应用活体骨髓瘤细胞制备单克隆抗体
单克隆抗体的过程
单克隆抗体的过程
单克隆抗体的过程是指从单一的淋巴细胞中制备出一种特异性
很高、只与一种抗原结合的抗体。
这种抗体被称为单克隆抗体，是研究和应用领域中非常重要的工具。
单克隆抗体制备的过程主要包括以下几个步骤：
1. 免疫原注射：将一种抗原注射到小鼠或大鼠体内，以激发其
免疫系统产生特异性抗体。
2. 淋巴细胞分离：从小鼠或大鼠的脾脏或淋巴结中取出特异性
抗体产生的淋巴细胞。
3. 融合细胞制备：将淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到一
种能够长期生长和分泌抗体的杂交瘤细胞。
4. 筛选杂交瘤：通过对杂交瘤进行筛选，筛选出只分泌与所需
抗原结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
5. 培养单克隆抗体：将根据筛选结果得到的杂交瘤细胞进行培养，得到单克隆抗体。
6. 纯化单克隆抗体：采用各种化学和生物学方法，将得到的单
克隆抗体进行纯化和加工处理。
单克隆抗体制备的过程需要经过多个阶段，其中淋巴细胞的分离、杂交瘤的筛选和单克隆抗体的培养是关键步骤。
随着技术的不断发展，单克隆抗体制备的效率和质量也在不断提高，为生命科学和医学研究提供了更加可靠的工具。
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单克隆抗体的制备及应用实验原理
单克隆抗体的制备及应用实验原理1. 简介单克隆抗体是指由单一B细胞克隆扩增得到的抗体，在医学研究和生物制药等领域具有重要的应用价值。
本文将介绍单克隆抗体的制备方法及其在实验中的应用原理。
2. 单克隆抗体的制备方法单克隆抗体的制备需要经历以下几个步骤：2.1 免疫原的选择免疫原的选择是单克隆抗体制备的第一步。
通常选择与所需抗体结构最为相似的蛋白质作为免疫原，可以是纯化的蛋白质、重组蛋白、细胞表面抗原等。
2.2 免疫动物的免疫选择适当的免疫动物，常见的包括小鼠、大鼠、兔子等。
将免疫原与免疫佐剂混合注射到动物体内，触发免疫反应，使得免疫动物产生特异性抗体。
2.3 细胞融合将免疫动物的脾细胞和癌细胞进行融合，常用的癌细胞包括骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞等。
通过融合方法，使得脾细胞和癌细胞融合成为杂交瘤细胞。
2.4 杂交瘤细胞的筛选与培养对融合后的杂交瘤细胞进行筛选，常用的方法包括喷洒法、限稀稀释法等。
筛选出具有单克隆性的杂交瘤细胞后，进行培养、扩增。
2.5 单克隆抗体的纯化将培养得到的杂交瘤细胞进行离心、洗涤等操作，得到含有目标抗体的上清液。
通过柱层析、电泳等方法，对上清液进行纯化，最终得到单克隆抗体。
3. 单克隆抗体的应用实验原理单克隆抗体在实验室中有多种应用，包括免疫组化、免疫印迹、流式细胞术等。
以下将介绍单克隆抗体在这些实验中的应用原理：3.1 免疫组化免疫组化是一种检测组织或细胞中特定抗原表达情况的方法。
通过与组织或细胞中特定分子结合，单克隆抗体可以为我们提供目标抗原的定位和分布情况。
3.2 免疫印迹免疫印迹是一种检测特定蛋白质表达情况的方法。
通过将蛋白质转移到膜上，并与特异单克隆抗体结合，可以用于检测目标蛋白质的存在与定量。
3.3 流式细胞术流式细胞术是一种用于分析和鉴定细胞表面标记物的方法。
通过与特定抗原结合，单克隆抗体可以进行标记，并通过流式细胞仪进行检测和分析。
3.4 免疫沉淀免疫沉淀是一种用于富集目标蛋白质的方法。
简述单克隆抗体的制备原理
简述单克隆抗体的制备原理
单克隆抗体是指由单个B细胞克隆所产生的同一种抗体分子，具有高度特异性和亲和力。
制备单克隆抗体的方法有多种，其中最常用的是杂交瘤技术。
制备单克隆抗体的过程主要分为以下几个步骤：
1. 免疫动物
首先需要选取与目标抗原相关的免疫原来免疫动物，一般常用的免疫原包括蛋白质、多肽、糖类、细胞表面分子等。
