魔鬼在于细节—CRISPR发展简史(此文很长,笔者多年拜读文献有感)
基因编辑技术的发展历程
基因编辑技术的发展历程Introduction科学家们在探索人体生物的基础和原因的过程中，基因编辑技术是一个重要的研究领域。
基因编辑技术通过改变DNA顺序来修改或替代一个组织或生物的遗传编码，从而影响其性状，为人类创造出重大疾病治疗方法，产生了革命性的技术突破。
I.世纪之交的早期基因编辑研究早在20世纪90年代，重组DNA技术已经开始被用于修饰基因序列，然而，直到2003年以前，基因编辑技术还未被广泛研究。
在2003年之后的一段时间里，科学家开始对基因编辑技术进行了广泛的探索和研究。
II. CRISPR技术的发现和应用在2012年的时候，CRISPR技术被首次发现，这一技术可以帮助科学家实现非常精确的基因编辑。
这个技术具有一些重要特性，比如易于使用和成本较低等特点。
在之后的几年里，科学家们利用CRISPR技术，成功实现了针对人类基因的编辑，并且使用CRISPR还实现了人类胚胎中基因编辑的颠覆性发现。
III. 基因编辑技术在治疗中的应用随着基因编辑技术不断的进化，研究人员开始探索利用这种技术来治疗一些致命的疾病，比如癌症、糖尿病、神经退行性疾病和心脏问题等。
研究人员使用基因编辑技术，成功地启动了一些临床试验，这些研究将有可能会为治疗一些疾病提供新的希望。
IV. 安全、道德和管制问题的讨论基因编辑技术的使用引发了一系列的安全、道德和管制问题的讨论。
人们开始提出一些问题，比如是否应该允许基因组编辑出现。
在许多区域里，为了确保安全性和保护道德准则，对基因编辑的使用进行了无数次的讨论和辩论。
V. 基因编辑技术的未来基因编辑技术的未来在很大程度上取决于它的技术进展。
虽然该技术已经进步了很多，但仍然有许多限制和未知因素，这些因素需要不断地研究才能得出优良的疾病治疗方案。
无论如何，这项技术不可避免地将在医学、农业和其他一些领域里继续发挥作用，为人们提供绝佳的服务。
基因编辑技术CRISPR
基因编辑技术CRISPR基因编辑技术CRISPR（CRISPR-Cas9）是一种革命性的基因编辑工具，它在生物学和医学领域引起了巨大的轰动。
CRISPR技术的出现，为科学家们提供了一种高效、精准、便捷的基因编辑方法，极大地推动了基因研究和基因治疗领域的发展。
本文将从CRISPR技术的原理、应用领域、优势和挑战等方面进行探讨。
首先，我们来了解一下CRISPR技术的原理。
CRISPR是“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”的缩写，意为“簇状规律间隔短回文重复序列”。
CRISPR技术最初是从细菌的免疫系统中发现的一种天然防御机制，细菌利用CRISPR系统来抵御病毒入侵。
而后科学家们发现，通过改造CRISPR系统中的Cas蛋白，可以实现对特定基因的精准编辑。
CRISPR-Cas9系统由两部分组成，一部分是CRISPR序列，另一部分是Cas9蛋白。
CRISPR序列可以通过设计特定的引导RNA与Cas9蛋白结合，形成一种“剪刀”，精准地切割目标基因的特定位置，从而实现基因的修饰、插入或删除。
基因编辑技术CRISPR在各个领域都有着广泛的应用。
在基础科学研究领域，CRISPR技术被广泛应用于模拟疾病模型、研究基因功能等方面。
通过CRISPR技术，科学家们可以精准地编辑细胞或生物体中的特定基因，从而揭示基因与生理过程之间的关系。
在农业领域，CRISPR技术被用于改良作物品种，提高作物的产量、抗病性和适应性。
通过编辑作物基因，可以使作物具有更好的抗逆性和品质，为粮食生产提供新的途径。
在医学领域，CRISPR技术被应用于基因治疗、疾病诊断和药物研发等方面。
通过CRISPR技术，科学家们可以修复患者体内存在的基因缺陷，治疗一些遗传性疾病，为个性化医疗提供可能。
相比传统的基因编辑技术，CRISPR具有许多优势。
