一种利于蛋白质回收的快速SDS_聚丙烯酰胺凝胶电泳染色_脱色方法
三种蛋白染色方法在SDS_聚丙烯酰胺凝胶电泳中的应用_陈琳
三种蛋白染色方法在SDS 2聚丙烯酰胺凝胶电泳中的应用陈 琳,张亚东,赵艳华,马 平,卜凤荣(军事医学科学院野战输血研究所,北京 100850)[摘要] 目的:比较S DS 2聚丙烯酰胺凝胶电泳(S DS -PAGE )中蛋白染色的3种方法。
方法:将S DS 2PAGE 中的蛋白分别用银染、铜染和考马斯亮蓝染色,并对铜染或考马斯亮蓝染色后的蛋白进行相应的复染。
结果:快速银染法灵敏度最高,但操作步骤繁琐,染色时间约50min ;考马斯亮蓝染色灵敏度最低,需染色和脱色,时间约为1h ;铜染灵敏度介于银染和考马斯亮蓝染色之间,但染色时间仅5min ,不需脱色,且可直接用考马斯亮蓝或快速银染法复染。
结论:用S DS 2PAGE 进行蛋白检测时,铜染可作为蛋白快速分析的首选方法。
[关键词] 电泳,聚丙酰凝胶;蛋白染色方法;蛋白质类;银染色[中图分类号] Q503 [文献标识码]A [文章编号] 100025501(2000)0420292202Application of three kinds of staining methods for protein in SDS 2PAGECHEN Lin ,ZH ANG Ya 2dong ,ZH AO Yan 2hua ,MA ping ,BU Fong 2rong(Institute of Field T rans fusion ,Academy of M ilitary Medical Sciences ,Beijing 100850,China )[Abstract] Objective :T o com pare three kinds of staining methods for proteins in S DS 2PAGE.Methods :The proteins in S DS 2PAGE were stained with coomassie brilliant blue staining ,copper staining and silver stain 2ing.Then the proteins were restained after coomassie brilliant blue staining or copper staining.R esults :The silver staining was the m ost sensitive ,the sensitivity of the copper staining was the former between that of silver staining and the coomassie brilliant blue staining.It took only five minutes to stain proteins with copper stain 2ing.A fter copper staining ,the proteins could be restained by silver staining or coomassie brilliant blue stain 2ing.Conclusions :C opper staining could be the first choice for rapid analysis of proteins in S DS 2PAGE.[K ey w ords] electrophoresis ,polyacrylamide gel ;protein staining ;proteins ;silver staining S DS 2PAGE 是Shapiro 于1967年建立的,经过不断的改进、完善,现在已广泛应用于蛋白质分析。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术在蛋白质分析中的应用
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术在蛋白质分析中的应用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生物化学和分子生物学研究领域。
本文将介绍SDS-PAGE技术的原理、步骤和在蛋白质分析中的应用。
一、SDS-PAGE技术原理SDS-PAGE是一种基于凝胶电泳的蛋白质分离方法。
其原理主要包括以下几个方面：1. 阳极和阴极：SDS-PAGE通常使用一根阳极和一根阴极来建立电场。
蛋白质在电场中受到电荷的作用向阳极（正极）方向迁移。
2. 胶状物质：SDS-PAGE通常使用聚丙烯酰胺凝胶作为载体。
这种凝胶具有延展性和孔隙性，可用于分离不同大小的蛋白质。
3. SDS：SDS（十二烷基硫酸钠）是SDS-PAGE中使用的表面活性剂。
SDS与蛋白质结合形成带负电荷的复合物，使蛋白质在电场中获得了净负电荷。
4. 分子量标记物：SDS-PAGE通常在凝胶中加入已知分子量的蛋白质标准，用于推断待测蛋白质的分子量。
二、SDS-PAGE技术步骤SDS-PAGE技术一般包括以下步骤：1. 样品制备：将待测的蛋白质样品进行处理，如加入SDS和还原剂（如二巯基乙醇）使蛋白质变为线性形式。
2. 凝胶制备：制备聚丙烯酰胺凝胶，一般使用垂直凝胶电泳系统。
将聚丙烯酰胺溶液与启动聚合剂和TEMED混合，然后注入凝胶封闭装置。
3. 样品加载：将样品加入凝胶孔洞中，一般使用微量移液器逐孔加入，并同时加入已知分子量的蛋白质标准。
4. 电泳：将装有样品的凝胶装置放入电泳槽中，将电源接通，设定合适的电压和电流。
经过一段时间的电泳，蛋白质将根据其分子量迁移至不同的位置。
5. 凝胶染色和分析：将电泳结束的凝胶用染色剂（如Coomassie蓝）染色，可使蛋白质呈现出明显的蓝色条带。
通过比较标准品条带与待测蛋白质的条带位置，可以推断出待测蛋白质的分子量。
三、SDS-PAGE技术在蛋白质分析中的应用SDS-PAGE技术在蛋白质分析中具有广泛的应用，包括以下几个方面：1. 分离和纯化：SDS-PAGE可以将复杂混合物中的蛋白质分离出来，并可根据其迁移位置进行纯化。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）CHANG X C[实验目的]（1）掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。