免疫动物可以选择小鼠、大鼠、兔子等。
2. 分离B细胞
将免疫动物的脾脏取出，制备成单细胞悬液，然后通过离心、梯度离心等方法分离出B细胞。
B细胞是免疫系统中产生抗体的主要细胞类型。
3. 杂交瘤的制备
将B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
骨髓瘤细胞是一种白血病细胞，具有无限增殖的能力，但不产生抗体。
通过融合，可以将B细胞的抗体产生能力与骨髓瘤细胞的无限增殖能力结合在一起，形成具有两种细胞的特点的杂交瘤细胞。
4. 筛选单克隆抗体
将杂交瘤细胞进行分离和培养，筛选出产生特定抗原的单克隆抗体。
可以通过酶联免疫吸附试验、流式细胞术等方法鉴定和筛选出单克隆抗体。
5. 大规模制备和纯化
通过大规模培养杂交瘤细胞，可以得到足够数量的单克隆抗体，然后通过柱层析、电泳等方法对单克隆抗体进行纯化，得到高纯度的单克隆抗体。
总的来说，单克隆抗体的制备过程需要经过免疫动物、分离B细胞、杂交瘤的制备、筛选单克隆抗体和大规模制备和纯化等步骤。
这些步骤需要严格控制条件和技术，以确保制备出高质量的单克隆抗体。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
二、骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
三、细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
单克隆抗体的制备方法与应用
单克隆抗体的制备方法与应用一、前言单克隆抗体是指一种具有高度特异性和亲和力的抗体，其来源于单个B细胞克隆。
相比多克隆抗体，单克隆抗体更加纯净、稳定和可靠，因此在生物医学研究、诊断和治疗等方面有着广泛的应用。
本文将介绍单克隆抗体的制备方法与应用。
二、单克隆抗体的制备方法1. 免疫动物首先需要选取适当的动物进行免疫，通常选择小鼠或大鼠。
在进行免疫前需要对动物进行预处理，例如注射低剂量的抗生素来消除潜在的感染。
2. 免疫原选择选择合适的免疫原是制备单克隆抗体的关键步骤。
常见的选择包括蛋白质、多肽、细胞表面分子等。
在选择时需要考虑到其特异性、稳定性和可重复性等因素。
3. 免疫程序在进行免疫前需要对动物进行预处理，例如注射低剂量的抗生素来消除潜在的感染。
接着，将免疫原注射到动物体内，通常需要多次免疫以增强免疫效果。
在免疫过程中需要对动物进行监测，例如采集血样检测抗体水平。
4. 融合细胞的制备在获得足够的抗体后，需要从动物体内采集B细胞并与骨髓瘤细胞进行融合。
常用的骨髓瘤细胞包括SP2/0和NS0等。
5. 单克隆抗体筛选通过限稀法或单一细胞分离法等方法将融合细胞分离为单个克隆，并通过ELISA、免疫印迹等方法筛选出特异性较高的单克隆抗体。
接着对筛选出的单克隆抗体进行扩增和纯化等处理。
三、单克隆抗体的应用1. 生物医学研究单克隆抗体在生物医学研究中有着广泛的应用，例如作为特定蛋白质或分子的检测工具、用于药物开发和治疗等。
2. 诊断单克隆抗体在诊断方面也有着重要的应用，例如用于肿瘤标志物的检测、病原体的检测等。
3. 治疗单克隆抗体在治疗方面也有着广泛的应用，例如用于治疗癌症、自身免疫性疾病等。
其中一些单克隆抗体已经被批准为药物并用于临床治疗。
四、总结单克隆抗体是一种具有高度特异性和亲和力的抗体，在生物医学领域中有着广泛的应用。
其制备方法包括适当动物选择、合适免疫原选择、多次免疫程序、融合细胞制备和单克隆抗体筛选等步骤。
单克隆抗体的制备及应用
单克隆抗体的制备及应用单克隆抗体技术是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。
单克隆抗体B淋巴细胞antibody technique)同骨髓肿瘤细胞杂交，获：一种免疫学技术，将产生抗体的单个(monoclonal得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。
是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。
1 单克隆抗体的优点与局限性：1.1 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。
(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。
(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。
(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。
总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。
1.2 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。
由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。
(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。
(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。
2 单克隆抗体的制备：单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。
这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。
单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。
单克隆抗体的制备及应用
单克隆抗体的制备及应用单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。
单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。
是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。
1 单克隆抗体的优点与局限性：1.1 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久〞地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。
(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。
(3)由于可能得到“无限量〞的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。
(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。
总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、本钱低和可大量生产等。
1.2 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。
由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反响，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。
(2)单克隆抗体的反响强度不如多克隆抗体。
(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。
2 单克隆抗体的制备：单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。
这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。
单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。
单抗体制备
单抗体制备引言单抗（monoclonal antibody）是指来源于单一克隆细胞的抗体，具有高度特异性和高亲和力。
单抗在医学、生物工程和疾病治疗等领域具有广泛应用前景。
本文将介绍单抗的制备方法，包括杂交瘤细胞制备、单克隆细胞培养和纯化等步骤。
一、杂交瘤细胞制备杂交瘤细胞是由B淋巴细胞（B lymphocyte）和骨髓瘤细胞（myeloma cell）融合而成的细胞系，具有无限增殖能力和产生单克隆抗体的能力。
制备杂交瘤细胞的步骤如下：1.1.采集B淋巴细胞从免疫动物（如小鼠）的脾脏或淋巴结中采集B淋巴细胞。
这些细胞是免疫系统中产生抗体的关键细胞。
1.2.准备骨髓瘤细胞选择一种骨髓瘤细胞系，如NS-1细胞或SP2/0细胞，作为杂交瘤的母细胞。
这些细胞具有无限增殖能力，适合用于制备杂交瘤细胞。
1.3.融合细胞将采集到的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞按照一定比例混合，加入聚乙二醇等融合剂，使细胞融合为杂交瘤细胞。
融合后的细胞称为杂交瘤。
二、单克隆细胞培养杂交瘤细胞具有无限增殖能力，但并不能产生单一的抗体。
为了获得单克隆抗体，需要对杂交瘤细胞进行单克隆化培养。
2.1.稀释培养将融合后的杂交瘤细胞进行稀释培养，使细胞以单个细胞的形式分散在培养基中。
这样可以使每个细胞形成一个单克隆。
2.2.筛选单克隆细胞将稀释后的杂交瘤细胞进行筛选，通常采用限稀稀释法或HTP法。
限稀稀释法是在培养基中加入一定浓度的杂交瘤细胞，使每个细胞在培养皿上形成单个克隆。
HTP法则是将杂交瘤细胞分装到96孔板中，每个孔中只有一个细胞，便于单克隆的筛选。
2.3.培养和扩增单克隆细胞将筛选出的单克隆细胞进行培养和扩增，可以使用无血清培养基，添加合适的生长因子和抗生素，促使细胞的生长和分裂。
三、单抗纯化经过单克隆细胞培养，可以得到大量的单克隆抗体，但其中还含有其他蛋白质和杂质。
为了获得纯净的单抗，需要进行纯化步骤。
3.1.采集培养上清将培养单克隆细胞的上清液收集起来，其中含有分泌的单克隆抗体。
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技术与方法
应用活体骨髓瘤细胞制备单克隆抗体
李永亮１ 田美娜１ 卢曾军１ 杨苏珍２ 刘在新１ （ １中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽病毒学重点实验室 国家口蹄疫参考实验室 兰州 ７ ３ ０ ０ ４ ６ ） （ ２河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室 郑州 ４ ５ ０ ０ ０ ２ ）
摘要 目的： 用活体骨髓瘤细胞 Ｓ Ｐ ２ ／ ０做融合提高融合率制备单克隆抗体， 并与常规方法比较效 果。方法： 将Ｓ Ｐ ２ ／ ０细胞打到 ８周龄的 Ｓ Ｐ Ｆ级 Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ 小鼠皮下， 待实体瘤生长到直径达 ２～ ３ ｃ ｍ 时无菌解剖取实体瘤， 分离出骨髓瘤细胞进行融合。同时用培养基培养 Ｓ Ｐ ２ ／ ０细胞进行融合做 比较， 分两组进行。比较两种方法的融合率以及两种方法制备出来的单克隆抗体的相对亲和力。 结果： 做了 ６次融合， 实体瘤融合组融合率为 ７ ０ ． ４ ％， 常规法融合组 ４ ４ ． ６ ％， 两种方法制备单抗的 ∶ １ ０ ００ ０ ０ 以上。结论： 利用活体实体瘤细胞进行融合能明显提高细胞融合率。 相对亲和力均达到 １ 关键词 单克隆抗体（ Ｍ Ａ ｂ ）Ｓ Ｐ ２ ／ ０细胞 活体骨髓瘤细胞 融合
