人血管内皮细胞生长因子
血管内皮生长因子与骨关节炎
的受体 Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ － １ （ Ｆ ｌ ｔ － １ ） 、 ｖ Ｅ Ｇ Ｆ Ｒ ＿ ２ （ １ ①Ｒ ） 和Ｎ Ｒ Ｐ － １ 仅 在 Ｏ Ａ软骨 中表 达＿ １ 。而且 ， Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ大多分 布在 软 骨细 胞
表面＿ １ 。Ｊ ａ ｎ ｓ ｅ ｎ等Ｉ １ 报道在新西兰大 白兔早期 Ｏ Ａ模型 中检测到 Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ ｍＲ ＮＡ及 Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ高表 达 ， 预测 Ｖ Ｅ Ｇ Ｆ可 能成为 Ｏ Ａ早期诊断指标 。同样 ， Ｌ ｕ ｄ ｉ ｎ等＿ 报道 向大 鼠 】
Ｏ Ａ发病机制 中炎症与血管形 成机制发 挥着重要 作 用 。参与病理改变的细 胞 因子 有很 多 ， 如 炎症 因子 白细 胞介素（ Ｉ Ｌ ） 一 １ 、 Ｉ Ｌ － ８ 、 肿瘤 坏死 因子 （ Ｔ Ｎ Ｆ ） 、 血管 内皮 生长
膝关节注射 ＶＥ Ｇ Ｆ ８周后 ， 能够 在大 鼠膝关节 内观察 到 软骨变性 、 软骨钙化 、 骨化及滑膜增生等病理改变 。
Ｄ ＯＩ ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｒ Ｌ １ ６ ７ ３ — ７ ０ ８ ３ ． ２ ０ １ ４ ． Ｏ １ ． ０ ０ ６
骨关节炎（ ＯＡ ） 是 临床上最常见 的关节疾病之一 ， 是
全身易感 因素和局部机械 因素相互作用导致 的一种 以关 节软骨退行性病变为 主的骨关 节疾病 ， 超过 ６ ５岁 的老 年 人 中大多存在 ＯＡ的放射 学和 （ 或） 临床证 据 ］ 。Ｏ Ａ 主 要 累及腕关节 、 膝关节 、 髋关 节及 脊柱 ， 主要 表现 为受 累 关 节的疼痛 、 肿胀 、 畸形 、 功能 障碍 ， 影像 学上主要表 现为 受累关节 间隙变 窄 、 软骨 下骨 硬化 及骨赘 形 成＿ ２ 。 ］ 。ＯＡ
人血管内皮细胞生长因子受体2小干扰RNA的设计及其表达载体的构建
表达抑制率高。
【 键词】 小干扰 Ｒ 关 ＮＡ； 血 管 内 皮 细 胞 生 长 因子 受 体 ２ＶＥ Ｆ 一 ） ＨＬ ０ 胞 ； 表 达 载 体 （ Ｇ Ｒ２； ６细
Ｄｅ ｉ ｆ ｈｕｍ ａ ａｓ ｕｌ ｒ ｅ ｓｇｎ ｏ ｎ ｖ ｃ ａ ｎｄｏ ｈｅ ｉｌ ｒ ｔ ｌａ ｇ ｏｗｔ ｆ ｃｔ ｅ ｅ ｏｒ ２ ｓ ＲＮＡ ｎｄ ｃ ｓ ｒ ｃ ｉ ｎ ｆ ｉｓ ｅ ｒ ｓ ｉ ｎ ｈ ａ ｏｒ ｒ ｃ ｐｔ ｉ ａ ｏｎ ｔ ｕ ｔｏ ｏ ｔ ｘｐ ｅ ｓｏ
血管内皮生长因子对骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性脑血管疾病的影响
ｇａｕａ ｎ ．Ｇ ） 内源 性 细 胞 的 增 殖 。 此 外 。 多 的 神 经 ｒｎｌｒ ｏ ｅＳ Ｚ 的 ｚ 更
祖 细 胞 从 Ｓ Ｚ迁 移 到 缺 血 边 界 区 （ｓｈ ｍ ｃ ｂ ｕ ｄ ｒ ｚｎ ， Ｖ Ｉ ｅ ｉ ｏ ｎ ａｙ ｏ ｅ ｃ
成方 法 的应 用 ．用 Ｖ Ｇ Ｅ Ｆ治疗 缺 血 性 脑 血 管 疾 病 也 开 始受 到 关 注 。 近年 来 的研 究 表 明 ， 经 生 成 与 血 管 生 成关 系密 切 ， 神 提 示ＶＧ Ｅ Ｆ与骨 髓 间充 质 干 细 胞 联 合应 用 治 疗 缺 血 性 脑 卒 中具
缺 血 性 脑 血 管病 严 重 威 胁 着 人 类 健 康 ． 有 发 病率 高 、 具 致 残 率 高 和 死 亡 率 高 等特 点 。神 经发 生 （ｅｒｇｎｓ ） ｎ ｕｏｅｅｉ 与新 生 血 ｓ 管发 生 （ｎ ｉ ｅ ｅｉ） 实现 神 经 功 能 重 塑 的 必要 前提 。近 年 ａｇ ｇｎ ｓ 是 ｏ ｓ
用超 顺 磁 性 纳 米 氧 化 铁 颗 粒 （ ｕ ｅ ａａ ｇ ｅｉ ｏ ｘ ｅ Ｓ ｐｒ ｒ ｐ ｍａ ｎ ｔ ｍ ｉ ｎ ｏ ｉ ， ｓ ｒ ｄ
１３旁 分 泌 各 种 营 养 因 子 ．
Ｌ 等 ［ Ｂ Ｃ 经 静 脉 移 植 入 脑 ｉ ４ １ ＭＳ ｓ 将
梗 死 大 鼠体 内 ， 果 显 示 ， 结 细胞 移 植 治 疗 后 的 大 鼠神 经 行 为 功
脑 室 下 区 （ｕ ｖ ｎｒ ｕａ ｏ ｅ Ｓ Ｚ） 齿 状 回颗 粒 下 区 （ｕ ． ｓ ｂ ｅ ｔ ｃ ｌｒ ｎ ， Ｖ 和 ｉ ｚ ｓ ｂ
来 干 细胞 移 植 治 疗 缺 血 性脑 卒 中 的实 验 研 究 显 示 其 能有 效 改
血管内皮生长因子与肿瘤血管生成
成 因子 作用下 出现形态 学 改变 、Ｅ 和肿 瘤细 胞释放 蛋 白酶 ｃ 降 解 毛 细 血 管 基 底 膜 和 周 围 细 胞 外 基 质 、 Ｅ 从 毛 细 血 管 后 Ｃ 微 静 脉 迁 徙 形成 血 管 新 芽 、Ｅ 增 殖 和 肿 瘤 微 血 管 分 化 成 型 ６ ｃ 个 相对 独 立 的 步 骤 … 。 ２ 肿瘤血管生成 与血 管内皮生 长因子 （Ｅ Ｆ Ｖ Ｇ ）的关系 近 年 来 陆续 发 现 了许 多 血 管 生 成 因 子 和 生成 抑制 因子 。 １ ９ 年Ｈ ｎ ｈ ｎ ９ ６ ａ ａ ａ 等人提 出了 “ 管生成 的开 关平衡 ”假说 ， 血 即血管 生成 因子和抑 制 因子共 同调控血 管形 成 ，两 者 的平 衡 维持血 管 的稳定状态 。当血管 生成 因子增加 或抑制 因子 减 少，则平 衡被打破 ，导致肿瘤血管 生成 。 目前 发 现 的 血 管 形 成 正 负 调 节 因 子 有 ４ ～ ５ 种 ， 研 究 Ｏ Ｏ 最 为广泛 和深 入的是Ｖ Ｇ ，它 在多种 人类肿 瘤 中均 过度表 ＥＦ 达 ，是 肿 瘤 血 管 生 成 的 主 要 调 控 者 。
证 实 。由于Ｖ Ｇ Ｒ Ａ Ｆ Ｅ Ｆ ｍＮ ￣ 显子６ 编码的一段碱性氨基酸对肝 素有较高亲和 力，因此包含这 段残 基的变异体 （ Ｅ Ｆ ０ ， Ｖ Ｇ ２ ６ Ｖ Ｇ １ ９ Ｅ Ｆ ８ 及 可 能 的 Ｖ Ｇ １ ５ 由细 胞 产 生 后 直 接 Ｅ Ｆ ８ ，Ｖ Ｇ １ ３ ＥＦ ４ ） 保 留在 细胞膜 肝素样 分子 （ 白多糖 ）上 ，扩 散能力 弱 。 蛋 而 Ｖ Ｇ １５ Ｅ Ｆ ２ 这 两 个 可 溶 性 的Ｖ Ｇ 变 异 体 扩 散 能 力 Ｅ Ｆ ６ 、Ｖ Ｇ １ １ ＥＦ 强 ， 容 易 到 达 靶 细 胞 ， 具 有最 佳 的 生物 利 用 度 和 生物 潜 能 ， 因此与Ｖ Ｇ 的生物学活性密切 相关 “ ＥＦ 。 ４ ＥＦ Ｖ Ｇ 的生物 学作 用 ４ １ 促进 内皮细 胞增殖 。Ｖ Ｇ 是一种特异 的内皮细胞有丝 ． ＥＦ 分裂原 ，体外促 进 内皮 细胞生长 ，体 内诱导血管 发生 。 Ｖ Ｇ 选择 性地 作用于血 管 内皮细 胞膜 上 的两 种酪氨 酸蛋 白 ＥＦ 激 酶 受 体 Ｖ Ｇ Ｒ １ Ｅ Ｆ 一 一 般 认 为 这 两 种 受 体 主 要 在 Ｅ Ｆ 一 、Ｖ Ｇ Ｒ ２ 血 管 内 皮 细 胞 表 达 ， 有 少 数 其 它 细 胞 如 造 血 细 胞 、单 核 细