[实验原理]电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。
许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。
电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
电泳过程必须在一种支持介质中进行。
最初的支持介质是滤纸、醋酸纤维素膜和硅胶，这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。
但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。
凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。
最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）分为“连续系统”和“不连续系统”两种电泳系统，在本实验中选用不连续系统。
“不连续系统”最大的优点在于大大提高了样品分离的分辨率。
这种电泳的主要特点是：①使用两种不同浓度的凝胶系统；②配制两种凝胶的缓冲溶液成分及pH不同，并且与电泳槽中电泳缓冲液的成分、pH也不相同。
在本实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶或成层胶，配制此层胶的缓冲液是Tris-HCl，pH6.7；下层胶则是高浓度的小孔胶，称为分离胶或电泳胶，成胶的缓冲液是Tris-HCl，pH8.9；电泳槽中的电极缓冲液则是Tris-甘氨酸，pH8.3。
可见，凝胶浓度、成胶成分、pH与电泳缓冲系统各不相同，形成了一个不连续系统。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)实验报告一、实验目的1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理；2.掌握垂直板电泳的操作方法。
二、实验原理1、电泳：(1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
(2)影响电泳效果的因素：①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；⑥离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；⑦电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；⑧支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）(1)定义聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）(2)SDS的作用SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小(3) SDS-PAGE分类：¾SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类：连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳(4)聚丙烯胺凝胶的生成：聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。
(完整版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳班级：生工xxx姓名：xxx同组人：xxx学号：xxxx日期：xxxxSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1 引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色[1]。
本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。
2 材料和方法2.1实验原理2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。
通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。
由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。
2.1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。
本实验是用化学聚合。
化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。
在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。
叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。
通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。
生物化学实验-SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量
实验原理
电泳：是带电颗粒在电场作用下，作定向运动即 向着与其电荷相反的电极移动的现象。 电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据 各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷 多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。 区带电泳是样品物质在一惰性支持物上上进行电 泳的过程。因电泳后，样品不同组分形成带状区 间，故称区带电泳。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的SDS时，蛋白质分子 的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其他因素对电泳 迁移率的影响几乎可以忽略不计。当蛋白质的分子量在 15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关 系，符合下列方程式：