收稿日期： ２ ０ ０ ８ ０ ６ ０ ３ 修回日期： ２ ０ ０ ８ ０ ９ １ ４ ９ ７ ３ ” 计划资助项目（ ２ ０ ０ ５ Ｃ Ｂ ５ ２ ３ ２ ０ １ ） 国家“ 电子信箱： ｌ ｉ ｕ ｋ ｅ ｙ ＠ｐ ｕ ｂ ｌ ｉ ｃ ． ｌ ｚ ． ｇ ｓ ． ｃ ｎ 檪檪檪檪殏
是仙台病毒， 但仙台病毒不稳定， 制备困难且繁琐， 在 抗生物 保存过程中容易发生活性下降现象。生物素 ? 素系统的方法因工作操作较繁琐、 工作量大， 在实际工 作中不常用。电融合和激光融合的方法需要一定的设 备， 不适用于大多数实验室。目前常用的就是利用化
［ １ ］ 学融合剂， 应用最广泛的就是聚乙二醇（ Ｐ Ｅ Ｇ ） 。然
一共融合 ６ 次， 每次两种来源的骨髓瘤细胞同时进 行融合， 每组每次融合 ３块 ９ ６孔细胞培养板。融合率 融合生长孔 ÷ 接种孔 × １ ０ ０ ％） 对比见表 １ 。 （ 融合率％ ＝
表１ 两组融合率对比表 Ｔ ａ ｂ ｌ ｅ １ Ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ａ ｓ ｔ ｔ ｗ ｏｇ ｒ ｏ ｕ ｐｏ ｆ ｐ ｒ ｏ ｐ ｏ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎｏ ｆ ｃ ｅ ｌ ｌ ｆ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ
融合率 第 １次 第 ２次 第 ３次 第 ４次 第 ５次 第 ６次 平均值 ２ ． ９ ％ ６ １ ． ５ ％ ７ ５ ． ３ ％ ６ ２ ． ８ ％ ７ ０ ． ５ ％ ７ ９ ． ２ ％ ７ ０ ． ４ ％ 实体瘤组 ７ ３ ． ４ ％ ４ ８ ． ３ ％ ３ ９ ． ９ ％ ３ ６ ． ８ ％ ５ ２ ． ８ ％ ４ ６ ． ５ ％ ４ 常规组 ４ ４ ． ６ ％
２ ０ ０ ８ ， ２ ８ （ １ １ ） ２ ． ２ 融合结果
李永亮 等：应用活体骨髓瘤细胞制备单克隆抗体
６ ５
象。避免措施就是在打小鼠之前用 ８－氮杂鸟嘌呤处 理体外培养的 Ｓ Ｐ ２ ／ ０细胞 ７ ２ ｈ ， 杀死出现 Ｈ Ｇ Ｐ Ｒ Ｔ酶逆
６ ］ 转的细胞 ［ 。利用活体实体瘤制备融合用骨髓瘤细胞
心１ ０ ｍ ｉ ｎ ， 弃上清。沉淀中加入 ３～ ４ ｍ ｌ 无血 清 Ｒ Ｐ Ｍ Ｉ １ ６ ４ ０培养液重悬混匀， 然后沿管壁缓慢加到装有 ５ ｍ ｌ 淋巴 细 胞 分 离 液 的 试 管 液 面 上， ２０ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ离 心 ２ ０ ｍ ｉ ｎ 。收集云雾状淋巴细胞层后再加入无血清 Ｒ Ｐ Ｍ Ｉ １ ６ ４ ０培养液用 １０ ０ ０ｒ ／ ｍ ｉ ｎ离心 １ ０ ｍ ｉ ｎ进行细胞洗涤， Ｐ Ｍ Ｉ １ ６ ４ ０培养液将细 洗涤两次。洗涤完毕用无血清 Ｒ 胞重悬至 １ ０ ｍ ｌ ， 混匀计数后备用。 １ ． ５ 体外培养基培养细胞的准备 用含 ２ ０ ％特级胎牛血清的 Ｒ Ｐ Ｍ Ｉ １ ６ ４ ０细胞培养基 Ｐ ２ ／ ０细胞。融合前用 ８ 氮杂鸟嘌呤处理 Ｓ Ｐ ２ ／ ０ 培养 Ｓ ? 细胞三代以去除 Ｈ Ｇ Ｐ Ｒ Ｔ酶逆转的细胞突变株， 融合时 取生长旺盛、 形态良好的对数生长期的细胞供融合用。 １ ． ６ 融 合 按文献［ ３ ］ 的方法进行融合。每组都分别用活体 实体瘤细胞和培养基培养细胞进行融合， 两组所用的 液体试剂都一样。观察统计两种方法的融合率， 并进 行比较。 １ ． ７ 单克隆抗体的制备 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ方法筛选出阳性杂交瘤细胞克隆， 经 ２～ ４ 次有限稀释克隆化后获得稳定分泌特异性 Ｍ ｃ Ａ ｂ的杂 交瘤细胞株。