蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳配方
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量解析
【实验步骤及操作方法】
1.安装垂直板电泳槽 将密封胶条放在平直玻璃板上，将凹形
玻璃板与 平直玻璃板重叠。 用手将两块玻璃板夹住，放入电泳槽内。 用蒸馏水检漏
2.电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液，pH=8.3）：取 Tris6.0g，甘氨酸28.8g，SDS1.0g，用去离子水 溶解后定容至1L。
3.样品溶解液（用于溶解标准蛋白质及样品蛋白 质）：取SDS0.1g，巯基乙醇0.1mL，甘油 1.0mL，溴酚蓝28.8g，0.2mol/L磷酸缓冲液 0.5mL，加重蒸馏水至10mL。
【试剂配制】
4. 染 色 液 ： 0.25g 考 马 斯 亮 蓝 R-250 ， 加 入 454mL50%甲醇溶液和46mL冰乙酸。
5.脱色液：75mL冰乙酸，875mL水与50mL甲醇 6.10% 过 硫 酸 钠 、 10%SDS 、 1% 四 甲 基 乙 二 胺
（TEMED）
【实验材料及预处理】
蛋白质相对分子质量的测定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
【实验目的】
• 理解电泳法测定蛋白质分子量的原理。 • 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的基本操
作 • 学会绘制标准曲线。
【实验原理】
聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）和N，N-甲叉双 丙烯酰胺（Bis）聚合而成，是一种具有交叉网状结构的 凝胶，可以产生分子筛效应，其孔径大小可以通过配置 药品的浓度来控制，常用作电泳的载体。
因此，我们可以测定标准蛋白质的迁移率，通过标 准蛋白质相对迁移率的对数对相对分子量作图，得到标 准曲线，根据标准曲线计算出未知蛋白质的相对分子质 量。
生物化学实验-SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量
实验原理
电泳：是带电颗粒在电场作用下，作定向运动即 向着与其电荷相反的电极移动的现象。 电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据 各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷 多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。 区带电泳是样品物质在一惰性支持物上上进行电 泳的过程。因电泳后，样品不同组分形成带状区 间，故称区带电泳。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的SDS时，蛋白质分子 的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其他因素对电泳 迁移率的影响几乎可以忽略不计。当蛋白质的分子量在 15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关 系，符合下列方程式：
lg MW=-b·mR+K MW为蛋白质分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，k为截 距。在条件一定时，b和K均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图， 可获得一条标准曲线。未知蛋白质的相同条件下进行电泳，根 据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
实验步骤
凝胶的制备 蛋白质样品的处理 加样：用微量注射器依次在各个样品槽内加样，各加
10～15μl（含蛋白质10～15μg），稀溶液可加20～30μl
电泳凝胶配方：
30.8%Acr-Bis
1.5mol/l Tris(pH8.9)
0.5mol/l Tris(pH6.7) ddH2O水
10%SDS
10%过硫酸铵AP
3、样品处理与加样 ⑴样品制备
取蔗糖酶样品（样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）各50μl，分别放入1.5ml离心管中， 12000r/min离心10分钟，上清即为电泳样品。 ⑵样品处理
将离心后的上清各取20ul，加入等体积“2×蛋白质样品溶解液”，100℃保温 3分钟，取出冷却后，12000r/min离心2min,取上清直接加样。 ⑶加样
实验十聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质
实验⼗聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋⽩质实验⼗聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋⽩质【实验⽬的】1. 了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；2. 掌握⽤此法分离蛋⽩质组分的操作⽅法。
【实验原理】在⽣物化学、分⼦⽣物学和基因（遗传）⼯程实验中，常常要进⾏蛋⽩质和核酸的分离⼯作。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为⽀持介质进⾏蛋⽩质或核酸分离的⼀种电泳⽅法。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称ACR）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS）在催化剂的作⽤下聚合交联⽽成的三维⽹状结构的凝胶。
通过改变单体浓度与交联剂的⽐例，可以得到不同孔径的凝胶，⽤于分离分⼦量⼤⼩不同的物质。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采⽤过硫酸铵，加速剂为N,N,N,N－四甲基⼄⼆胺（简称TEMED）。
通常控制这⼆种溶液的⽤量，使聚合在1⼩时内完成。
（2）光聚合：通常⽤核黄素为催化剂，通过控制光照时间、强度控制聚合时间，也可加⼊TEMED 加速反应。
聚丙烯酰胺凝电泳常分为⼆⼤类：第⼀类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第⼆类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。
⼀般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：①电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）；②凝胶的分⼦筛效应（凝胶的⽹状结构及电泳物的⼤⼩形状不同所致）。
③浓缩效应（浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同，即不连续性所致）。
因此，样品分离效果好，分辨率⾼。
SDS即⼗⼆烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS）是阴离⼦表⾯活性剂，它能以⼀定⽐例和蛋⽩质结合，形成⼀种SDS-蛋⽩质复合物。
这时，蛋⽩质即带有⼤量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从⽽使天然蛋⽩质分⼦间的电荷差别降低仍⾄消除。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
实验七SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量实验数据：标准蛋白质条带第一条第二条第三条第四条第五条溴酚蓝前沿距离/cm 4.70距离/cm 0.50 0.95 1.60 2.10 3.95 相对迁移率mr 0.11 0.20 0.34 0.45 0.84 分子量Mr 97400 66200 43000 31000 14400LgMr 4.99 4.82 4.63 4.49 4.16样品 1 2 3溴酚蓝前沿/cm 4.90 4.80 4.60样品迁移距离/cm 4.20 1.20 1.70相对迁移率mr 0.86 0.25 0.37标准曲线：y=5.05-1.10x结果：样品 1 2 3Mr 12706 59566 43954mr 4.104 4.775 4.643一. 实验目的和要求1 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
2 掌握垂直板电泳的操作方法。
3 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。
二 .实验原理带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。
支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。
区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
实验8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量
实验8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量Mr原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中, 蛋白质的迁移率取决于它所带净电荷及分子的大小和形状。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate,简称SDS）和还原剂（如巯基乙醇）处理蛋白质样品, 则蛋白质分子中的二硫键被还原, 1g蛋白质可定量结合1.4g SDS。
由于SDS呈解离状态, 使蛋白质亚基带上大量的负电荷, 其数值大大超过蛋白质分子原有的电荷量, 因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
各种蛋白质-SDS复合物表现出相等的电荷密度, 在聚丙烯酰胺凝胶上电泳时, 它们纯粹按照分子的大小由凝胶的分子筛效应来进行分离, 有效迁移率与相对分子量的对数成很好的线性关系。
用这种方法测定蛋白质的Mr, 简便、快速, 只需要廉价的设备和μg量的蛋白质样品。
所得的结果, 在Mr为15000~200000的范围内, 与用其他方法测得的Mr相比, 误差一般在±10%以内。
因此SDS测定Mr的方法, 已得到非常广泛的应用和迅速的发展。
现在经SDS-聚丙烯酰胺凝胶研究过的蛋白质已经有很多种了。
实验证明, 在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后, 巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开, 并结合到蛋白质分子上形成蛋白质-SDS复合物。
在一定的条件下, SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质。
由于十二烷基硫酸根带负电, 使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷, 它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量, 因而掩盖了不同种类的蛋白质间原有的电荷差别。
1.在用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质的Mr时, 应注意以下几个问题:如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4gSDS/1g蛋白质的比率并具有相同的构象, 就不能得到准确的结果。
影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个: ⑴二硫键是否完全被还原: 只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下, SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去, 并使之具有相同的构象。
实验四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
7）在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按 1:1体积比加入上样缓冲液，在100℃加热5分钟以使蛋白质 变性。 8）浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶 固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。
※要使锯齿孔内的气泡全部排出，否则会影响加样效果。
1）把胶放入塑料盒中，加入银染固定液约3～5倍的体积， 没过凝胶，在摇床上慢速振荡30min。
2）蒸馏水洗胶3次，每次2min。
3）转移凝胶到银染溶液中，注意：37%甲醛0.5mL在使 用前才能加入。摇床上慢速振荡染色30 min。 4）转移凝胶到10℃以下的蒸馏水中振荡洗涤10sec 。
掌握垂直板电泳的操作方法。