lg MW=-b·mR+K MW为蛋白质分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，k为截 距。在条件一定时，b和K均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图， 可获得一条标准曲线。未知蛋白质的相同条件下进行电泳，根 据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
实验步骤
凝胶的制备 蛋白质样品的处理 加样：用微量注射器依次在各个样品槽内加样，各加
10～15μl（含蛋白质10～15μg），稀溶液可加20～30μl
电泳凝胶配方：
30.8%Acr-Bis
1.5mol/l Tris(pH8.9)
0.5mol/l Tris(pH6.7) ddH2O水
10%SDS
10%过硫酸铵AP
3、样品处理与加样 ⑴样品制备
取蔗糖酶样品（样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）各50μl，分别放入1.5ml离心管中， 12000r/min离心10分钟，上清即为电泳样品。 ⑵样品处理
将离心后的上清各取20ul，加入等体积“2×蛋白质样品溶解液”，100℃保温 3分钟，取出冷却后，12000r/min离心2min,取上清直接加样。 ⑶加样
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质原理
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质原理说到SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）测定蛋白质，哎呀，感觉自己像是要进入神秘的实验室世界了。
这种技术听起来复杂，对吧？但它并没有想象中的那么难懂。
就像是做一道复杂的菜，虽然步骤多了点，但只要掌握了窍门，咱们也能轻松搞定。
SDSPAGE，其实说白了就是一种通过电泳来分离蛋白质的方法。
别被它长长的名字吓到了，这只是科学家的“高大上”用词。
你可以把它想象成是在一个装满胶水的小池塘里，蛋白质们在这里玩“捉迷藏”，但根据它们的大小和电荷来决定谁先出来，谁后出来。
是不是有点像看一场赛跑？不过这里的选手是蛋白质，而“赛道”就是那片凝胶。
首先呢，我们得用一种叫SDS的东西，把蛋白质包裹起来。
SDS，听起来有点像科幻电影里的毒药对吧？其实它是一个表面活性剂，它能把蛋白质的三维结构打散，让蛋白质变得很“线性”，就像把一个打了结的绳子拉直一样。
这个过程非常重要，因为一旦蛋白质被SDS“调教”过，它们就只剩下了“体积”这一属性，不再有原本的复杂结构。
所以呢，SDS给蛋白质涂上一层“防护膜”，让它们在电泳中走得更公平、更“清白”。
简单说，SDS就是给所有蛋白质套上了一个统一的外衣，不让它们各自的花纹和颜色影响到比赛结果。
我们要把蛋白质样本放到凝胶里。
你可以把凝胶想象成一个超级细密的网状结构，这个网不但很坚固，而且孔隙大小不一，就像一张细密的筛子。
蛋白质们就要在这个网里跑，不同的蛋白质因为大小不同，跑得快慢也不同。
小的蛋白质像小车一样，轻轻松松就能通过这些网眼，而大的蛋白质就像装了大行李的车，走得就慢一点。
这样一来，蛋白质们就被按大小分开了。
不过，光分开还不够！我们还得用电场来推动蛋白质往前跑。
怎么说呢，电泳里的“电”就像是比赛中的“推进器”，它会给蛋白质一个方向性，让它们朝着电场的正极跑过去。
这时候呢，电泳就像是给所有选手加速，大家一起出发，但由于大小不一，跑得快慢不同，最终的排名自然也就不一样了。
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析方法。
以下是其操作步骤：1. 准备试剂聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂包括：丙烯酰胺、N，N'-甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、甘氨酸、尿素、溴酚蓝等。
其中，丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺是聚合反应的主要原料，过硫酸铵和TEMED是聚合反应的催化剂和加速剂，甘氨酸和尿素可以增加凝胶的强度和稳定性，溴酚蓝则可以作为指示剂。
2. 制备凝胶首先将丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺按照一定比例混合，加入适量的去离子水溶解，然后加入过硫酸铵和TEMED，混合均匀后倒入聚四氟乙烯模具中。
接着将模具放入电泳槽中，加入电极缓冲液，连接电源开始电泳。
3. 加样在电泳过程中，当凝胶完全聚合后，将电极缓冲液排出，取下凝胶。
用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入电泳槽中。
然后加入适量的样品溶液，用微量进样器将样品加入到凝胶孔中。
4. 开始电泳加完样后，重新连接电源，设置电泳参数（如电压、电流和时间等），开始电泳。
在电泳过程中要随时注意电泳进度，观察是否有异常情况发生（如条带跑偏、条带模糊等）。
5. 终止电泳当电泳完成后，断开电源，将凝胶取出。
用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入缓冲液中浸泡一段时间，以终止电泳反应。
6. 染色将终止电泳后的凝胶进行染色。
常用的染色方法有银染法和考马斯亮蓝染色法等。
银染法是用硝酸银溶液将蛋白质固定在凝胶上，然后进行显色；考马斯亮蓝染色法是用考马斯亮蓝染料将蛋白质染色后用乙醇进行脱色。
7. 脱色经过染色后的凝胶可以进行脱色处理。
常用的脱色方法有乙醇脱色法和醋酸铵脱色法等。
乙醇脱色法是用无水乙醇多次冲洗凝胶以去除未结合的染料；醋酸铵脱色法是用醋酸铵溶液浸泡凝胶以去除未结合的染料。
8. 观察和拍照最后观察并拍照记录电泳结果。
银染法可以通过观察颜色深浅判断蛋白质分子量大小；考马斯亮蓝染色法则可以通过观察条带的亮度判断蛋白质含量高低。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法胡晓倩;陈来同;赵健【摘要】Purpose To establish a simple, rapid, highly sensitive, non-toxic protein electrophoresis staining protocol. Methods By utilizing Coomassie Brilliant Blue G-250 ( CBB G-250) to stain the prorein bands by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), the different dyeing conditions were explored and compared to the staining of Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB R-250). Results CBB G250 staining protocol presents non-toxic, light background and comparable sensitivity after optimization to CBB R-250 staining,which is reaching 0.1-0.5 μg. Conclusion CBB G-250 staining protocol is simple and economic. Its sensitivity could meet the general requirements, and is applicable to the rapid analysis of protein electrophoresis.%目的建立一种操作简便、快速、灵敏度高、无毒的蛋白质电泳染色方法.方法利用考马斯亮蓝G-250(CBB G-250)在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后对蛋白质条带进行染色,对不同染色条件进行探讨,并与考马斯亮蓝R-250(CBB R-250)染色法进行比较.结果 CBB G-250染色法试剂无毒,背景浅,经改良其灵教度与CBB R-250染色法相当,达到0.1～0.5μg.结论 CBB G-250染色方法简单经济,灵敏度能够满足一般要求,适用于蛋白质电泳结果的快速分析.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2011(032)002【总页数】3页(P128-130)【关键词】SDS-聚丙烯酰胺胶电泳;染色方法;考马斯亮蓝G-250;灵敏度【作者】胡晓倩;陈来同;赵健【作者单位】北京大学,生命科学学院,北京,100871;北京大学,生命科学学院,北京,100871;北京大学,生命科学学院,北京,100871【正文语种】中文【中图分类】Q503蛋白质条带染色是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中的重要步骤，染色方法有多种［1］，考马斯亮蓝R-250(CBB R-250)(三苯基甲烷)染色法是生化实验室中蛋白质电泳检测和定量分析常用的方法。
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳 名词解释
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，该技术通过在凝胶电泳过程中使用一种带有离子表面活性剂SDS（十二烷基硫酸钠）的聚丙烯酰胺凝胶，可以将蛋白质分子进行线性化处理，从而使其在电场中按照分子质量大小进行迁移，最终实现对蛋白质的分离和分析。
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术是生物化学和分子生物学领域中最重要的实验技术之一。
它被广泛应用于蛋白质的分离、鉴定和定量分析，并且对于蛋白质的结构和功能研究具有不可替代的作用。
在科学研究、医学诊断和生物工程领域中都有着重要的应用价值。
本篇文章将从以下几个方面来介绍sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，包括其原理、应用、实验操作步骤以及相关的意义和发展趋势。
一、原理sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的原理主要包括以下几个方面：1. SDS线性化蛋白质：SDS是一种带有强烈负电荷的表面活性剂，在凝胶电泳过程中，SDS可以与蛋白质分子中的亲水残基相结合，并使蛋白质分子呈线性状态，从而使蛋白质的电泳迁移速率与其分子质量成正比。
2. 分子质量分析：在电泳过程中，由于SDS的作用，所有蛋白质分子都被线性化处理，并且蛋白质分子的迁移速率只与其分子质量大小有关，因此可以根据蛋白质在凝胶中的迁移距离来推断其分子质量。
3. 分离效果：由于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对蛋白质进行了线性化处理，因此不同分子质量大小的蛋白质分子可以在凝胶中得到有效分离，形成清晰的电泳带。
二、应用sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术主要应用于以下几个方面：1. 蛋白质分离与鉴定：通过sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，可以将混合蛋白质样品有效地分离并形成清晰的电泳带，便于后续的蛋白质鉴定和分析。
2. 蛋白质定量：在实验室中，可以利用sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对蛋白质样品进行定量分析，根据样品中的蛋白质含量来确定实验结果。
3. 蛋白质结构和功能研究：通过sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术可以实现对不同蛋白质的分子量测定，为进一步的结构和功能研究提供重要数据支持。
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一种利于蛋白质回收的快速SDS-聚丙烯
酰胺凝胶电泳染色-脱色方法
康 彬 童 哲
1)
(中国科学院植物研究所,北京100093)
摘要 在实践基础上摸索出一种快速并有利于蛋白质回收的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色-脱色方法:经常用的
考马斯亮蓝R-250染色液短暂染色后直接用250mmol/LKCl溶液脱色.这种方法染色-脱色的清晰程度与常规的
染色-脱色方法接近,而且能使蛋白质回收率提高三倍多.
关键词 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,染色-脱色,蛋白质,回收
学科分类号 Q94217;Q9461912
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和由
等电聚焦(IEF)、SDS-PAGE组成的双向电泳不仅是分离、分析蛋白质的常用方法,而且也逐渐成为制备蛋白质的有效手段:从凝胶中获得的蛋白质可以用于蛋白质的测序或制备抗体等[1].但是现在常用的染色-脱色方法不仅耗时长,而且由于冰醋酸的作用而不利于蛋白质从凝胶中洗脱回收.能否发展一种快速并能有效提高蛋白质回收率的实验室常用方法成为从事蛋白质分离、纯化的研究者们感兴趣的问题.本文通过对比实验对这个问题进行了探讨.1 试剂与方法111 化学试剂 电泳药品Tris、甘氨酸、Acr、Bis为Serva产品;牛血清白蛋白(BSA)(分析纯)为上海生物化学研究所产品.112 方法11211 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:按Laemmli[2]的方法进行,用SDS-样品溶解液溶解BSA,分离胶浓度1215%,浓缩胶浓度为4%.11212 染色-脱色方法:比较下述3种染色-脱色方法:a1染色液(011%考马斯亮蓝R-250、50%乙醇、10%冰醋酸)振荡染色2h后,用脱色液(5%甲醇、7%冰醋酸)脱色直到背景清晰为止;b1按Hon[3]的方法,将电泳后的凝胶先用蒸馏水淋洗,然后浸入250mmol/LKCl溶液中10min,最后用蒸馏水淋洗;c1凝胶先用a中的染色液振荡染色20min,然后用蒸馏水反复冲洗后,浸入250mmol/LKCl溶液中,直到背景清晰为止.11213 蛋白质电洗脱回收:用锋利刀片切取含目的蛋白的凝胶后,将它们放入透析袋中,加入适量洗脱液(25mmol/LTris,192mmol/L甘氨酸,015%SDS,pH813)后,在水平电泳槽中恒流
80mA进行电洗脱,直到凝胶无色为止,约需
215h.在洗脱液中按1B20(体积比)加入冷丙
酮,在-20e静置30min后于4e、12000g离心
20min,沉淀在室温下放置挥发掉丙酮后加入适量
的SDS-样品溶解液,用分离胶为1215%的SDS-聚
丙烯酰胺凝胶电泳检查洗脱效果.
2 结果与讨论
方法a是现在常用的SDS-PAGE染色-脱色方
法,一般耗时3~4h左右,凝胶清晰、透明,如
图1中1所示,所用蛋白质为牛血清白蛋白.Hon
等[3]曾使用250mmol/LKCl溶液直接染色,本文
引用此法并用图1中1中相同量的BSA做实验,
发现10min250mmol/LKCl溶液能使蛋白质染成
乳白色,但与背景的反差较小,蛋白质难以辨认,
而且显色后,凝胶放置时间一旦超过10min后,
蛋白质褪色,更难以辨认(图1中3).因此虽然
图1 三种染色-脱色方法的比较
1)
通讯联系人.
Tel:(010)62591431-6210,E-mail:zhetong@hotmail.com
收稿日期:1999-03-18,修回日期:1999-09-29
#210#
生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2000;27(2)
这种方法快速,但因难以辨别蛋白质的轮廓,特别
是当分离蛋白质混合物时,就更难以准确切取目的
蛋白,显然这对获得高纯度、能用于蛋白质测序的
蛋白质制品是不适宜的.
在这两种方法基础上能否找到一种既节省时
间,显示蛋白清晰度高、稳定性又强的染色-脱色
方法呢?经过对比和重复实验发现:若凝胶先用常
规考马斯亮蓝R-250进行短暂染色(20min),然
后经蒸馏水反复冲洗后,用250mmol/LKCl溶液
脱色,整个过程仅约1h左右,而显示蛋白质的清
晰程度与常规方法相当,只是染色更深一些.图1
中2就是用这种方法对等量的BSA染色-脱色后的
效果.对双向电泳用这种方法染色-脱色也获得较
好的效果(照片略).
这种染色-脱色方法不仅快速、清晰度较好,
而且还利于蛋白质的回收.我们对方法a和方法c
的染色-脱色方法对蛋白质回收的影响进行了比较.
相同量的BSA经方法a或方法c染色-脱色后,主
带被切取,在同一洗脱条件下,对这两份蛋白质同
时进行电洗脱回收.回收后的蛋白质经电泳分离后
用方法a进行染色-脱色,所获凝胶如图2所示,
其中1、2、3分别为原蛋白和经方法c、a染色-
脱色获得的蛋白质.我们对它们进行了定量分析,
首先对凝胶进行了扫描,获得了它们的吸收峰(图
3),然后利用Ge-lproAnalyzerV1310软件对三个
吸收峰进行积分面积(IOD)计算,所获结果如图
4.从图4可以看到,方法c比方法a多回收蛋白
质三倍多.
从以上实验结果可以看到,这种染色-脱色方
法快速、有利于蛋白质从凝胶中回收,而且不仅适
用于单SDS-PAGE,也适用于双向电泳,特别适用
于快速分离、纯化不知道其他生化特性而只能用电泳方法辨别的蛋白质.我们曾用这种方法大量获得了仅存在于光敏核不育水稻中的特异蛋白P60,并对它进行了序列分析(另文发表).图2 二种染色-脱色方法对蛋白质回收的影响图3 1、2、3主带的吸收曲线图4 图3中三个蛋白质主峰的积分面积参 考 文 献1 AusubelF,BrentR,KingstonRE,等.颜子颖,王海林译.精编分子生物学试验指南.北京:科学出版社,1998.329~409AusubelF,BrentR,KingstonRE,etal.ShortProtocolsinMolecularBiology.3rd.NewYork:JohnWiley&Sons,Inc.1995.329~4092 LaemmliUK.CleavageofstructuralproteinsduringtheassembyoftheheadofbaceriophageT4.Nature,1970,277(7):680~6853 HonWC,GriffithM,ChongP,etal.Extractionandisolationofantifreezeproteinsfromwinterrye(XecaleereateL.)leaves.Plantphysiol,1994,104(3):971~980AFastStaining-destainingMethodforSDS-PAGE
WhichFavourstheRecoveryofProtein.KANG
Bin,TONGZhe(InstitueofBotany,TheChinese
AcademyofSciences,Beijing100093,China).
Abstract Afaststaining-destainingmethodforSDS-
PAGEwhichfavourstherecoveryofproteinswas
developed:briefstainingbyCoomassieBrillantBlue
R-250followedbydestainingwith250mmol/LKCl.
TheSDS-PAGEstained-destainedbythismethodhas
almostthesameclearancecomparedwiththeone
stained-destainedbytheusualmethod,andthe
recoveryofproteincanbeenhancedmorethanthree
timesbythismethod.
Keywords SDS-PAGE,staining-destaining,
protein,recovery
#211#
2000;27(2) 生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys.