杂交瘤细胞
筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选
酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附法是一种常用的免疫学检测方法，用于检测细 胞表面抗原或分泌型抗原。该方法的基本原理是将特异性抗 体与酶结合，然后与细胞表面抗原或分泌型抗原结合，最后 通过酶反应显色来检测抗原的存在。
克隆化培养
克隆筛选
通过有限稀释法或流式细胞术等 方法，将杂交瘤细胞克隆化培养 ，以获得单克隆杂交瘤细胞。
培养条件
提供适宜的培养条件，如适宜的 培养基、温度、气体等，以保证 杂交瘤细胞的生长与繁殖。
抗体检测与筛选
抗体筛选
通过抗原结合试验进一步筛选出具有 高亲和力和特异性的杂交瘤细胞克隆。
抗体纯化
对筛选出的杂交瘤细胞克隆产生的抗 体进行纯化，以提高抗体的纯度和特 异性。
荧光激活细胞分选法的优点是灵敏度高、分辨率高、操作自动化，适用于大量细 胞的筛选。但是，该方法需要使用
细胞融合
选择合适的骨髓瘤细胞与免疫细胞融合
01
选择具有高免疫反应的骨髓瘤细胞系，如SP2/0、X63-
Ag8.653等，与免疫细胞融合，以产生杂交瘤细胞。
生物制品生产
抗体生产
杂交瘤细胞可以作为生产抗体的重要来 源，用于生产治疗性抗体或诊断试剂。
VS
细胞培养技术
通过筛选高表达量的杂交瘤细胞，可以优 化细胞培养技术，提高生物制品的生产效 率和质量。
05
杂交瘤细胞筛选的挑战与解决方案
克隆不稳定问题
克隆不稳定是指杂交瘤细胞在培养过程中出现生长缓慢、 停滞甚至死亡的现象，导致难以获得稳定表达抗体的细胞 株。
克隆扩大培养与建株
杂交瘤细胞培养方法
杂交瘤细胞培养方法
杂交瘤细胞培养方法：
1. 杂交瘤的制备：
将骨髓瘤细胞与抗原刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞。
2. 细胞培养：
将杂交瘤细胞接种于含有高浓度鸟嘌呤或潘孔霉素的无血清培养基中进行培养。
3. 无血清培养基的制备：
取无血清培养基中所需的基础培养液（例如：DMEM、RPMI 1640等），添加必要的生长因子、维生素、矿物质和氨基酸等，经过过滤和灭菌处理即可。
4. 细胞培养条件：
培养杂交瘤细胞时，需保持其在适宜的温度、CO2浓度和湿度下生长，通常在37℃、5% CO2气氛下进行培养。
5. 细胞检测：
在培养过程中，需定期检测细胞形态、增殖情况、表达抗原的能力等，以确保细胞的纯度和功能性。
注意事项：
为避免污染和交叉感染，需采取有效的无菌技术和严格的操作规范；同时，在培养过程中应注意细胞的生长情况和营养状况，及时调整培养条件以保证细胞的最佳生长状态。
杂交瘤细胞培养及其注意事项
杂交瘤细胞培养及其注意事项单克隆抗体的应用是一项迅速发展的技术。
本文阐述了单克隆抗体制备前杂交瘤细胞的培养条件和应用，包括细胞的培养、培养基的选择，融合时期的选择，从而指导和优化实验室中杂交瘤的培养，促进融合细胞的融合率和后继单克隆抗体筛选实验的顺利进行。
标签：杂交瘤；细胞培养；单克隆抗体随着杂交瘤细胞株不断的建立和生产单克隆抗体的日益广泛应用，杂交瘤细胞的培养和优化不断得到改善，但是国内实验室设备和条件有限，多数的单克隆抗体的筛选还是应用基础的免疫抗原包被，结合Elisa方法联合有限稀释法来筛选单克隆抗体。
为了获得特异性较强的杂交瘤细胞株，融合前后细胞的培养以及杂交瘤的培养和储存，仍是基础实验室中必须注意和重视的技术。
1杂交瘤的起源和生产1.1杂交瘤所用的骨髓瘤细胞系1966年Petingel等在体外培养小鼠浆细胞成功。
Milstein等1972年由P3中用20μg 8-氮杂鸟嘌呤（8-azaguanine）筛选出缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的新细胞系，称之为P3-X63-Ag8。
由于X63本身分泌IgG1，形成的杂交瘤除分泌B细胞的特异性抗体外，同时分泌X63产生的抗体，因其抗体不纯，现多改用不分泌型骨髓瘤细胞系。
国内现已引进NS-1，SP2/0，FO，X63-Ag8-653等小鼠骨髓瘤细胞系。
最常使用的是SP2/0及NS-1[1]。
1.2人骨髓瘤细胞系为产生稳定的人免疫球蛋白的杂交瘤，需要人的缺某种酶的骨髓瘤细胞系。
国外已筛选了一些人骨髓瘤细胞，但融合率不高，还没有推广使用。
目前人一人杂交瘤技术仍存在着杂交瘤在不同培养基中的生长速度问题。
细胞生长缓慢，抗体分泌力弱及效价较低，且难于克隆化等困难[2]，限制了人骨髓瘤细胞的应用。
1.3淋巴细胞和骨髓瘤细胞的关系B淋巴细胞容易与浆细胞瘤融合，而T细胞则需要同胸腺淋巴肉瘤融合（Kohler，et al. 1977；Schwaber，1977）。
杂交瘤细胞的纯化
补救合成途径
细胞可通过次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖 转移酶 （HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶 （TK），将核苷酸前体合成核苷酸以供 DNA合成的原料。
DNA的生物合成途径与HAT选择培养基