运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。
二、实验原理
带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种 现象称为电泳。
区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层 样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介 质中迁移。 支持介质的作用：防止机械干扰和由于温度变化以及 大分子溶液的高密度而产生的对流。
滤纸 微量注射器 大培养皿
四、实验要求
根据老师提供的蛋白质样品，先查阅资料，按
其分子量选择合适的凝胶浓度进行SDS-PAGE 凝胶电泳，选择考马斯亮蓝或银染法进行染色，
测定样品的分子量和纯度情况。
样品1：蔗糖酶 样品2：肌酸激酶（从中华鳖肌肉中提取） 样品3：牛血清白蛋白 样品4：酪氨酸酶（从双胞蘑菇中提取）
聚丙烯酰胺凝胶的聚合反应
单体：丙烯酰胺（Acr） 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis） 催化剂：过硫酸胺 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
在电场的作用下，小分子蛋白质可以 容易地通过凝胶孔径，而大分子蛋白 质则受到较大的阻力，无法通过，从 而实现蛋白质的分离。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用
蛋白质组学研究
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白质 组学研究中常用的分离方法，可用于 蛋白质的表达、纯化、鉴定和功能研 究。
实时监测与数据分析
引入实时监测技术和数据分析软件，可以实时监测电泳进程并获 取更准确的数据，为后续分析提供有力支持。
应用拓展
临床诊断
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳在临床诊断中发挥着越来越重要的作用， 可用于检测和鉴别疾病相关的蛋白质标志物。
生物医药研究
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳在生物医药研究中广泛应用于蛋白质组 学、药物筛选和生物标志物发现等领域。
sds－聚丙烯酰胺凝胶电泳
目 录
• SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳简介 • SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳实验操作 • SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果分析 • SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的优缺点 • SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的发展趋势
01 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电 泳简介
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的定义
准备凝胶制备所需材料
根据实验需求，准备适量的丙烯酰胺、 N,N'-甲叉双丙烯酰胺、SDS、 TEMED等材料。
制备缓冲液
根据电泳条件选择适当的缓冲液，如 TAE或TBE，并配置适量的浓度。
准备样品
将待测样品进行适当处理，如超声破 碎或离心取样。
操作步骤
制备凝胶
点样
按照一定比例将丙烯酰胺、N,N'-甲叉双丙 烯酰胺、SDS、TEMED混合，加入适量的 水搅拌均匀后倒入电泳槽中。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
指导教师：罗勤
准备工作 1. 小心清洗电泳槽玻板并干燥; 2. 正确安装固定玻板于电泳槽中; 3. 用融化的琼脂粉封住玻板周围的空隙; 4. 准确吸取凝胶溶液,灌胶.
凝胶溶液的配制（ 凝胶溶液的配制（30ml） ）
凝胶贮液I: 凝胶贮液 凝胶缓冲液II: 凝胶缓冲液 蒸馏水: 蒸馏水 10 ml 15 ml 3.34 ml
相对迁移率
三、实验步骤
凝胶溶液的配制（30ml） 灌胶 上样（点样）
电泳 取胶 显色（染色） 测定m值
四、结果分析
1、 测量电泳前沿距离 2、 测量每条蛋白带迁移距离 3、求出标准蛋白质谱带的m值 4、 m=蛋白质谱带迁移距离/电泳前沿距离 5、根据上述方法求出未知蛋白质谱带的m值 6、以m作横坐标，蛋白质的分子量的对数作纵坐标， 做标准曲线 7、根据未知蛋白的m值在标准曲线上求得其分子量
灌胶前 加 10% TEMED
10% APS
1.5 ml 0.16 ml
混匀后迅速灌胶并插入梳子
SDS-PAGE低分子量标准蛋白质考马斯亮蓝R-250染色结果
兔磷酸化酶B 牛血清白蛋白 兔肌动蛋白 牛碳酸酐酶 胰蛋白酶抑制剂 鸡蛋清溶菌酶
97,400道尔顿 66,200道尔顿 43,000道尔顿 31,000道尔顿 20,100道尔顿 14,400道尔顿
五、实验注意事项
1． 凝胶配制时体积要取标准 2． 玻板要洗净烘干，灌胶时不能漏胶 3． 胶面要整齐，胶内不能有气泡 4． 电泳时电流不能太高，以免发热 ，不 能太小，以免扩散 5． 防止电泳缓冲液从上槽 取 胶 和 显色/染料迁移距 离）与分子量的对数（lg）成线性关系 MW=K（10-bm ） lgmw=lgk-bm
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分离胶；一块胶配5mL
每一块胶需要约4mL, 留出约2-3cm的距离，用水封口，防止空气接触。
室温放置30min后，可以看到水和胶的界面重新出现。
弃去上层水，倒入凝缩胶。
凝缩胶：一块胶配2mL
10%(W/V)过硫酸铵
1 称取1g APS
2加入10mL去离子水
3储存于4℃可使用两周时间，过期失去催化作用。
5* Tris-Glycine Buffer (SDS-PAGE电泳缓冲液)
1.
Tris 15.1g
Gly 94g
SDS 5g
2加入800mL去离子水，搅拌溶解
3定容至1L，室温保存。
5*SDS-PAGE Loading Buffer
1.10ml 离心管
1M Tris-HCl (pH6.8) 1.25mL
SDS 0.5g
BPB 25mg
甘油 2.5ml
2加去离子水溶液后定容至5mL
3小份（500uL/份）分装后，于室温保存
4使用前将25uL的2-ME加到每小份中
5加入2-ME的Loading Buffer 可在室温下保存一个月左右。