酶工程实验论文

吉林农业大学

酶工程实验实习报告

实验名称：α-淀粉酶的固定化研究

小组成员：

院系：生命科学学院专业班级：

指导教师：职称：

2014年6月26日

α-淀粉酶的固定化研究

葛明昊常颖崔龙何晓敏孟凡琨

指导教师：朱学军

摘要：本实验比较了以卡拉胶和海藻酸钠为载体对α-淀粉酶进行固定化的效果，经试验最终采用以海藻酸钠为载体，采用包埋法制备固定化α－淀粉酶，通过单因素试验确定最优的固定化α－淀粉酶的条件。利用戊二醛作为再固化交联剂，进一步探究了包埋交联法进行固定化酶的条件，制备性质更为稳定的固定化酶。结果表明，最优工艺为海藻酸钠3％，氯化钙4％，戊二醛5%，交联时间2h。在此条件下，得到的固定化酶的温度稳定性、pH 稳定性以及底物浓度适应性均优于游离酶。

关键词：海藻酸钠；α-淀粉酶；固定化；戊二醛

α－淀粉酶（α－1，4－D－葡萄糖－葡萄糖苷水解酶）普遍存在于动物、植物和微生物中，它能以随机作用的方式切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子内的α－1，4 葡萄糖苷键，产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，被广泛应用于食品加工、粮食工业、乙醇工业、发酵和纺织业等多种行业，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。固定化酶与游离酶相比，具有热稳定性高、保存稳定性好、对变性剂耐受性强等优点，可重复或连续使用，且易于与产品分离，是食品、医药、化工等领域的研究热点之一。依据酶的性质和用途，酶的固定化方法主要可以分为以下4 种：吸附法、交联法、包埋法和共价结合法。

酶的固定化可以使用多种载体，其中海藻酸钠是一种从海藻中提取的亲水性胶态多聚糖，它是由β－（1，4）－D－甘露糖醛酸和α－（1，4）－L－古罗糖醛酸组成的线性高分子化合物，其分子含有自由的羧基和羟基，可溶于不同温度的水中，生物相容性好，稳定、无毒、成膜性或成球性好，是常用的囊材与载体材料，也常被用作固定化酶的载体。

本试验采用海藻酸钠包埋交联法制备固定化α－淀粉酶，得到最佳的固定效果，并对游离酶和固定化酶的酶学性质进行了比较。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

仪器：恒温水浴锅、抽滤装置、电子天平、722型可见分光光度计、容量瓶50ml、容量瓶100ml、容量瓶250ml、三角瓶、烧杯、量筒、吸量管、洗耳球、玻璃棒、注射器、刻度试管

材料：海藻酸钠、卡拉胶、α-淀粉酶、淀粉、麦芽糖、磷酸氢二钠、柠檬酸、去离子水、CaCl2 、3、5-二硝基水杨酸、NaOH、戊二醛

1.2 方法

1.2.1 麦芽糖含量标准曲线的绘制

取25ml刻度试管7个，编号，分别加入麦芽糖标准溶液（1mg/ml）0,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml，然后于各管加蒸馏水达2ml，再加 3,5-二硝基水杨酸试剂2ml，置沸水浴中准确煮沸5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至25ml，用722型分光光度计在520nm的

波长下进行比色，记录消光值，以消光值为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标制标准曲线。

1.2.2 利用卡拉胶进行α-淀粉酶的固定化

将0.5g酶溶于50ml蒸馏水中，搅拌溶解后，分别取10ml酶液加入90ml 2.0% 的卡拉胶溶液中，用玻璃棒混匀。将卡拉胶-酶混合液移入注射器中，适度加力，将卡拉胶-酶液滴入2% KCl2溶液中。滴完，将三角瓶移入20-22℃水浴中放置30min，倾去溶液，加入100ml 无菌去离子水冲洗2-3次。过滤，用滤纸适当吸干沉淀中的水分，，储存于4℃冰箱中备用。

1.2.3 利用海藻酸钠进行α-淀粉酶的固定化

将0.5g酶溶于50ml蒸馏水中，搅拌溶解后，分别取10ml酶液加入90ml 2.0% 的海藻酸钠溶液中，用玻璃棒混匀。将海藻酸钠-酶混合液移入注射器中，适度加力，将海藻酸钠-酶液滴入4% CaCl2溶液中。滴完，将三角瓶移入20-22℃水浴中放置30min。倾去溶液，加入100ml无菌去离子水冲洗2-3次。过滤，用滤纸适当吸干沉淀中的水分，储存于4℃冰箱中备用。

1.2.4 吸附交联法固定α-淀粉酶

将利用包埋法固定化α-淀粉酶的小球取出置于烧杯中，加入2%的戊二醛溶液，交联2h后滤出小球，用去离子水冲洗2-3次，过滤，用滤纸适当吸干沉淀中的水分，，储存于4℃冰箱中备用。

1.2.5 α-淀粉酶活力的测定

取6个试管，编号，前5只为试验管，第6只为对照管。向各管分别加入1ml 1mg/ml的游离酶液。向6只试管分别加入1ml pH为7的柠檬酸缓冲液。向对照管内加入4ml 0.4mol/L的NaOH溶液，以钝化酶的活性。将各管置40℃（±0.5℃）恒温水浴中保温15min，再分别向各试验管加入40℃下预热的浓度为1.0%的淀粉溶液2ml，向对照管加入40℃下预热的浓度为1.0%的淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5min后取出，向各测定管中迅速加入4ml 0.4mol/L的NaOH溶液，以终止酶活后准备下步测定。

取出以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各2ml，分别放入具塞刻度试管中，再加入2ml3,5-二硝基水杨酸混匀，置沸水浴中准确5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用722型分光光度计在520nm的波长下进行比色，记录消光值，从麦芽糖标准曲线中计算出麦芽糖含量，用以表示酶活性。

酶的相对酶活是指在同一组试验中，以活性最高的一组为100，其余的酶活力与之相比，计算百分数。

酶的固定效率=（固定化酶的活力/加入的总酶活力）×100% 1.2.6 单因素试验确定固定化酶固定方法

以固定化酶的相对酶活为考察指标，探讨海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、戊二醛浓度和交联时间对固定化酶活性的影响。①不同浓度海藻酸钠对固定化酶活性的影响。当氯化钙浓度为4％，戊二醛浓度为2％，交联 2 h，考察不同浓度的海藻酸钠（1％、2％、3％、4％、