糖和
A
氨基酸
T
TMP
核苷酸 前体
TK HGPRTH来自IMP核苷酸 DNA
H—hypoxanthine （次黄嘌呤） A—aminopterin （氨基喋呤） T—thymidine （胸腺嘧啶核苷）
杂交瘤细胞的纯化原理与方法
杂交瘤细胞的筛选
未融合的免疫细胞在培养6~10天后 会自行死亡；异型多核细胞分裂不正常， 培养过程中也会死亡；未融合的骨髓瘤 细胞因其生长快不利于杂交瘤细胞生长， 所以要将杂交瘤细胞筛选出。
杂交瘤细胞的筛选
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞 脾细胞脾细胞
筛选出 不能长期存活
2~4周
HT培养基
普通培养基
• 实验所用骨髓瘤细胞是HGPRT缺陷（HGPRT-） 和TK缺陷（TK-）细胞，不能利用培养基中 的H和T，且未融合骨髓瘤细胞合成DNA的主 要途径被培养基中的A阻断，所以未融合骨 髓瘤细胞不能在HAT培养基中生长。
• 未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死 亡。
• 脾细胞和脾细胞自身融合的细胞能在HAT培 养基上正常生活,但不能增殖,所以经过数代 后,HAT培养基上没有脾细胞和脾细胞自身融 合的细胞。
骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞
脾细胞
骨髓瘤细胞
不能长期存活
HAT培养基进行筛选
原理
细胞DNA合成有两条途径： 从头合成途径 补救合成途径
从头合成途径
即利用糖和氨基酸这些可从培养液中摄 取的简单的含碳、含氮复合物来合成核苷 酸，进而合成DNA。
杂交瘤细胞的复苏与冻存
杂交瘤细胞的复苏与冻存一． 杂交瘤细胞的复苏杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。
复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过最易受损的-5℃—0℃，以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。
通常情况下，冻存时细胞数量多，生长状态好的杂交瘤细胞系以及其他细胞的复苏可采用以下方法，这也是各个实验室普遍采用的程序。
不过，冻存的细胞并不都能100%复苏成功，其原因较多，如冻存时细胞数量少或生长状态不良，或复苏时培养条件改变或方法不当，也可能细胞受细菌或支原体污染，以及液氮罐保管不善等。
在出现上述情况时，可采用一些补救方法复苏这些细胞，如小鼠皮下形成实体瘤法，脾内接种法，小鼠腹腔诱生腹水和实体瘤法，以及96孔板培养法等。
二 杂交瘤细胞的冻存细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度（0℃- -20℃，每分钟下降1℃；-20℃--40℃每分钟下降2℃），可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。
下面的细胞冻存方法，细胞复苏存活率均在80%以上。
1.材料：带盖吸管筒一只（铝质或洋铁皮制），内壁（包括筒底和盖）衬1-2层石棉纸或石棉布； 含10-20%血清、5-10% DMSO 的HT 培养基，冰浴降温至0℃左右（用作冻存液）；灭菌安瓶或带盖小瓶；-70℃冰箱；液氮及液氮罐；处于对数生长中期、健康而活力好的杂交瘤细胞。
方法：复苏时，从液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴融化，待最后一点冰块快要融化时，从水浴中取出，置冰浴上。
用5-10ml HT 培养基稀释，1000r/min 10分钟，弃上清，再悬浮于适量HT 培养基中，转入培养瓶或24孔板，置37℃，7.5% CO2培养。
如果细胞存活力不高，死细胞太多，可加104-105/ml 小鼠腹腔细胞进行培养。
2、方法：（1）. 将杂交瘤细胞（或其他细胞）离心，重新悬浮于预冷的冻存液中，浓度为106-107左右/ml ，分装安瓶，每瓶1ml ，置冰浴上；安瓶上标明细胞名称、冻存日期、批号等。
什么是杂交瘤技术？杂交瘤技术的原理及步骤
什么是杂交瘤技术？杂交瘤技术的原理及步骤杂交瘤技术（hybridoma technique）即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。
它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。
克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。
这一技术的基础是细胞融合技术。
骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。
如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。
杂交瘤技术原理及步骤：杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。