腹腔注射 Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ 小鼠（ ２ ０ ｇ 左右） 降植 ０ ． ５ ｍ ｌ ／ 只） ， １ ０ ｄ后腹腔接种无血清 １ ６ ４ ０培养基培 烷（ １× １ ０ ６～ ３× １ ０ ６ ） ， 注射 养的生长良好的杂交瘤细胞（ 后１ ０ ｄ左右可见小鼠的腹腔明显增大， 用针头采集腹 水， 纯化后分装保存于 － ８ ０ ℃。 １ ． ８ ＭＡ ｂ的相对亲和力的测定 用抗原蛋白分别包被酶标板。从 ６ 次融合制备的单 克隆抗体中每组随机抽取两株单抗， 一共测 ２ ４株单抗的 相对亲和力。每种腹水单抗从 １ ０ ｇ ／ ｍ ｌ 开始， 经倍比稀 μ 释后与包被的蛋白结合， 再与工作浓度的羊抗鼠 Ｉ ｇ Ｇ ? Ｈ Ｒ Ｐ反应， 加底物显色后用酶标仪读取 Ａ值。以被检单 抗的不同浓度为横坐标， 以其相应的 Ａ值为纵坐标， 绘出 各株单 抗 曲 线， 从 各 曲 线 上 部 趋 于 平 坦 段 的 Ａ值 为 １ ０ ０ ％， 查出其 Ａ值为 ５ ０ ％相对应的单抗浓度， 以此表示
中图分类号 Ｑ ８ １ ３ 单克隆抗体（ ｍ ｏ ｎ ｏ ｃ ｌ ｏ ｎ ａ ｌ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙ ， Ｍ Ａ ｂ ） 技术， 是将 骨髓瘤细胞和经某种抗原诱导产生的特异性 Ｂ细胞， 经Ｐ Ｅ Ｇ等融合剂作用， 亦可经电融合或激光融合， 形成 杂交瘤细胞， 然后筛选分离出单个阳性杂交瘤细胞， 再 将其扩增， 最终分离纯化抗体的过程。１ ９ ７ ５年 Ｋ ｏ ｈ ｌ ｅ ｒ 和Ｍ ｉ ｌ ｓ ｔ ｅ ｉ ｎ 首先成功地用杂交瘤技术制备了单克隆抗 体， 开创了免疫学和分子生物学、 乃至整个生命科学研 究的新纪元。国内自 １ ９ ７ ９年引进杂交瘤技术， 经过 ３ ０ 多年的发 展， 这 项 技 术 已 经 为 大 多 数 实 验 室 所 掌 握。 然而许多实验室都不同程度的在制备单克隆抗体过程 中遇到融合率低的问题， 严重影响了单克隆抗体工程 的进展速度。 为了提高细胞融合的成功率， 各国学者进行了很 多尝试。细胞虽在体外培养条件下会自发融合， 但频 率极低， 应用病毒融合剂、 化学融合剂和生物素 －抗生 物素系统的方法会提高融合效率， 还可以进行电融合 或激光融合。病毒融合剂最早被采用， 其中最有效的
而采取该方法用培养基培养的骨髓瘤细胞进行融合， 其成功率相差悬殊， 时高时低。为了解决这一问题， 史
２ ］ 良如等 ［ 曾对各种条件，包括骨髓瘤细胞株、 融合方
法、 Ｐ Ｅ Ｇ的型号与使用量、 饲养细胞及牛血清等因素进 行了摸索， 经大量实验证明骨髓瘤细胞活性好坏是融 合成功与否的关键所在， 并首次采用活体实体瘤细胞 进行融合试验， 证明该方法能明显提高细胞融合率。 本研究在前一段制备单抗工作中出现融合率极低 的情况下， 利用实体瘤细胞进行融合获得比较满意的 结果。在此基础上我们又分别利用实体瘤细胞融合和 培养基培养的细胞融 合 两 种 方 法 进 行 制 备 单 克 隆 抗 体， 然后比较两种方法的融合率以及两种方法制备出 来的单克隆抗体的相对亲和力， 来研究应用活体骨髓 瘤细胞制备单克隆抗体方法的可行性。
４ ］ 各株单抗的相对亲和力［ 。全部测出后比较两种融合方
法制备出来的单克隆抗体的相对亲和力。
２ 结 果
２ ． １ 间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ检测抗蛋白抗体 最佳条件为： ４ ℃ 过夜蛋白包被酶标板， 一抗和二 抗３ ７ ℃孵育的时间均为 １ ｈ ， 底物 ３ ７ ℃ 作用 １ ０ ｍ ｉ ｎ后终 止反应， ４ ５ ０ ｎ ｍ 波长读 Ｏ Ｄ 值。
６ ４
中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ
Ｖ ｏ ｌ ． ２ ８Ｎ ｏ ． １ １２ ０ ０ ８
１ 材料与方法
１ ． １ 材 料 １ ． １ ． １ 免疫用抗原 采用本试验室原核诱导表达并 纯化的口蹄疫病毒（ Ｆ Ｍ Ｄ Ｖ ） 非结构蛋白。 １ ． １ ． ２ 实验动物 Ｓ Ｐ Ｆ级 Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ 小鼠， ４～ ８周龄， 雌 性， 由兰州生物制品所实验动物室提供。 １ ． １ ． ３ 骨髓瘤细胞 Ｓ Ｐ ２ ／ ０细胞， 属于 Ｈ Ｇ Ｐ Ｒ Ｔ缺乏的 骨髓瘤细胞系， 由国家口蹄疫参考实验室保存。 １ ． １ ． ４ 细胞培养液 含 ２ ０ ％ 特级胎牛血清（ 四季青） 的Ｒ Ｐ Ｍ Ｉ １ ６ ４ ０ （ Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ ） 细胞培养基， 用之前加入青、 链霉 素（ 最终浓度为 １ ０ ０单位 ／ ｍ ｌ ） 。 １ ． １ ． ５ 相关试剂 弗氏完全和不完全佐剂、 Ｐ Ｅ Ｇ ４ ０ ０ ０ 、 ｇ Ｇ Ｈ Ｒ Ｐ均为 Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ 公司产品； 淋巴细胞分 山羊抗鼠 Ｉ ? 离液为上海恒信化学试剂公司产品； 其它 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ相关 试剂由国家口蹄疫参考实验室提供。 １ ． ２ 检测抗体间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ法的建立 抗原蛋白用 ０ ． ０ ５ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌｐ Ｈ ９ ． ５的碳酸盐溶液稀释 ％明胶的 ０ ． ０ ２ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ 后包 被 酶 标 板， 封闭液为含 １ ｐ Ｈ ７ ． ４Ｐ Ｂ Ｓ 。以正常鼠血清 １ ∶ ４ ０ ０作为阴性对照， 蛋白 以免疫鼠血清 １ ∶ １０ ０ ０作为阳性对照， 用方阵滴定法确 ｇ Ｇ Ｈ Ｒ Ｐ ） 的最佳 定包被抗原和酶标记抗体（ 山羊抗鼠 Ｉ ? 组合。结果判定： 样品 Ａ值大于阴性对照 Ａ值的 ２ ． １ 倍判为阳性。 １ ． ３ Ｂ Ａ Ｌ Ｂ／ ｃ 小鼠的免疫 第一周将纯化好的蛋白与等量完全弗氏佐剂进行 充分 乳 化 制 成 免 疫 原， 背 部 皮 下 多 点 免 疫 ４周 龄 Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ 雌性小鼠。３周后用不完全弗氏佐剂乳化同等 剂量蛋白后进行第 ２次背部皮下免疫， ４周后进行三 免。免疫第 ３次后 １ ０ ｄ 尾静脉取血测效价大于 １ ∶ １ ０ ０ ０ 以上， 用灭菌生理盐水稀释同等剂量蛋白尾静脉加强 免疫。小鼠加强免疫后第 ３天取脾细胞与骨髓瘤细胞 进行融合。 １ ． ４ 活体实体瘤细胞的制备 首先用 ８ 氮杂鸟嘌呤（ ２ ０ ｇ ／ ｍ ｌ ） 处理三代体外培 ? μ Ｐ ２ ／ ０细胞， 然后在进行抗原三免的前 １ ０天皮下 养的 Ｓ 注射于 Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ小鼠背部两侧， 每只小鼠注射 ５× １ ０ ５ ～ ５× １ ０ ６个细胞。１ ０～ １ ５ ｄ后， 注射骨髓瘤细胞的部 位会长出直径达 ２～ ３ ｃ ｍ 的实体瘤。融合当天无菌解 剖摘取实体瘤， 用剪刀将其剪成碎块， 然后用注射器内 芯在 ２ ０ ０目 的 铜 网 上 研 磨 过 滤。滤 液 转 移 到 离 心 管 中， 加无血清 Ｒ Ｐ Ｍ Ｉ １ ６ ４ ０培养液到 ３ ０ ｍ ｌ ， １０ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ离