technique）即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。
它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。
克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。
这一技术的基础是细胞融合技术。
骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。
如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。
杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。
这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。
在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
其原理从下列3个主要步骤阐明。
(一)细胞的选择与融合建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。
脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。
融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。
·选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。
多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。
使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。
最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。
单克隆抗体制备的杂交瘤技术
单克隆抗体制备的杂交瘤技术XXX,YYY,ZZZ(版权所有，仅限个人)一、实验目的：1.掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法。
2.能运用杂交瘤技术来制备自己的单克隆抗体。
二、实验原理：（一）动物免疫动物体内的B淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可以大量增殖变成浆细胞以分泌针对于该抗原的抗体。
脾内不同的B淋巴细胞克隆可分泌针对不同抗原的抗体。
当受到特定外来抗原刺激时，相应的B淋巴细胞克隆便大量增殖以分泌相应的特异性抗体。
动物免疫的作用就是用特定外为抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激能分泌针对于该抗原抗体的B淋巴细胞大量增殖，从而得到大量产生专一的B淋巴细胞。
（二）细胞融合B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但它在体外存活很短时间(最多两周)后即死亡；而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白，却能在体外长期存活。
如果能将这两种细胞的特性结合起来，我们就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。
脾脏是动物体内B淋巴细胞集中的最大免疫器官,取出脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞,自身融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，以及脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。
其中杂交瘤才是我们需要的，因此就要设法将此杂交瘤细胞从上述细胞混合液中挑选出来。
（三）杂交瘤细胞的筛选在细胞融合后，要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一般使用HAT培养进行筛选，HAT养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。
细胞的DNA合成有内源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路途径)两种方式。
内源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase,HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下来补救合成DNA，HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地阻断DNA合成的内源性途径。
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制备单克隆抗体
从筛选得到的杂交瘤 细胞中提取单克隆抗 体，进行纯化和定量 。
应用单克隆抗体
将单克隆抗体应用于 临床诊断、治疗和基 础研究等领域。
单克隆抗体技术的实验操作流程
免疫原制备
制备免疫原，如抗原蛋白或多糖等，并进行 纯化和定量。
免疫动物
将免疫原注射入动物体内，刺激机体产生特异 性抗体。
制备杂交瘤细胞
杂交瘤技术和单克隆
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2024-01-11
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较 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的实
验操作流程 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的应
用案例
01
杂交瘤技术简介
杂交瘤技术的定义
杂交瘤技术是一种将免疫系统的B淋巴细胞与骨髓瘤细 胞融合，形成杂交瘤细胞的技术。
单克隆抗体的应用领域
01 肿瘤诊断与治疗
用于肿瘤的早期诊断、靶 向治疗、免疫治疗等。
03
免疫性疾病。
02 感染性疾病
用于诊断和治疗病毒性肝 炎、艾滋病等感染性疾病 。
04 心血管疾病
用于诊断和治疗冠心病、
心肌梗死等心血管疾病。
杂交瘤技术与单克隆抗体技
杂交瘤技术与单克隆抗体技
04
术的实验操作流程
杂交瘤技术的实验操作流程
准备免疫动物
选择适宜的免疫动物 ，如小鼠或大鼠，并 进行免疫接种，刺激 机体产生特异性抗体 。
制备杂交瘤细胞
将免疫动物的脾细胞 与肿瘤细胞融合，形 成杂交瘤细胞。
克隆化筛选
通过选择性培养基筛 选出能够产生所需抗 体的杂交瘤细胞，并 进行克隆化培养。
杂交瘤技术和单克隆抗体技术
四、免疫系统能将外来微生物和分子与本身成份区别开来。
五、系统记忆每一次与外来抗原旳遭遇
免疫反应遇到同一抗原时一次比一次强，具有特异性。免 疫记忆能够延续动物终身。
六、免疫反应旳许多性质是经过克隆选择拟定旳
一种抗原活化一种淋巴细胞。当淋巴细胞表面受体结合 抗原时，B淋巴细胞就被活化，分泌抗体被刺激而增殖（急 剧分裂克隆）。
重链分子量为5.5kDlt；轻链分子量为2.5kDlt。 二、不同类型抗体旳区别
IgG、IgM、IgA、IgE和IgD因重链形式不同而有所区别。 它们旳重链分别称作γ、μ、α、ε和δ。
重链旳不同使这些蛋白具有不同形式旳免疫功能，而且在 完毕反应成熟旳不同阶段发挥作用。这些差别主要是因为Fc 片段上旳蛋白序列不同所致。
四、抗体重链旳分子构造
重链旳序列也存在可变区和恒定区（图2-1）。IgG重链具 有一种可变区和三个恒定区，每区含110个氨基酸，其他重 链具有附加旳恒定区。
IgG重链序列也显示γ链有四种亚类，即：IgG1、IgG2a、 IgG2b和IgG3。鼠重链多肽编码区在第12染色体上。
五、重链和轻链旳可变区形成抗原结合位点
B细胞：分泌抗体，并在细胞表面携带同一抗体旳修饰型， 功能相当于受体。
毒性T细胞：携带结合抗原旳细胞表面受体。 辅助T细胞：在控制B细胞和细胞毒性T细胞反应方面起关 键旳调整作用。
体液介导旳适应性免疫反应：体液反应引起产生可结合外 来抗原旳循环抗体，由B淋巴细胞产生，由辅助T淋巴细胞 介导是抗体技术旳基础。
HAT选择培养基：HAT培养基是指在细胞培养基中加有次黄 嘌呤（H）、氨基喋呤（A）或氮丝氨酸（A）和胸腺嘧啶核 苷（T）旳培养基。细胞为合成DNA所需要旳嘌呤和嘧啶，可 由两条途径取得。一条为主要途径，即从磷酸核糖焦磷酸 （PRPP）和谷氨酰胺合成肌苷酸（IMP），进而转变为脱氧 鸟苷三磷酸（dGTP），及从脱氧尿苷酸（dUMP）合成脱氧 胸苷酸（dTMP），再转变为脱氧胸苷三磷酸（dTTP）。这 一合成途径，可为加入旳会克制为嘌呤或嘧啶合成提供甲基旳 二氢叶酸还原酶旳叶酸类似物A所阻断。此时，只有HGPRT+ 和TK+细胞才干经过另一条应急途径，利用外加旳核苷酸旳 “前体”H来合成IMP和利用T来合成dTMP，而得以有活下 来。相反，HGPRT－和TK－细胞则将因无法利用H和T来合成 DNA而死亡。所以，在HGPRT－和TK－细胞融合后，应用 HAT培养基即可将经过基因互补而同步取得HGPRT和TK酶 旳杂种细胞筛选出来。
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理介绍在生物医学研究和临床诊断中，单克隆抗体作为一种重要的实验工具和治疗药物被广泛应用。
其中，利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体具有高特异性和高亲和力的特点，成为研究人员的首选。
本文将介绍利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理。
杂交瘤技术概述杂交瘤技术是一种将体外培养的B细胞（淋巴细胞瘤）与骨髓瘤细胞融合，从而形成能够长期生长并分泌抗体的细胞株的方法。
这种技术利用了淋巴细胞瘤的抗体产生能力和骨髓瘤细胞的无限生长能力，使得细胞株能够持续产生具有特定结构和功能的单克隆抗体。
杂交瘤技术的步骤利用杂交瘤技术制备单克隆抗体一般包括以下几个步骤：1. 免疫原注射首先，在动物体内注射免疫原，激发机体产生特异性抗体。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类、脂质等。
免疫原的选择要根据研究目的和所需抗体的特异性来确定。
2. B细胞提取从动物体内采集淋巴组织，提取出具有特异性抗体的B细胞。
B细胞是产生抗体的主要细胞类型，其具有表面上能与抗原结合的B细胞受体（BCR）。
3. 骨髓瘤细胞准备获得与B细胞体表BCR相对应的骨髓瘤细胞株。
骨髓瘤是一种恶性浆细胞增生性疾病，该病的细胞具有无限生长的能力。
4. 细胞融合将提取的B细胞与骨髓瘤细胞进行体外融合，形成杂交瘤细胞。
融合细胞的过程一般利用聚乙二醇（PEG）或电脉冲等方法实现。
5. 杂交瘤细胞筛选将杂交瘤细胞进行培养，并添加合适的选择性培养基，筛选出能够分泌特异性抗体的单个细胞克隆。
6. 单克隆抗体制备从筛选出的单个细胞克隆中，取出细胞进行进一步培养和扩增。
细胞培养过程中，单克隆细胞会不断分裂和分泌抗体，从而得到大量的单克隆抗体。
制备单克隆抗体的原理利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的原理主要基于两个关键特性：1. B细胞多样性B细胞具有多样的B细胞受体，这使得它们能够识别和结合各种不同的抗原。
当机体暴露于免疫原时，B细胞会通过BCR与特异性抗原结合，并启动免疫反应。
杂交瘤技术制备单克隆抗体
杂交瘤技术制备单克隆抗体来源：1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。
单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。
单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。
表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较单克隆抗体制备的一般流程如下:单克隆抗体的制备方法如下。
（一）动物的选择与免疫1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
杂交瘤技术
进细胞融合的功能，因此可以用紫外线灭活的此类病毒 诱导细胞融合。
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用 灭 活 的 病 毒 诱 导 的 动 物 细 胞 融 合 过 程 示 意 图
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（2）聚乙二醇融合法
聚乙二醇（polyethyleneglycol ，PEG） 分子可在质膜
之间形成分子桥，使细胞质膜发生粘连促使质膜的融
合。
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诱导细胞融合的常用方法
生物方法：如仙台病毒 化学方法：如聚乙二醇（PEG） 物理方法：如电融合
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（1）仙台病毒融合法
常用的能诱导细胞融合的病毒有疱疹病毒、牛痘病毒和
副粘病毒科病毒等。其中属副粘病毒科的仙台病毒应用
最为广泛。
因病毒具有凝集细胞的能力，某些病毒的糖蛋白还有促
其优点是融合成本低，勿需特殊设备；简便、融合效
率较高。因此在1975年获得成功后很快取代仙台病毒 法。
pH6,浓度50%，分子量小于1000的融合效果最好
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（3）电融合法
电融合法是80年代出现的细胞融合技术，将细胞置于电
场中，使它们彼此靠近紧密接触并排列呈串，然后在高 强度、短时程的直流电脉冲的作用下，相互连接的细胞 膜被击穿而导致细胞融合。
脾细胞
不能长期存活
骨髓瘤细胞
筛选出
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HAT培养基筛选
B淋巴细胞： HGPRT+，TK+
存活但短命
骨髓瘤细胞： HGPRTˉ或TKˉ
杂交瘤细胞： HGPRT+，TK+
死亡
长期存活，
且产抗体，
31
三、单克隆抗体 的制备过程
动物免疫 细胞融合及HAT筛选
抗体的检测
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淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术撰写刘雪松1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
细胞融合前准备细胞融合，选择杂交瘤抗体的检测杂交瘤的克隆化和冻存单克隆抗体的大量生产单克隆抗体的鉴定影响因素、失败原因分析一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1. 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5ml ip↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射)↓取脾融合2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。
③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。
(二) 饲养细胞在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。
常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。
小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄↓拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟↓用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜↓用无菌注射器注入6～8ml培养液↓反复冲洗，吸出冲洗液↓放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟↓用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml↓加入96孔板，100μl／孔↓放入37℃CO2孵箱培养一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105／ml，均为100μl／孔。
(三) 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。
骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。
保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合的关键。
(四) 免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。
一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。
一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。
二、细胞融合，选择杂交瘤(一) 细胞融合流程(1) 取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。
(2) 同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。
(3) 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。
(4) 弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
(5) 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
(6) 在室温下融合:①30秒内加入预热的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌。
②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。
③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
(7) 离心，800rpm，6分钟。
(8) 弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。
(9) 根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。
(10) 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养。
一般一块96孔板含有1×107脾细胞。
(二) HAT选择杂交瘤应用HAT 选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。
一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。
HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。
因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔。
所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。
我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择，可得到满意的筛选结果。
50×HATH: 5×10-3MA: 2×10-5MT: 8×10-4M一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。
三、抗体的检测筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。
一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。
检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
常用的方法有:1. ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。
2. RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。
3. FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。
4. IFA用于细胞和病毒McAb的检测。
上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。
可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。
四、杂交瘤的克隆化和冻存克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。
犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。
在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。
要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。
克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。
即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
(一) 克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。
1. 有限稀释法的程序①制备饲养细胞悬液(同融合前准备)②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。
余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。
余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。
④培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。
⑤第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。
注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。
2. 软琼脂法①软琼脂的配制含20％FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI16401％琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。
0.5％琼脂：由1份1％琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。
置42℃保温。
②用上述0.5％琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。
③按100／ml，500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
④1ml 0.5％琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。
⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。
⑥4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。
⑦检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。
(二) 杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。
因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。