血管内皮生长因子在骨质疏松症中的研究
２ ＶＧ Ｅ Ｆ与 骨 重 建 的关 系
膜 内成骨或软骨 内成骨都离不开 同时进行 的血
管形成 ； 只有 血管 形 成 ， 能在 成 骨 部 位 出 现成 骨 细 才 胞 和破 骨细 胞 的前 身 细胞 。骨重 建 是 一 种 有序 的和 偶 联 的骨 吸 收和 骨 形成 过 程 。骨 重 建 发生 在 含 有 破
一
氧化氮 合 成 酶抑 制 。⑩ 激 活单 核 细 胞 ， 进 其 迁 促
１ ＶＧ Ｅ Ｆ的 生物 学 活 性
ＶＧ Ｅ Ｆ是一种高度特异性 的血管 内皮细胞有丝
分裂原 ， 在生理 和病 理 过 程 中均有 重 要 作 用 ， 与 细 它 胞 表面 特异性 受体结 合后具有 多 种生物 学 活性 ： 促 ① 进 血 管 生成 。Ｖ Ｇ Ｒ与 相 应 的 Ｖ Ｇ ＥＦ Ｅ Ｆ家 族 结 合 ， 形 成 二聚体 及酪氨 酸发生 自身磷 酸化 ， 活并 将 细胞 膜 激 ／细胞浆激 酶级联 反应信 号传 递到 细胞 核 ， 引发靶 可 细胞 的一 系列 变化 ， 进 内皮 细胞 的分 裂 、 移 和增 促 迁 殖 。② 增加 微小 血管 特 别 是 后 毛 细 血管 和 小静
用 。Ｈ ｙｍｉ 认为 Ｖ Ｇ ａａ Ｅ Ｆ诱 导血管 长入 软骨 ， 而使 从
软骨 内成 骨增 强 。Ｖ Ｇ Ｅ Ｆ不 仅可 以促进 软 骨 内成 骨 ，
细血管穿透侵入组织。⑤与 Ｉ 一 １ ４结合促进淋 巴管 ｔ
的生成 。⑥ 促进 软骨 内成骨 ， 加速 软骨 内骨痂 向骨 的 转 化 。Ｐ ｎ ｅ ｇ等 认 为 Ｖ Ｇ Ｅ Ｆ对 软 骨 细胞 的作 用 可 能
骨细胞 、 成骨 细胞 、 管 和血 管 周 围基质 组 织 的基 础 血
神经生长因子对人视网膜血管内皮细胞的影响
Ｈ Ｃ Ｃ细胞 数 目减 少 （ ＲＥ Ｐ＜０ ５ ， Ｋ ５ａ 度增加 Ｈ Ｃ Ｃ细胞数 目减少趋 势愈 加显 著 （ ． ）随 ２２ 浓 ０ ＲＥ Ｐ均 ＜００ ） 结 论 】 Ｎ Ｆ可 ． 。【 ５ Ｇ
促进 Ｈ Ｃ Ｃ的增殖 ， ＲＥ 该作用 可被 特异性 Ｔｋ ｒＡ阻 断剂 Ｋ ５ ａ所阻断 。 ２２ 关键词 ：神经生长 因子（ Ｇ ） Ｎ Ｆ ：人视 网膜 血管内皮细胞 （ Ｃ Ｃ ； ｒＡ阻断剂 Ｋ ５ａ ＨＲ Ｅ ） Ｔ ｋ ２ ２
１７ ． ６±００ ２ Ｐ均 ＜００ ） 随 Ｋ ５ ａ浓 度 增 加 （０ １０ ２ ０ｎ ｌＬ ， Ｇ ３ ． ， ５ ．５ 。 ２２ ５ 、０ 、０ ｍｏ ） Ｎ Ｆ＋Ｋ ５ ａ 正 常 氧 浓 度 时 分 别 为 ０８ ４－００ ７ ／ ２２ 组 ． ４ ． 、 ６ － ６
０４ ６±００ ５ ０２ ２±００ ８ 缺氧 条件 时相应 为 １０ ２－００ ７ ０７ ０±００ ５ ０４ １±００ ８ 较 同浓 度 Ｎ Ｆ １０ｎ ／ １组 ．９ ．２ 、 ． ０ ．７ ， ．４ ４ ．４ 、 ． － ０ ．６ 、 ． ０ ． ， ７ Ｇ （ ０ ｇ ｍ ）
Ａ ｓ ａｔ 【 ｂ ｃｖ】 ｏ ｂｅ ｅＮ Ｆｏ ｌｒ ｕ ａ ｔ ａｖｓｕ ｒｎｏ ｅａ ｃ ｌ Ｈ Ｃ Ｃ ｐ ｌ ｒ ｉ ． Ｍ ｔ ｄ】 ｂｔ ｃ： Ｏ ｊ ｔｅ Ｔ ｓｒ Ｇ ｃ ｔ ｅ ｈｍ ｎ ｅｎｌａｃｌ ｄｔ ｌｌ ｅｓ（ Ｒ Ｅ ） ｒｉ ａｏ 【 ｅ ｏｓ ｒ ｅｉ ｏ ｖ ｎ ｕｕ ｄ ｒｉ ａ ｅ ｈ ｉ ｌ ｏｆ ｔｎ ｅ ｈ
第 ３卷 １
２１ ０ ０年
第 １ 期 １ 月源自中 山大 学 学 报 （ 学 科 学 版 ） 医
Ｊ Ｕ Ｎ ＬＯ Ｕ Ａ —Ｅ ＮＶ Ｒ ＩＹ（ Ｄ Ｃ ＬＳ Ｉ Ｎ Ｅ ） Ｏ Ｒ Ａ ＦＳ Ｎ Ｙ ＴＳ Ｎ Ｕ ＩＥ ＳＴ ＭＥ ＩＡ ＣＥ Ｃ Ｓ
血管内皮生长因子及其受体与骨肉瘤关系的研究进展
ａｎｄ ｈｉｇｌｌ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｔｈｅｒｅ
ｅｔｏｎ
ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ
ｃｅｒｅｂｒｕｎｌ，ｋｉｄｎｅｙ，ｌｉｖｅｒ，ｓｐｌｅｅｎ，ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｓａｌｉｖａｒｙ ｓｌａｎｄ ａｎｄ ｓｋｅｌ—
ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ａｎｉｍａｌｓ．ＶＥＧＦ ｐｒｏｍａｔｅｓ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｍｉｔｏｔｉｃ ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ｓｔｉｍｕｌｕｓ ｃｅｌｌ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ
１．２
ＶＥＧＦ—Ｃ是目前肿瘤的一个研究热点，人类
ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＲ；Ｏｓｔｅｏｓａｌｌｅｏｍａ；Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ
【Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ】
血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，
而完成，在正常生理性血管生长过程中，如胚胎形成、骨骼生 长等。ＶＥＧＦ信号代表重要的限制酶（ｒａｔｅ・ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｓｔｅｐ）ＬＳ］， 通常表达量较少。但在病理情况下，ＶＥＧＦ的异常表达和缺 氧可刺激ＶＥＧＦ表达上调，通过与其特异性受体ＶＥＧＦＲ结 合，引起一系列信号传导，对内皮细胞具有强烈的促有丝分 裂作用，刺激血管内皮细胞增殖和血管通透性增加，促进新 生血管形成，改善组织供血。艾莉等”ｏ在肝癌缺血再灌注损 伤研究中发现，缺氧促进了癌旁组织转移相关基因ＶＥＧＦ的 表达。 ＶＥＧＦ家族的５个受体，即ＶＥＧＦＲ－ｌ（Ｆｉｔ－１）、ＶＥＧＦＲ．２ （ＫＤＲ／Ｆｌｋ．１）、ＶＥＧＦＲ－３（ｎｔ．４）、Ｎｐｎ・ｌ（Ｎｅｕｒｏｐｉｌｌｉｎ一１）和
监废鲑擅堂盘查兰Ｑ！Ｑ生鱼旦筮！墨鲞筮鱼翅垦ｂｉ望竺曼ｇ！鲤趔Ｑ翌！尘竺臣：』塑：垫！Ｑ：！塑：！！：堕Ｑ：鱼
血管内皮生长因子在乳腺癌中的表达及临床意义
Mod Diagn Treat 现代诊断与治疗2020 Jan 31 (1)•131 •相关。
吸烟是导致CHD发生的重要因素，也是CHD 患者PCI术后再狭窄的危险因素。
长期吸烟的患者 机体氧化能力降低，血管调节功能变弱，促进血管内 膜增生，从而促进ISR的发生W。
糖尿病会引起机体 代谢紊乱并损伤血管内皮，致使内皮功能不全，是导 致ISR发生的重要因素[9]。
高血压是指血压异常升 高的慢性疾病本研究结果显示，狭窄组中有30 例患者有合并高血压，占比78.95%，提示高血压是 诱发ISR的重要因素之一。
高血压可引起血管壁压 力持续升高，损伤血管内皮细胞，加剧动脉粥样硬化，从而导致ISR的发生％。
由此可见，戒烟、合理饮食，控制血糖、降压是降低冠心病患者PCI术后ISR发 生风险的关键所在。
此外，狭窄组支架直径显著小于 非狭窄组，提示置人较大直径的支架可降低ISR的发 生风险。
吴小朋等[12]研究发现，支架直径是ISR的影 响因素，置入较长直径的支架可有效减少ISR的发生 率。
本研究结果与之相符。
综上所述，在冠心病患者接受p e r冶疗期间对 吸烟、糖尿病、高血压、置入支架直径等相关危险因 素提前做出干预，可有效降低ISR的发生风险，对患 者术后恢复有积极的临床意义。
.参考文献：[1]高润霖.进一步改善稳定性冠心病的诊治:浅谈"中国稳定性冠心病诊断与治疗指南"亮点⑴.中华心血管病杂志，2018,46(11):833- 836.[2] 高立建，陈纪林.从循证医学的角度看冠状动脉旁路移植术与经皮冠状动脉介入治疗之争⑴.中国循环杂志，2018,33(12):1159-1161. [3] 王聪霞，范雅洁.冠心病血管内皮损伤与血管重构的研究进展⑴.西安交通大学学报(医学版)2018,39⑷:455-458.[4] 吴天源，李韶南，罗义，等.血清醛固酮对冠心病患者介入术后心血管事件和支架内再狭窄的预测价值[J].实用医学杂志,2018,34(2)：227-230.[5] 王洪涛，余文华，盛燕.静息心电图ST-T改变及静息心率与冠心病严重程度的相关性[J].中国老年学杂志，2019,39(12):2841-2844. [6；|熊青，陈集志，王洪如.684例冠心病患者P C I术后再狭窄发生率 影响因素分析[J].现代诊断与治疗，2018,29(24):4024-4026.[7]廖成标，蒋爱忠，乐建华，等.冠心病合并糖尿病患者支架植人后的预后效果探究[J].现代诊断与治疗，2017,28( 14):2638-2639.[8：]王娟，许浩博，乔树宾，等.吸烟的冠心病患者冠状动脉病变特点 及经皮冠状动脉介入治疗后长期预后评价[J].中国循环杂志，2018,33(11)：1〇53-1058.[9] 李强，李新阳，冯文化.血清晚期氧化蛋白产物对冠心病合并糖尿病患者冠状动脉支架植入术后支架内再狭窄的预测价值[J].中国 糖尿病杂志，2018,26(5):394-397.[10] 杨珍珍，赵存瑞，张锦，等.从血脂控制状况与支架内再狭窄的相关性看心脏康复管理的重要性[J].临床心血管病杂志，2017,33(7)：650-652.[11] 刘越，姚懿，宋莹，等.入院收缩压升高对行冠状动脉介入治疗的急性冠状动脉综合征患者远期预后的影响[J].中国循环杂 志，20丨8,33(5):429-434.[12] 吴小朋，孙慎杰，张娟，等.经皮冠状动脉介入治疗术患者发生支架内再狭窄的影响因素研究[J].中国全科医学，2015，18(16):1918- 1921.收稿曰期:2019-03-15血管内皮生长因子在乳腺癌中的表达及临床意义曹娟(江苏省连云港市赣榆区人民医院病理科，江苏连云港222100)摘要：目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)在乳腺癌中的表达以及临床意义。
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人血管内皮细胞生长因子A（VEGF-A）酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!
预期应用
ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中VEGF-A含量。
实验原理
用纯化的VEGF-A抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的VEGF-A抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物（TMB）显色。
TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的VEGF-A呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1、酶标板：一块（96孔）
2、标准品（冻干品）：2瓶，请临用前15分钟内配制。
每瓶以样品稀释液稀释至1ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为2,000pg/ml，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成2,000pg/ml，1,000pg/ml，500 pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml，样品稀释液直接作为空白孔0pg/ml。
如配制1,000pg/ml标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）2,000pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3、样品稀释液：1×20ml。
4、检测稀释液A：1×10ml。
5、检测稀释液B：1×10ml。
6、检测溶液A：1×120/瓶（1:100）。
临用前以检测稀释液A1:100稀释（如：10检测溶液A/990检测稀释液A），充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100/孔），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。
7、检测溶液B：1×120/瓶（1:100）。
临用前以检测稀释液B1:100稀释。
稀释方法同检测溶液A。
8、底物溶液：1×10ml/瓶。
9、浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10、终止液：1×10ml/瓶（2mol/L H2SO4）。
11、覆膜：5张
12、使用说明书：1份
自备物品
1、酶标仪（建议仪器使用前提前预热）
2、微量加液器及吸头，EP管
3、蒸馏水或去离子水，滤纸
标本的采集及保存
1、血清：全血标本请于室温放置2小时或4过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。
2、血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于1000g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。
3、细胞培养物上清或其它生物标本：请1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。
注：以上标本均应密封保存，4保存应小于1周，-20不应超过1个月，-80不应超过2个月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
操作步骤
实验开始前，各试剂均应平衡至室温，试剂不能直接在37溶解；试剂或样品配制时，均需
充分混匀，混匀时尽量避免起泡。
实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。
1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。
空白孔加样品稀释液100，余孔分别加标准品或待测样品100，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37温育2小时。
为保证实验结果有效
性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2、弃去液体，甩干，不用洗涤。
每孔加检测溶液A工作液100（临用前配制），酶标板加上覆膜，37温育1小时。
3、弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。
4、每孔加检测溶液B工作液（临用前配制）100，加上覆膜，37温育1小时。
5、弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。
6、每孔加底物溶液90，酶标板加上覆膜37避光显色（反应时间控制在15-30分钟，当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。
7、每孔加终止溶液50，终止反应，此时蓝色立转黄色。
终止液的加入顺序应尽量与底物
液的加入顺序相同。
8、立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（值）。
注：
1、试剂准备：所有试剂在使用前应平衡至室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。
实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。
2、加样：加样或加试剂时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。
一次加样时间（包括标准品及所有样品）最好控制在10分钟内。
推荐设置复孔进行实验。
3、温育：为防止样品蒸发，实验时将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发；
洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态；同时应严格遵守给定的温育时间和温度。
4、洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。
5、试剂配制：Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。
标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配制使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。
请精确配制标准品及工作液，尽量不要微量配制（如吸取检测溶液A时，一次不要小于10），以避免由于不准确稀释而造成浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液。
6、反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔10分钟），如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
7、底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
洗板方法
1、手工洗板方法：将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；根据需要，重复此过程数次。
2、自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
特异性
本试剂盒可同时检测重组或天然的人VEGF-A，且与其它相关蛋白无交叉反应。
计算
各标准品及样本OD值扣除空白孔OD值后作图（七点图），如设置复孔，则应取其平均值计算。
以标准品的浓度为纵坐标（对数坐标），OD值为横坐标（对数坐标），在对数坐标纸上绘出标准曲线。
推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert1.3，根据样品
OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
说明
1.在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。
所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。
2.小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。
请注意在吸取标本/标准品，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。
而且，洗涤不充分将影响试验结果。
3.试剂盒保存：部分试剂保存于-20℃，部分试剂保存于2-8℃，具体以标签上的标示为准。
4.浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
5.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
6.中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
7.所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。
8.有效期：6个月。