首先，CRISPR技术操作简单，成本低廉，不需要复杂的设备和技术条件，普及性强。
CRISPR技术的进展与未来展望
CRISPR技术的进展与未来展望近年来，CRISPR技术成为了生命科学领域的热点话题。
CRISPR是一种基因编辑技术，能够精确地改变DNA序列。
它的诞生标志着生命科学领域的一个巨大飞跃，对疾病治疗、新药开发等有着深远的影响。
本文将探讨CRISPR技术的进展与未来展望。
一、CRISPR技术的背景CRISPR技术源于自然界中细菌免疫系统的一种特殊机制，可将外来病毒基因特异性地剪切并摧毁。
如何将这一机制应用到人类基因领域，则是CRISPR首要面临的问题。
许多科学家在CRISPR上投入了大量时间和精力，致力于寻找新的方法和实践，以便能更好地应用CRISPR技术。
人们解锁了生命科学的新奥秘，启动了新的基因编辑革命的源头。
二、CRISPR技术的进展CRISPR技术的进展无处不在。
截至目前，全球已经有超过50个国家和地区的400多家学术机构和企业，开展了与CRISPR相关的科研工作。
下面，将从四个方面进行具体阐述。
1、基因诊断CRISPR技术可用于诊断基因突变等人类基因缺陷。
科研人员可以通过不到10美元的成本检测千兆碱基，并对其进行编辑。
CRISPR技术在基因诊断领域可谓是一个巨大的进展，有望缩短疾病的初期诊断时间。
2、基因治疗基因治疗是指通过基因编辑技术，对特定基因进行修正或加工，从而治疗一系列人类疾病。
CRISPR技术的出现使得基因治疗成为可能。
一些重大的疾病，比如癌症，可以被CRISPR技术治愈。
3、农业科技CRISPR技术在农业科技领域也有着有捷径的应用。
通过改变植物的基因，可以使其生长更快更健康，从而提高农业产量。
这对解决全球日趋严重的食品短缺问题是非常重要的。
4、新药开发新药的开发需要花费巨额的时间和成本。
CRISPR技术的出现为新药的开发带来了新的思考方式。
CRISPR技术可以帮助科学家更好地理解疾病发病机理，从而研发出更安全有效的药物。
三、CRISPR技术的未来展望CRISPR技术创造了一种全新的生命科学生态系统。
CRISPR简述
CRISPR简述1、CRISPR 研究历史1987 年，日本课题组Ishino Y等在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后的研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002 年，Jansen等将其将其正式命名为clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)．2007 年，Barrangou 等首次发现并证明细菌可能利用CRSPR 系统对抵抗噬菌体入侵．2008 年，Marraffini 等又发现细菌CRISPR 系统能阻止外源质粒的转移。
2013 年初，CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术出现。
2、CRISPR的分布与分类已测序的接近90%的古细菌和40%的细菌的基因组或是质粒中至少存在一个CRISPR 基因座。
根据Cas 基因核心元件序列的不同, CRISPR/Cas 免疫系统被分为3 种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。
Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas 免疫系统需要多个Cas 蛋白形成复合体切割DNA 双链, 而Ⅱ型CRISPR/Cas 免疫系统只需要一个Cas9 蛋白来切割DNA 双链,目前Ⅱ型系统是被改造的最为成功的人工核酸酶。
3、CRISPR 位点结构CRISPR系统通常包括: 由不连续的重复序列(repeats,R) 与长度相似的间区序列( spacers,S) 间隔排列而成的CRISPR 簇，前导序列( Leader,L) 以及一系列CRISPR 相关蛋白基因(cas) 。