这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。
在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
其原理从下列3个主要步骤阐明。
(一)细胞的选择与融合建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。
脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。
融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。
·选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。
多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。
使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。
杂交瘤细胞
A 平行多电极融 合装置示意图
在交流电场中原 生质体排列成念 珠状、发生融合 B 电融合微室示意图 上：俯视图 :下侧面图
电融合设备及原理图
6.2.3 物理法——电融合诱导法
电融合诱导法：
1. 亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微电极只有一个小
室，平行电极型有4个小室，两电极间隔3㎜，整个装置放在 一个培养皿中。 2. 微电极型的两个电极的端部同时与两个靠近的原生质体膜 表面接触，5~12mA脉冲电流刺激1~5mS,原生质体在累计几秒 到几十秒时间内暂时收缩，两膜间形成小孔，连接成桥，经 点到面完成连接，最后形成融合体。 3. 经平行电极的1兆赫交流双向脉冲，原生质体极化产生偶极
中，组织块剪碎1mm3大小加入Hanks溶液，低速离 心，留下组织块。 2、组织的消化：胰蛋白酶消化： ①向组织块中加入30~50倍体积的胰蛋白酶液。 ②37℃水浴内消化，每5~10分钟摇一次。 ③Hanks漂洗两次。
④800r/min离心5min，弃上液，加入营养液。
6.2 细胞融合技术与融合细胞的选择
pH、高钙离子液,15分钟后冲洗液冲洗，离心收集原生质
体。 4.计算融合率 融合率=（融合细胞的细胞核总数/视野内全部细胞的 细胞核总数）×100%
6.2.3 物理法——电融合诱导法
是20世纪80年代出现的细胞融合技术。在直流电脉
冲的诱导下，原生质体膜表面的电荷和氧化还原电位
发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破 裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融 合体。 优点：融合率高、重复性好、对原生质体伤害 小、装置精巧、方法简便、可在显微镜下观察或录象 融合过程、诱导过程可控性强等。
PEG法诱导原生质体的机制尚不十分清楚，初步分 析可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体 表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键，促使 异源的原生质体间的黏着而结合。用高钙离子和pH 溶液将与质膜结合的PEG分子进行洗脱，导致电荷平 衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连 接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。
杂交瘤细胞培养过程的问题、原因及解决方法
杂交瘤细胞培养过程中遇到的问题、产生的原因及解决办法1.杂交瘤细胞初次培养及复苏效果不佳，如何解决此问题？解析：杂交瘤细胞系种类繁多，并不是所有的细胞系都能直接适应无血清培养基，如无法适应请先按照购买公司驯化适应程序进行细胞驯化，驯化后的细胞即可完全适应本公司的无血培养基。
复苏问题：如冻存的杂交瘤细胞活率较低，复苏时可加5%胎牛血清于无血清培养基中，可修复受损细胞的状态，细胞复苏时接种密度要求大于1x105cells/mL，可保证更好的复苏率。
2.杂交瘤细胞传代最低接种密度是多少？最佳的接种密度是多少？解析：经过我们反复测试，最低接种密度极限值,1x104cells/mL，此密度仍可正常培养杂交瘤细胞，但细胞生长周期较长，6-7天达到峰值。
最佳接种密度为1-2x105cells/mL，3-4天可达到峰值，细胞生长周期短，适合工业客户。
3.无血清培养杂交瘤细胞最大生长支持密度多少？怎么我养的几种杂交瘤细胞差距很大？解析：由于杂交瘤细胞系种类繁多，不同的细胞系最大生长密度也不一致，目前我们测试的细胞株最高的密度可到3x106cells/mL，最低的密度在1.6x106cells/mL。
这取决于所培养的细胞株本身的特性。
4.我培养的杂交瘤细胞抗体表达量总是很低，有办法进一步提高抗体表达量吗？解析：北京友康公司在杂交瘤细胞培养方面，引入了全新的培养袋法，IgG 表达量可从300~400mg/L提高到480~520mg/L，我们可提供相关技术支持。
5.贵公司无血清培养杂交瘤细胞抗体表达一般在什么水平？目前我公司测试的两株细胞系，IgG抗体最高表达量在480~520mg/L，国外培养基IgG抗体最高表达水平在400~500mg/L，我公司的产品在抗体表达量上有明显的优势。
友康恒业生物科技（北京）有限公司渠道部。
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杂交瘤技术
杂交瘤技术（hybridoma technique）即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。
它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。
克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。
这一技术的基础是细胞融合技术。
骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。
如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。
杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。
这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。
在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
其原理从下列3个主要步骤阐明。
(一)细胞的选择与融合建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。
脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。
融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。
·选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。
多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。
使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。
最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。
聚乙二醇(PEG1 000～2 000)是目前最常用的细胞融合剂，一般应用浓度为40%(W/V)。
(二)选择培养基的应用细胞融合是一个随机的物理学过程。
在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞将以多种形式出现。
如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。
正常的脾细胞在培养基中仅存活5～7d，无需特别筛选；细胞的多聚体形式也容易死去；而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。
细胞DNA合成一般有两条途径。
主要途径是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。
另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌吟磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。
细胞融合的选择培养基中有3种关键成分：次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、甲氨蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)，所以取三者的字头称为HAT 培养基。
甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT-细胞株，所以不能在该培养基中生长。
只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖。
(三)有限稀释与抗原特异性选择在动物免疫中，应选用高纯度抗原。
一种抗原往往有多个决定簇，一个动物体在受到抗原刺激后产生的体液免疫应答实质是众多B细胞群的抗体分泌，而针对目标抗原表位的B细胞只占极少部分。
由于细胞融合是一个随机的过程，在已经融合的细胞中有相当比例的无关细胞的融合体，需经筛选去除。
筛选过程一般分为两步进行：一是融合细胞的抗体筛选，二是在此基础上进行的特异性抗体筛选。
将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间(30%的孔为0才能保证每个孔中是单个细胞)，培养后取上清液用ELISA法选出抗体高分泌性的细胞；这一过程常被习惯地称作克隆化。
将这些阳性细胞再进行克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养。