免疫组化原理及流程
免疫组化原理和步骤[1].docx
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免疫组化原理与步骤免蚪化操作规程.一、试验原理与意义免蚪叙化学又称免疫编鹿化学，是指带显色弼标记的待异性抗体在翅裂4UW位逋过抗原抗体反应和组蛆化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定・渊定的一『新技术。
它把免发反应的特异性、蛆场化学的可见性奇妙地结合起耒，借助星微传("英光星例h电子显微制的显像和放大作用，在编魔、及场鹿水平检涌各种抗原物质(tn量白质、多肽、∙、谶*、病原体以与受体等)。
二、试验》«微波炉、吹战机、坦化第、0盒、烯箱、提善善、染缸、光学里Ira、纯木浆卫生锻、计时善和通风播售。
三、试剂配制.1.0.01MPBS(pH7.34):9.0gNaC1.+50m1.0.2MPB加双篇水至1000m1.;I(XX)m1.0.2MPB(pH7.4)=5.93gNaH2PO4∙2H20+58.02gNa2HPO4>12 H2Oin1000m1.双蔡水或=19OmIA+81Om1.B(A.0.2MNaH2PO4∙2H2O:15.6gin5∞m1.ddH2O;B .0.2MNa2HPO4∙12H2O:71.632gin10∞m1.dH2O)。
2.CitrateBUfferedSa1.ine(0.01M曰»械，PH6.0):28m1.A÷72m1.B÷2∞m1.ddH2O(A.Citrateadd(⅞^11∣):10.5g加双蒸水至100Om1.;B.Citratesodium(柠棣戢制):29.4Ig加双燕水至100om1.)•.3.编制ft透液：由终浓度分别为0.3%双氧水希0.3%TritonX-1.∞混合而成。
配制方法是先用徵波加蒸的36m1.PBS,再接着加120u1. TritonX-100,并加热一儿，冷却至临用首加0.4m1.30%H202β4.5%羊血清或封闭血清，用PBS稀拜。
5.含0.03%H2O2的0.05%DAB(避光)：用20×DAB(1%,10mg∕m1.)5u1.+0.1u1.30%H2O2+95u1.PBS e6.一抗、二抗均用PBS稀稀。
免疫组化原理、步骤及要注意的事项
免疫组化原理、步骤及要注意的事项免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。
在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。
直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。
目前通常选用免疫酶组化间接染色法。
三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。
免疫组化一抗二抗原理
免疫组化一抗二抗原理一、免疫组化技术原理免疫组化技术是一种重要的生物化学检测方法，通过使用一抗和二抗的相互作用，来检测目标物质在细胞或组织中的分布和定量。
其原理主要包括以下几个步骤：1. 抗原表达和固定：首先，需要提取或制备出待检测物质的抗原，并将其固定在载玻片或微孔板上。
2. 样品处理：将待检测的细胞或组织样品处理，使其表达出目标物质。
3. 一抗处理：将经过特异性识别的一抗加入样品中，一抗能够与目标物质发生特异性结合，并形成抗原-抗体复合物。
4. 二抗处理：加入与一抗来源物种不同的二抗，二抗能够与一抗发生特异性结合，并进一步增强抗原-抗体复合物的信号。
5. 检测信号放大：通过连接二抗的酶标记物或荧光标记物，可以进一步放大信号。
6. 显色或荧光检测：通过加入适当的显色剂或荧光探针，可以将特定信号转化为可见的颜色或荧光。
7. 显微镜观察：使用显微镜观察和分析样品中的标记信号分布情况，从而确定目标物质的位置和数量。
二、免疫组化技术应用免疫组化技术广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域。
具体应用包括：1. 细胞和组织定位：通过标记特定抗原或蛋白质，可以确定其在细胞或组织中的定位，帮助研究者了解其功能和相互作用。
2. 疾病诊断：免疫组化技术可以检测疾病标志物，如癌症标志物、病毒抗原等，用于早期诊断和病情监测。
3. 药物研发：免疫组化技术可用于评估药物在细胞或组织中的靶点表达和药效。
4. 免疫组织化学：通过标记细胞或组织中的特定分子，可以帮助鉴定组织类型、识别病理变化以及评估治疗效果。
5. 免疫组化芯片：免疫组化芯片技术结合了高通量技术和多路复用的优势，可以快速、准确地检测多个标志物，有望在个性化医疗中得到广泛应用。
三、免疫组化技术的发展前景随着生物技术和分子生物学的不断发展，免疫组化技术也在不断创新和改进。
未来的发展方向主要包括：1. 自动化和高通量：通过引入自动化设备和流程，提高实验的标准化和效率，同时实现多个标志物的高通量检测。
免疫组化的原理
免疫组化的原理
免疫组化是一种利用抗体与其特异性抗原结合的反应来检测或定位特定分子的方法。
它主要基于抗体的高度特异性与高亲和力，能够识别并结合到抗原上。
免疫组化的过程一般包括固定组织、抗原还原、孵育抗体、洗涤、孵育二次抗体和检测。
具体步骤如下：
1. 固定组织：将待检测的生物组织固定在载玻片上，通常使用形式固定剂或冷冻剂进行固定。
2. 抗原还原：对固定组织进行抗原还原处理，以破坏抗原与抗体结合时的形态学阻滞并使抗原更易于与抗体结合。
3. 孵育抗体：将含有特异性抗体的抗体溶液加到载玻片上的组织切片上，允许其与目标抗原结合。
此时，如果组织中存在目标抗原，抗体就会与其结合形成免疫复合物。
4. 洗涤：通过洗涤步骤去除未结合的抗体，减少干扰性信号的产生。
洗涤通常使用磷缓冲盐溶液或其他缓冲溶液进行多次冲洗。
5. 孵育二次抗体：加入标记有酶、荧光物质或放射性同位素等的二抗溶液，使其与已结合的抗原-一抗复合物发生反应。
二次抗体通常是对多种一抗的特异性抗体。
6. 检测：使用相应的技术，如酶标记法、荧光标记法或放射性
探测等，检测二次抗体与抗原-一抗复合物的结合情况。
通过信号的产生和可视化，可以确定抗原的存在位置以及其表达程度。
总的来说，免疫组化是一种通过利用抗体与抗原间的特异性反应，实现对目标抗原的检测和定位的方法。
其原理主要是通过抗原-抗体的结合来实现对特定分子的识别和鉴定。
免疫组化灭活原理
免疫组化灭活原理
免疫组化灭活（Immunohistochemical Staining Inactivation）是指在进行免疫组化染色后，对组织标本中的染色信号进行灭活处理，以避免可能的信号干扰或保存组织样本用于后续分子生物学实验。
这种技术的主要原理是通过特定的处理方法，使得免疫组化染色所使用的染色物质或标记物不能再影响后续实验的结果。
免疫组化灭活的主要原理和步骤如下：
1. 免疫组化染色：
抗体反应：免疫组化染色过程中，用于检测目标抗原的抗体会与标本中的目标蛋白结合，形成可视化的染色信号。
信号放大：通常使用荧光标记或酶标记的二抗等，以提高染色信号的强度和清晰度。
2. 图像获取：
显微镜下观察或图像获取：获取染色信号的图像，以便对免疫组化染色结果进行分析和记录。
3. 免疫组化灭活：
选择灭活方法：根据染色所用标记物的性质，选择适当的灭活方法。
常见的包括使用高温、化学灭活剂或某些酶。
灭活标记物：对于荧光标记，常用高温（如95°C），以破坏荧光分子结构；对于酶标记，可使用特定的化学灭活剂。
4. 保存组织：
保存组织样本：灭活后的组织样本可用于后续的分子生物学实验，如基因表达分析、蛋白质分析等。
5. 后续实验：
防止干扰：通过免疫组化灭活，可以在保留组织结构的同时，避免染色信号对后续实验的干扰，如免疫印迹、基因表达分析等。
总体而言，免疫组化灭活是为了在进行免疫组化染色后，保留组织结构的同时避免染色信号对后续实验的干扰，特别是对于需要使用相同组织样本进行多个实验的情况。
免疫组化的原理及试验步骤
免疫组化的原理及实验步骤一免疫组化的原理免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
二免疫组化的实验步骤固定１．浸入式：将组织样本直接放入固定液（4%的多聚甲醛等固定液）内，4℃浸泡2小时，不超过12小时２. 灌注式：主要适用于脑部组织，用从心室灌注生理盐水排空血管中血液后灌注固定液切片1.石蜡切片：(1) 使用从低浓度到高浓度的乙醇使组织脱水；(2)将组织浸入二甲苯中透明；(3)在溶蜡箱中，组织被石蜡包埋；(4)将包埋好的蜡块冷却后固定于切片机上，切成薄片，并将薄片贴于玻片上；(5)用二甲苯脱蜡并重新从高到底浸泡乙醇；注意：石蜡切片制备好后还需要进行抗原修复以解开被甲醛交联的抗原决定簇上的氨基或羧基，常用方法有微波热修复，煮沸热修复，酶消化方法２. 冰冻切片：将固定的组织放入液氮或干冰-丙酮中迅速冷却，然后切片机切片，并将片贴于玻片上封固1.防止脱片，可以使用树脂胶或多聚赖氨酸进行黏附。
2.避免内源性过氧化酶的影响，可以用3%双氧水处理15min,(针对用过氧化酶标记的抗体)3.避免内源生物素的影响，可以鸡蛋清或卵白素进行封闭；4.避免非特异性染色，可以用二抗来源的血清进行封闭染色1.滴加稀释后的一抗，4℃过夜，PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；2.滴加稀释后的二抗，37℃孵育30min,PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；显色：选择与二抗配套的显色系统，进行反应，PBS终止反应后，用苏木素村然胞核，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，37℃干燥48小时，显微镜下观察。
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。
免疫组化的原理与操作
肿瘤分类
01
通过检测肿瘤组织中特定抗原的表达，有助于判断肿瘤的性质
和来源，为肿瘤的分类提供依据。
预后评估
02
免疫组化检测肿瘤细胞增殖、侵袭和转移相关的分子标志物，
有助于评估患者的预后和制定治疗方案。
靶向治疗
03
针对特定肿瘤相关抗原的免疫组化检测，有助于发现潜在的靶
点，为靶向治疗提供指导。
在感染性疾病诊断中的应用
病原体检测
通过检测感染组织中特定病原体的抗原或抗体，有助于确诊感染 性疾病的病因。
鉴别诊断
对于临床表现相似的感染性疾病，免疫组化检测有助于鉴别诊断， 为临床治疗提供依据。
流行病学调查
对感染性疾病的免疫组化检测结果进行分析，有助于了解疾病的 流行病学特征和传播途径。
在自身免疫性疾病诊断中的应用
自身抗体检测
控制显色反应的条件，避免背景染色和假阳性结果。
实验后的质量控制
1 2
结果判读
建立标准化的结果判读方法，确保结果的一致性 和可重复性。
室内质控
定期进行室内质控，评估实验的稳定性和可靠性。
3
室间质评
参与实验室间的质评活动，提高实验结果的可靠 性。
05
免疫组化在临床病理诊断中的应用
在肿瘤诊断中的应用
02
抗体选择与实验设计
抗体来源与特性
01
02
03
抗体来源
免疫组化抗体主要来源于 动物免疫系统，如小鼠、 兔、羊等，通过注射抗原 产生特异性抗体。
抗体特性
抗体具有高度的特异性， 能够识别并结合特定的抗 原，用于标记和定位组织 中的目标分子。
抗体纯度
高质量的抗体应具有高纯 度，低交叉反应性和低非 特异性结合，以提高实验 的准确性和可靠性。