前导区一般是处于CRISPR位点上游由300bp~500bp 碱基组成的一个AT 富集的区域。
这个区域一般来说在种内是比较保守的但在种间却有显著的差异。
重复序列一般由23bp-50bp的碱基组成, 其平均长度在31bp左右。
间区由17bp-84bp 碱基组成平均长度在36bp左右。
4、CRISPR/Cas 作用机制对于CRISPR/Cas 的作用机理可以分为三个阶段来理解，第一是CRISPR 的高度可变的间隔区的获得，第二是CRIPSR 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)，第三是CRISPR/Cas 系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰。
CRISPRCas9：基因编辑的历史与发展
CRISPRCas9：基因编辑的历史与发展CRISPR/Cas系统是细菌和古菌特有的一种天然防御系统，用于抵抗病毒或外源性质粒的侵害。
当外源基因入侵时，该防御系统的CRISPR 序列会表达与入侵基因组序列相识别的RNA，然后CRISPR 相关酶(Cas)在序列识别处切割外源基因组DNA，从而达到防御目的。
根据Cas蛋白的特点，可将CRISPR/Cas系统分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。
Ⅰ型和Ⅲ型系统需要借助复杂的蛋白复合体发挥作用，Ⅱ型系统仅借助Cas9蛋白和sgRNA即可对靶目标进行编辑，结构简单，操作容易，因此目前主要使用Ⅱ型CRISPR/Cas9 系统。
CRISPR/Cas自诞生以来，迅速发展，已经成为生命科学领域最耀眼、最有前景的技术。
尤其是近两年，在全世界科学家的共同努力下，CRISPR/Cas相关新进展新突破不断涌现。
一、基因编辑技术的发展史基因编辑可以分为三代，第一代：ZFN；第二代：TELEN；第三代：CRISPR/Cas。
这三个基因编辑技术都利用了DNA修复机制，所以我们先来了解一下DNA修复机制（图1）。
图1-NHEJ修复（左），HDR修复（右）NHEJ（Non-homologous end joining）非同源性末端接合NHEJ修复机制不需要任何模版，修复蛋白直接将双股裂断的DNA末端彼此拉近，在DNA连接酶的帮助下重新接合（图1）。
HDR（Homology directed repair）同源重组修复当细胞核内存在与损伤DNA同源的DNA片段时，HDR才能发生。
NHEJ的机制简单又不依靠模版，因而NHEJ的活性相对于HDR 高出许多。
但NHEJ修复出错的概率较高，容易造成移码突变等，基因编辑正是利用了这一点（图1）。
1.ZFN的识别切割机制融合锌指模块和FokI切割结构域形成ZFN ；以二聚体的形式靶向切割每个锌指结构；特异识别3个碱基；组装多个锌指结构(识别12-18bp)形成的ZFN对可特异切割基因组靶点（图2）。
基因编辑技术CRISPR的突破与发展
基因编辑技术CRISPR的突破与发展在过去的几十年里，生物技术的发展让科学家们对基因编辑技术充满了希望。
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种基因编辑工具，它的价值在于它让我们得以更加精确、快捷地对基因进行编辑。
自从2012年科学家发现CRISPR后，CRISPR技术便成为了生命科学中非常热门的话题。
本文将深入探讨CRISPR技术的突破和发展。
1. CRISPR的原理CRISPR是一种基因编辑技术，它能够精确地更改或切除基因。
CRISPR技术利用CRISPR-Cas9复合物，这种复合物包含了一个叫做Cas9的酶和一条RNA，这条RNA可以识别和与DNA上的特定序列配对。
当RNA和DNA配对后，Cas9酶就会在这个位置上切断DNA，从而实现对基因的编辑。
2. CRISPR的突破CRISPR技术的突破主要在于它的高效性、精准度和可控性。
首先，CRISPR技术的高效性使得科学家们可以在短时间内快速地更改大量基因。
这让CRISPR成为了生物技术领域中的一股强大势力。
其次，CRISPR技术的精准度非常高，这让科学家们可以更加准确地编辑目标基因，从而得到更加精确的结果。
最后，CRISPR技术的可控性也非常重要。
科学家们可以利用CRISPR技术来控制基因组中的多个环节，这里所说的环节包括转录、翻译和miRNA制造等。
3. CRISPR在医学方面的应用基因编辑技术对于医学领域的发展是非常有益的。
CRISPR技术通过编辑人类基因，可以治疗一些遗传病，比如丙肝病毒感染、糖尿病等疾病，这些疾病目前还没有治愈的方法。
同时，CRISPR技术还可以用于癌症的治疗。
基因编辑技术使得癌症治疗变得更加个性化且有效。
另外，CRISPR技术还可以在生殖领域使用，帮助夫妇解决一些不孕不育的问题。
4. CRISPR的未来展望CRISPR技术可以被认为是生命科学领域的新奇和革命性技术。
CRISPR基因编辑技术的发展及其应用
CRISPR基因编辑技术的发展及其应用随着科技的不断进步，CRISPR基因编辑技术已经成为了当今科学领域最重要的技术之一。
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种通过CRISPR-Cas系统实现精确切割DNA的技术，它可以实现人工修改基因，制造与改良生命体，对疾病进行剖析及治疗等多种应用。
CRISPR基因编辑技术的发展历程CRISPR核酸干扰系统最早是由瑞典乌普萨拉大学的Jennifer Doudna和美国加州大学伯克利分校的Emmanuelle Charpentier两位科学家于2012年发明的。
这项技术之后不断得以提高完善，引起了全球科学家的高度关注。
2015年，CRISPR-Cas9基因编辑技术作为《科学》杂志的年度重大突破并获得了诺贝尔奖的提名。
极高的关注度，使得CRISPR 技术得到了广泛的应用并不断发展。
现如今，CRISPR技术在基因研究领域得到了广泛应用，对人类的健康与未来发展将起到越来越重要的作用。
CRISPR基因编辑技术的应用1. 治疗人类疾病。
CRISPR-Cas9技术为治疗一些传染病、遗传病和癌症等疾病提供了新的解决方案。
相比传统医疗，CRISPR基因编辑技术不仅可以精准、快速地找到基因的问题，更能通过定制药物针对一些特定的基因突变进行治疗。
2. 农业领域的改良。
CRISPR技术可以用于设计更均匀、健康和耐旱的植物，帮助提高农作物的产量。
此外，还可以通过调制部分基因使得食品更加优秀、更健康。
3. 基因研究的新突破。
CRISPR基因编辑技术不仅可以揭示基因的遗传与动力学和机制，还可以通过精确定位的方式清晰展示出基因的分离和功能。
CRISPR技术的优势相比传统的基因治疗技术，CRISPR基因编辑技术具有以下优点：1. 更加高效。
CRISPR技术是一种非常精确的技术，能够在很短的时间内完成基因编辑，精度可以达到90%以上。
CRISPR基因编辑技术的发展与未来方向
CRISPR基因编辑技术的发展与未来方向CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）系统是一种基因编辑技术，可通过切掉不需要的基因序列然后插入新的序列来修改细胞基因组。
该技术的发明者被授予了2018年的诺贝尔化学奖，其重大贡献是使基因编辑变得更加简洁、直接和高效，有望在医学领域产生革命性影响。
本文将介绍CRISPR技术的背景、发展历程和应用前景，分析这一技术所面临的挑战和未来发展方向。
一、CRISPR技术的背景和发展历程CRISPR系统是一种细菌天然的免疫系统，由CRISPR序列和Cas蛋白组成。
CRISPR序列是由短重复序列和间隔序列组成的一种特殊的DNA序列，类似于免疫记忆系统。
细菌在面对病毒感染时，将病毒DNA切割并保存在CRISPR序列中，以便以后抵抗相似病毒感染。
这使得CRISPR/Cas系统在生物学领域具有巨大的潜力，因为它提供了一种可以定向切割和编辑基因组的方式。
CRISPR技术的发展历程可以追溯到1987年，当时位于日本的研究团队首次发现了CRISPR系统。
2007年，慕尼黑工业大学的研究员Sylvia Spengler成功提取了CRISPR序列中的RNA，并与微生物遗传学家Emmanuelle Charpentier合作，探究了这种RNA 的功能。
2011年，Emmanuelle Charpentier和Jenniffer Doudna在Nature上发表了一篇名为“CRISPR-Cas：一种基于RNA导引的细菌免疫系统”的文章，揭示了CRISPR/Cas系统的本质和作用。
此后，有很多科学家和公司开始发展CRISPR技术，并应用于不同的生物领域。
2018年，Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna 因CRISPR技术的发明被授予了诺贝尔化学奖。
二、CRISPR技术的应用前景CRISPR技术拥有令人兴奋的应用前景，可以用于精准医疗、农业生产和环境修复等领域。
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魔鬼在于细节—CRISPR发展简史（此文很长，笔者多年拜读文献有感）订阅号APExBIO美国时间2018年9月10日，美国联邦巡回上诉法院（CAFC）发布了一项重磅裁定，维持美国专利审判与上诉委员会（PTAB）的判决，将CRISPR基因组编辑专利授予隶属于哈佛大学与麻省理工学院的Broad 研究所。
美国专利及商标局宣布Broad研究所继续保有2014年获批的CRISPR-Cas9应用专利。
2017年2月15日，PTAB曾作出关键裁决，将CRISPR-Cas9基因编辑专利判定给张锋及Broad 研究所。
这意味着这项革命性的基因编辑工具的专利之争基本上尘埃落定。
自2012年CRISPR基因编辑技术横空出世以来，各路科研“豪杰”争相应用和发展该技术。
随着CRISPR系统趋于成熟，这一技术不再是简单的学术共享，谁拥有革命性基因编辑技术专利权的战争也出现了。
打官司的两方是美国加州大学伯克利分校生物学家Jennifer Doudna团队和美国哈佛大学-麻省理工学院Broad 研究所张锋团队。
CRISPR诞生将近6年，其中的发展过程曲曲折折。
虽然这项判决再次将Jennifer Doudna团队打入寒冬，但我们心里都清楚CRISPR基因编辑系统发展到今时今日所带来的影响，绝非是一个团队的功劳。
每个团队的表现都不可否认，都值得我们尊敬！让我们回顾一下长达6年的CRISPR发展简史！CRISPR演义自从CRISPR第一次被证明可以编辑细胞Genomic DNA以来一晃已经快6年了，笔者有幸在这个技术刚出来时就开始追踪和利用，受益匪浅，尤其是得益于张锋实验室的无私贡献，他们把各种最新的质粒几乎是第一时间免费放到Addgene供学术界使用。
2013到2015这两年，笔者几乎每一篇CRISPR文章都拜读了，随着时间的流逝，很多细节都不记得了，于是决定重新精读这批经典老文章。
随着时间的沉淀，返回去重读时，总是有很多事后诸葛亮的意见。
于是兴之所至，决定把自己的心得体会记下来，以免时间长了又遗忘了。
西方有句谚语：魔鬼在于细节，对于生物学研究尤其如此。
因此我的随笔都是纠结于细节，希望从细枝末节中看出一些端倪，加上自己的合理想象，猜测那些文章作者背后的想法。
事先声明，笔者不认识任何一个做CRISPR的大牛，不知道他们的任何八卦，所以这些想法都是猜测，算不得数，正所谓演义而已。
万一不幸被我猜中，也不担负任何泄密之责。
笔者不打算讲CRISPR在细菌里是怎么被发现的，以及一些牛人们是怎么根据DNA序列的相似性而猜出其作用机制的。
只从2012年8月Doudna和Charpentier的Science 文章开始谈起（这篇文章其实当年6月份就上线了）。
Science. 2012 Aug 17. PMID: 22745249.西方科学的精髓就是还原法，对于我们不了解的东西，对它们敲敲打打，拆下一个零件看看发生了什么；再多加一个零件，看看又发生了什么。
然后以此来想象一下它们是怎么工作的。
这就是生物学里的著名的”Loss of Function”和”Gain of Function”。
在这里，笔者就不再扯那些遗传学里的东西了，比如什么筛选突变基因之类的。
只是想说由于CRISPR的出现，使得Loss of function和Gain of Function在哺乳动物里的研究变成非常容易的东西。
书归正传。
在介绍这篇文章之前，先介绍几个名词。
crRNA, tracrRNA , sgRNA 和PAM。
还别说，前面这俩词，我这个记性不好的人以前是经常忘掉都指的是什么东西。
CRISPR RNA (crRNA)：指的是一个含有42个碱基的小RNA，它的5’是20个可以和目标DNA配对的碱基，所以是可变的；它的3’是22个不变的碱基，术语叫”repeat”。
之所以叫”repeat”,大概是因为它在细菌DNA里重复很多次的原因。
trans-activating crRNA (tracrRNA)：指的是一个大概含有87个碱基的小RNA，它的5’可以和crRNA的3’ “repeat”配对，术语叫做”anti-repeat”，除此之外，其它部分可以形成hairpin样的二级结构。
这俩RNA结合在一起后可以与Cas9结合，然后通过那20个可变的RNA识别含有PAM的genomic DNA。
因为现在最常用的是Cas9，而CRISPR有很多不同的亚类，所以为了不混淆，通常都是写为CRISPR-Cas9。
Single guide RNA (sgRNA)：就是通过4个RNA碱基把crRNA和tracrRNA连接起来成为一个RNA。
Doudna和Charpentier率先创造，在in vitro证明可以工作，然后George Church组把它发扬光大，张锋组也笑纳之，并且开发出了另一个可以做CRISPR activation的牛逼东西。
此乃后话，暂且不表。
Protospacer Adjacent Motif (PAM)：所谓的protospacer就是指那20个可以被识别的DNA序列，它的后面必须带几个比较特别的碱基，这几个碱基就是PAM。
对于Cas9来说就是NGG。
Cas9上有一个domain可以识别这个PAM，因为不同的Cas protein识别的PAM不同，所以这个domain在不同的Cas里不保守。
这篇Science文章如何牛逼咱就不提了，因为它会拿炸药奖的。
在这里我只讲那些细枝末节和事后诸葛亮的东西。
因为这篇文章发表之后半年多，张锋实验室和George Church实验室就率先在哺乳动物细胞里实现了基因编辑，发了两篇Science。
而Doudna晚了一小步，做的结果又不是特别漂亮，发了ELife。
还有一个陪跑的, MGH的Keith Joung在斑马鱼里实现了基因编辑。
那么Doudna有没有可能率先发表哺乳动物细胞编辑的文章呢？完全可以。
她们其实已经手握所有的东西，可惜要么是没有想到，要么是想偏了，竟然放着自己的特长不用，而用质粒来做。
这个呆会儿再说。
现在先说说张锋和George Church的两篇文章。
很明显，George Church组是在Doudna 和Charpentier的文章的启发下做的，为此他们用了两个牛人一起做，共同贡献第一作者；张锋组也是俩共同贡献第一作者，而Doudna组只有Jinek一个第一作者，加上其他打酱油的（这下明白Doudna组为什么被scoop了吧，我还怀疑她们发了Science后有些懈怠，度假去了）。
George Church组的开篇介绍就是他们看到了Doudna和Charpentier的文章，所以他们要做哺乳动物细胞编辑。
而且采用了Doudna和Charpentier率先使用的chimeric gRNA （就是把crRNA and tracrRNA通过4个碱基连接成一个，现在叫sgRNA），幸运的是Church 组用了original tracrRNA sequence，而没有采用Doudna和Charpentier试验过的短一点的tracrRNA。
很不幸，Doudna组试验了自己在in vitro测试过可以工作的短的tracrRNA，当然她们也试了长的，估计因为是用的guide RNA 的效率不好，没有看到显著差别，都很差。
就因为这个，Doudna在她们后来发表的Cas9 structure的Science 文章里，连着两次单独引用Church组的文章，而没有包括张锋组的。
张锋组的文章的引用是和另外两篇文章一起引用的。
其中原因，耐人寻味。
当然这只是我的个人猜测，通过现象看到的，说不定是人家忘了呢，犯了个小错误呢。
张锋组的文章风格明显不一样，这或许是因为人家本来就已经在用CRISPR-CAS9做这个哺乳动物细胞基因编辑了。
一开始他们试了很多条件，要加nuclear localization signal让Cas9在细胞核里表达，为此还专门有一个图显示这个。
（话说当年报道韩春雨时，他也特意提到自己看到NgAgo在细胞核里表达时自己有多开心，不知道是不是受张锋启发，以为定位到细胞核里就肯定可以编辑了，然后编出了这么一篇折腾大牛们的故事。
扯远了。
）还试验了细菌CRISPR里需要的RNAaseIII等等，这些在Church组的文章里就没有。
这些都成为了张锋组独立开始做哺乳动物细胞基因编辑的有利证据。
当然张锋组也借鉴了Doudna 和Charpentier的文章，比如用了那个sgRNA的设计，也发现了短的不好用，长的才好用。
Sometimes, size does matter.那么Doudna组到底有没有可能在2个月的时间做完哺乳动物细胞编辑，从而scoop其他人呢?完全有可能。
当然这些都是事后诸葛亮。
现在做基因编辑的载体工具数不胜数，有lentiviral vector, Adenoviral vector, AAV, cas9 mRNA plus crRNA:tracrRNA, cas9 RNP。
就是这个Cas9 RNP，全称是Cas9 ribonucleoprotein。
当时Doudna组已经有了所有的材料，只需要在Cas9上再加一个Nuclear Localization Signal，然后在细菌里面表达纯化蛋白，这都是她们的拿手好戏。
把新的Cas9 蛋白和她们手里的crRNA:tracrRNA在体外混合一下，然后转染到293FT细胞里面，就可以了。
她们已经测试了好几个GFP的gRNA，也完全可以建一个293FT GFP reporter细胞系，然后做RNP转染。
不出俩月，肯定可以做完。
只可惜不知道当时她们为什么没有想到这个，而是舍近求远的用质粒来做转染，而且还只选了一个CLTA的gRNA，效果不好。
不禁让人惋惜。
另外一个让人费解的是Doudna 当时为什么不多放几个人上去，而只让一个人做。
估计是当时没有意识到竞争这么激烈。
也可能是某人不愿意其他人做自己的课题，这又涉及到科研里面的合作共赢的处理了，不是每个人都能够做到合作共赢的，大部分人都是想吃独食的。
可在这个世界上，这样做的结果往往就是双输。
当然竞争的好处就是我们这些吃瓜群众可以早点用上这么好的东西。
想当初，张锋他们组可是开了一个Google Groups，张锋亲自上去答疑。
而且更新换代是如此频繁，往往是旧的技术刚用上没有几个月，新的就出来了。
还记得同实验室的一个哥们率先使用，还是用Church组的方法，用GFP reporter 来测试gRNA好不好用。
很快张锋组就发了一个NBT文章，建立了可以预测gRNA off-target 的网站。
还用double nickase的方法来进一步降低off-target，并且做出了pX450之类的质粒。