耐药细胞株构建档

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转染肿瘤坏死因子及反向多药耐药基因对乳腺癌细胞耐药基因表达的影响

论著转染肿瘤坏死因子及反向多药耐药基因对乳腺癌细胞耐药基因表达的影响陈亦欣,文飞球,申维玺,叶建增基金项目深圳市科技局课题(5563)作者单位5广东省深圳市,暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院肿瘤研究所【摘要】　目的　构建反向pEG FP -MDR1重组表达载体和pD s Red2-T NF -α重组表达载体,在乳腺癌耐药细胞株MCF -7/ADR 中进行表达,并观察它们对多药耐药(MDR )基因的影响。

方法　应用RT -PCR 和D NA 重组技术构建反向绿色荧光蛋白pEGFP -MDR1融合蛋白表达载体和红色荧光蛋白p D s Red2-T NF -α融合蛋白表达载体,分别和同时导入乳腺癌耐药细胞株MCF -7/ADR 中进行表达,应用荧光显微镜直接观察融合蛋白的表达情况,RT -PCR 和免疫细胞化学染色法分别检测转染前后MDR1-mRNA 和P 糖蛋白表达情况。

结果　转染了反向pEGFP -MDR1载体的细胞可见到绿色荧光,转染了pDs R ed2-T NF -α载体的细胞可见到红色荧光,而同时转染了反向pEGFP -MDR1载体和p D s Red2-T NF -α载体的细胞可见到红色及绿色荧光。

转染后的细胞在mRNA 水平及蛋白水平明显降低了耐药细胞MCF -7/ADR 的MDR1基因的表达。

结论　反向pEGFP -MDR1融合蛋白和pD s Red2-T NF -α融合蛋白能在乳腺癌耐药细胞MCF -7/ADR 中分别及同时获得表达,并能抑制MDR1基因在MCF -7/ADR 细胞中的表达,为进一步研究基因治疗联同免疫治疗逆转乳腺癌耐药建立了很好的基础。

【关键词】　多药耐药基因;肿瘤坏死因子α;乳腺肿瘤【中图分类号】R 73719　【文献标识码】A 【文章编号】1007-9572(2008)12-2128-04Effects of TNF -αand Rever s e M DR1Gene Tran sfect i on o n the Expr essio n of MD R1Gene i n Br ea st C ancer C ellL i ne CH EN Yi -xin,W EN Fei -qiu,SH EN Wei -xi,et a l .Ca ncer Institute,the Second C linica l Hospita l of J i ′nan U niversity ,Shenzhen 518020,China 【Ab stra c t 】　O bjective T o ex press the recombinant vec t ors of reve rs e enhanced green flu orescent protein (EGFP )with reverse multidrug re sist ance 1(pEGFP -MDR1)and red fl uorescent protein (D s Red2)wit h T NF -αgene (p D s Red2-T NF -α)in multidrug re sist ant breast cancer cell line MCF -7/ADR ,and t o obs e rve the ir effects on the expressi on of MDR1g ene .M e thod s T o construct the recombinant vec t or of pEGFP -MDR1gene,as we ll as reco m binant vec t or of pDs R ed2-T NF -αg ene by R T -PCR and DNA reco mbinant techniques .The reco m binant vect ors were i ntroduced int o multidrug resistant brea st cance r cell line MCF -7/ADR and the ex pressi on of the fusi on p rot e inswas direc tly obse rved by fluorescentm ic r oscope.The ex 2pre ssions ofMDR1-mRNA and P -glycoprotein (P -g p )before and after the transfection were obs e rved by R T -PCR and i m 2mun ohist oche m istry .Results I n cells trans fected with reve rs e p EGFP -MDR1v ec t or green fluore s cence could be s een;in cells transfec ted with pDsRed2-T NF -αvec t or red fluore scence could be s een;and ce lls transfec t ed with bot h reve rs e p EGFP -MDR1and pDsRed2-T NF -αvect ors b oth green and red fl uorescence could be seen .Ce lls after transfec ti on had much l owe r MDR1ex p re ssi on a t mRN A and P -gp l eve l compa red w ith the n ontransfected ce ll .C onclusio n T he reverse pEGFP -MDR1and pD s Red2-T NF -αcan res pectively and si m ultaneously ex p ress in multidrug resistant breast cance r cell lineMCF -7/ADR ,and can inhibit the expre ssi on of MDR1gene inMCF -7/ADR cells .T his provides a good ba sis for furthe r resea rch on reversal ofmultidrug resistance i n brea st cancer by gene t herapy together with i mmun othe rapy . 【Key wor d 】　MDR1gene;Tu mor necrosis fact or -alpha;B reast neop las m s 乳腺癌是威胁我国女性健康的最常见的一种恶性肿瘤,近年来发病率呈直线上升趋势。

依西美坦与低剂量甲氨蝶呤对依西美坦耐药人乳腺癌细胞的协同效应及逆转耐药机制

依西美坦与低剂量甲氨蝶呤对依西美坦耐药人乳腺癌细胞的协同效应及逆转耐药机制居伶俐;袁媛;潘跃银【摘要】Objective To investigate the combined effect of exemestane and low-dose methotrexate on exemestane-resistant MCF-7 human breast cancer cells( MCF-7/EXE). Methods Antiproliferative effects of exemestane and low-dose of methotrexate, alone and in combination on growth of MCF-7/EXE cells were assessed by using the MTT assay. Synergistic interaction between the two drugs was evaluated in vitro by using the combination index ( CI) method. The cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry in a half inhibitory concentration of exemestane and low-dose of methotrexate . The changes of apoptosis on MCF-7/EXE cells exposed to two drugs alone or in com-bination were observed by fluorescence microscope. The expression of Bcl-2,AKT,P-AKT and cyclooxygenase-2 was investigated by Western blot. Results MTT assays indicated that the combination treatment apparently decreased the viability of MCF-7/EXE cells compared to single drug treatment (CI<0. 9). In addition, the combination of exemestane and low-dose methotrexate exhibited a synergistic inhibition of cell proliferation, arrested the cell cycle in the S phase significantly and produced a stronger inhibitory effects onP-AKT, Bcl-2 and cyclooxygenase-2 ex-pression than control or individual drug treatment. Conclusion The combination of the two inhibitors significantly increases the response as compared to single agent treatment,suggesting that combination treatment which can re-verse the resistance of exemestane could be a more effective approach to breast cancer.%目的研究依西美坦( EXE )与低剂量甲氨蝶呤( MTX)对依西美坦耐药人乳腺癌 MCF-7细胞( MCF-7/EXE)的增殖抑制作用及意义。

RRM2基因过表达卵巢癌细胞株SKOV3的构建及对顺铂敏感性观察

RRM2基因过表达卵巢癌细胞株SKOV3的构建及对顺铂敏感性观察王中山;张梦;张冬梅;杨新慧【摘要】目的构建核糖核苷酸还原酶亚基M2(RRM2)基因过表达的卵巢癌细胞株SKOV3,并观察RRM2基因过表达的SKOV3细胞对顺铂的敏感性.方法提取SKOV3细胞总RNA,反转录得到cDNA,以其为模版进行PCR反应,获得RRM2基因.通过酶切(XhoⅠ、BamHⅠ)连接的方法,将RRM2基因插入慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1中,得到重组质粒pLVX-IRES-RRM2.利用脂质体将重组质粒转染293FT细胞,包埋病毒.将SKOV3细胞分为实验组和对照组,实验组转染pLVX-IRES-RRM2慢病毒,96 h后测算慢病毒感染效率.对照组不进行转染.采用Western blotting法检测两组细胞中的RRM2蛋白;流式细胞仪检测两组凋亡细胞与死亡细胞,反映细胞对顺铂的敏感性.结果重组质粒pLVX-IRES-RRM2经限制性内切酶XhoⅠ和BamHⅠ双酶切验证,各片段大小符合预期,测序结果显示RRM2基因序列正确.实验组、对照组细胞中RRM2 mRNA相对表达量分别为0.280±0.055、0.102±0.022,RRM2蛋白相对表达量分别为0.582±0.049、0.228±0.032,实验组高于对照组,说明RRM2基因过表达的SKOV3细胞构建成功.实验组、对照组凋亡细胞比例分别为0.39%±0.08%、9.60%±1.20%,死亡细胞比例分别为26.65%±2.20%、44.96%±2.80%,实验组凋亡细胞比例和死亡细胞比例均低于对照组(P均<0.01).结论成功构建了RRM2基因过表达的SKOV3细胞,RRM2基因过表达的SKOV3细胞对顺铂的敏感性降低.【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2017(057)039【总页数】4页(P30-33)【关键词】卵巢癌;卵巢癌细胞株;核糖核苷酸还原酶家族成员2;顺铂;药物耐受性;药物敏感性【作者】王中山;张梦;张冬梅;杨新慧【作者单位】徐州医科大学,江苏徐州221004;徐州市中心医院;徐州市中心医院;徐州市中心医院【正文语种】中文【中图分类】R737.31卵巢癌是常见的妇科肿瘤，病死率位居妇科恶性肿瘤之首[1]，多数(85%)为上皮性卵巢癌(EOC)[2]。

稳定表达 Notch1胞内结构域肺腺癌细胞株的构建及鉴定

稳定表达 Notch1胞内结构域肺腺癌细胞株的构建及鉴定邹斌;吴霞;周学亮;詹宇亮;赖松青;刘季春【摘要】Objective To construct a lung adenocarcinoma cell line A 549 with stable expression of Notch1 intracellu-lar domain (N1ICD).Methods TheN1ICD fragment was amplified by PCR, which was used to construct pHBLV-N1ICD-ZsGreen-Puro plasmid (LV-N1ICD).The recombinant plasmid was identified by PCR and gene sequencing .LV-N1ICD was packaged by transfection of 293T cells with recombinant plasmid and auxiliary plasmids which were purified without endotoxinextraction .Lentivirus empty plasmid ( LV-ZsGreen-Puro ) was also constructed .Drug screening method was used to determine the titer of LV-N1ICD and LV-ZsGreen-Puro.A549 cells were divided into A549-N1ICD group and A549-ZsGreen-Puro group.Puromycin was used to screen stable transfection cell line after infection of A 549 cell with LV-N1ICD or LV-ZsGreen-Puro.Transfection efficiency was observed by fluorescence microscope and cells with green fluores -cent were preliminarily identified as stable transfection cell lines .Taking A549 cells as the control group , and N1ICD mR-NA and protein expression was further detected by qPCR and Western blotting , respectively .Results PCR and gene se-quencing showed that pHBLV-N1ICD-ZsGreen-Puro plasmid was successfully constructed .The titer of LV-N1ICD was 1 × 108 TU/mL and the LV-ZsGreen-Puro was 1 ×108 TU/mL.Cells shape had no obvious changes and green fluorescence was detected in about 70%-80%cells of the A549-ZsGreen-Puro and A549-N1ICD group by fluorescence microscope after Pu-romycin screening .The N1ICD mRNA expression of the control group , A549-ZsGreen-Puro group and A549-N1ICD group was 1.59 ±0.11, 1.09±0.10 and 70.81 ±6.39, respectively and the N1ICD mRNA expression of the A549-N1ICD group was significant higher than that of the other two groups (all P<0.01).The N1ICD protein expression of thethree groups was 1.99 ±0.13, 1.73 ±0.08 and 6.58 ±0.43, respectively and the N1ICD protein expression of the A549-N1ICD group was significant higher than that of the other two groups (allP<0.01).Conclusions A lung adenocarcinoma cell line A549 with stable expression of N1ICD was successfully constructed .%目的：构建Notch1胞内结构域（ N1ICD）稳定表达的肺腺癌A549细胞株。

苦参碱对胰腺癌吉西他滨耐药细胞化疗敏感性的影响

苦参碱对胰腺癌吉西他滨耐药细胞化疗敏感性的影响郭晨博;毛玉宁;张贺;张彩勤;张延英;汪永锋;师长宏【期刊名称】《中国实验动物学报》【年(卷),期】2022(30)8【摘要】目的探索苦参碱在胰腺癌吉西他滨(GEM)耐药中的作用,以期为恢复胰腺癌化疗敏感性提供新的治疗手段。

方法选择胰腺癌细胞系AsPC-1,使用吉西他滨诱导构建胰腺癌吉西他滨耐药细胞株AsPC-1-GEM,通过CCK-8实验测试其耐药性,检测细胞活力分析苦参碱对胰腺癌吉西他滨耐药细胞株的作用;进一步通过RT-PCR和Western Blot检测耐药前后多药耐药蛋白2(ABCG2)的表达变化以及苦参碱对ABCG2的影响;利用裸鼠建立胰腺癌吉西他滨耐药细胞系异种移植模型,观察使用苦参碱治疗后肿瘤体积的变化;通过免疫组化检测苦参碱对ABCG2表达的影响。

结果耐药细胞AsPC-1-GEM中ABCG2表达增高(P<0.01),苦参碱可有效降低耐药细胞ABCG2的表达(P<0.01),提高胰腺癌吉西他滨耐药细胞的敏感性(P<0.01)。

体内实验进一步验证了苦参碱治疗可降低ABCG2的表达(P<0.01),并减缓肿瘤生长(P<0.01)。

结论苦参碱通过降低ABCG2的表达,提高胰腺癌吉西他滨耐药细胞株的敏感性。

【总页数】8页(P1042-1049)【作者】郭晨博;毛玉宁;张贺;张彩勤;张延英;汪永锋;师长宏【作者单位】甘肃中医药大学;空军军医大学实验动物中心【正文语种】中文【中图分类】Q95-33【相关文献】1.TLR-9在胰腺癌细胞化疗中对吉西他滨耐药性的影响2.苦参碱对胰腺癌吉西他滨耐药及Aurora-A表达的影响3.苦参碱对结肠癌耐药细胞化疗药物敏感性及自噬水平的影响4.下调AFAP-1L2表达对人胰腺癌细胞吉西他滨化疗敏感性的影响5.长链非编码RNA MALAT1对耐吉西他滨胰腺癌细胞化疗敏感性的影响因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

Aurora-A

胰腺癌吉西他滨耐药研究的载体。
【关键词】 ’ Ａｕｒｏｒａ — Ａ激酶胰腺癌多药耐药吉西他滨
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏａｓｓｅｓｓｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｏｆＡｕｒｏｒａ — Ａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｉｔｈｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅ
浙江临床医学２０１５年９月第１７卷第９期
・１４５７・
ＡｌＪ嗍一Ａ在胰腺癌的表达及与吉西他滨耐药的相关
何永礼王欣施福田严秋亮朱锦辉★
充
【摘要】目的￣Ａｕｒｏｒａ — Ａ的表达与胰腺癌吉西他滨耐药的相关性。方法ｑＰｃＲ法测定ＰＡＮｃ — ｌ和耐药细胞株ＰＡＮＣ．１／Ｒ２￣Ａｕｒｏｒａ．Ａ
ｍＲＮＡ的表达；分别用ＰＡＮＣ．１和ＰＡＮＣ．１／Ｒ２建立胰腺癌动物模型，免疫组化方法测定瘤体Ａｕｒｏｒａ．Ａ的表达。结果ＰＡＮＣ．１组模型第５周肿
瘤转移率３６．８％（７／１９），裸鼠体重（２３．２ ±１．４１）ｇ，肿瘤重量（０．４５３±０．１１０）ｇ；ＰＡＮＣ．１／Ｒ２￣．模型第５周肿瘤转移率５０％（９／１８），裸鼠体重（２２．９１ ±１．１３）ｇ，肿瘤重量（０．５６４±０．２０３）ｇ。转移率和肿瘤质量两组比较差异有统计学意义。ＰＡＮＣ一１￣－Ａｕｒｏｒａ－ＡｍＲＮＡ表达为（１．００２ ±０．０４０）：ＰＡＮＣ— ｌ／Ｒ２组Ａｕｒｏｒａ．ＡｍＲＮＡ表达为（１．８４５ ±０．０６９），两组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。ＰＡＮＣ— ｌ／Ｒ２组ｌ８例标本

重组腺病毒介导MRP反义RNA对人肝癌耐药细胞株MDR表型逆转的实验研究

重组腺病毒介导MRP反义RNA对人肝癌耐药细胞株MDR表型逆转的实验研究陈琳;苟兴华;严律南;李德华;韩蕾;赵兰英;胡海洋【期刊名称】《实用肿瘤杂志》【年(卷),期】2005(20)6【摘要】目的探讨重组腺病毒载体介导的多药耐药相关蛋白(M RP)反义RNA对多柔比星(阿霉素)诱导的人肝癌耐药细胞株SMM C-7721/ADM多药耐药表型的逆转作用。

方法将M RP基因5′端转录起始位点附近长约500 bp的基因片段反向克隆到腺病毒A dE asy系统的穿梭质粒A dT rack-CM V上,通过在细菌内同源重组、并在293细胞中包装、扩增,构建出携带反义M RP的重组腺病毒A dE asy-GFP-A sm rp(简称A d-A sm rp),测定其滴度及对肝癌细胞SMM C-7721/ADM 的转染效率;在体外用M O I为100的该重组腺病毒转染肝癌细胞SMM C-7721/ADM,测定转染后细胞对阿霉素(ADM)及柔红霉素(DNR)的半数致死量(IC50)并计算耐药倍数(RF值);在转染后不同时间点(24、48、72、96、120小时)用流式细胞仪动态测定细胞对DNR摄取的变化及细胞膜表面P190表达、并用RT-PCR 反映细胞M RP之mRNA水平的变化(以βactin mRNA水平为内对照)。

结果重组腺病毒A d-A Sm rp滴度可达2.5×109efu/m l,M O I为100时,即可致90%以上的肝癌细胞SMM C-7721/ADM被感染。

体外实验中,该重组腺病毒(M OI=100)转染后的人肝癌耐药细胞SMM C-7721/ADM对ADM、DNR的IC50分别为0.487μg/m l、0.328μg/m l,RF分别为97.4倍、109.3倍,RF分别下降36.8倍和35.4倍。

在转染后24小时,M RP之mRNA水平开始下降并呈持续下降趋势(P<0.05),48小时后伴有P190蛋白表达的持续下降(P<0.05),二者趋势一致。

自噬在人肝癌细胞Huh7对仑伐替尼耐药中的调节作用

自噬在人肝癌细胞Huh 7对仑伐替尼耐药中的调节作用Δ陈大红＊，吴亚菲，刁文婧，杨蕙华，毛鹏娟，李琴 #（上海交通大学医学院附属第一人民医院临床药学科，上海　200080）中图分类号 R 965；R 735.7 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2024）08-0961-06DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2024.08.11摘要目的研究自噬在人肝癌细胞Huh 7对仑伐替尼耐药中的调节作用。

方法以人肝癌细胞Huh 7为对象，采用低浓度逐渐递增联合长期给药的方式构建仑伐替尼耐药细胞模型Huh 7-LR ，以CCK-8实验和流式细胞术检测亲本细胞Huh 7及耐药细胞Huh 7-LR 对仑伐替尼的敏感性，以Western blot 实验和GFP-mCherry-LC 3质粒转染实验分别检测细胞中自噬效应蛋白Beclin-1、自噬接头蛋白sequestosome 1（又名p 62）、微管相关蛋白1轻链3（LC 3）的表达水平和细胞自噬水平。

通过饥饿诱导构建自噬激活细胞模型，以Western blot 实验和GFP-mCherry-LC 3质粒转染实验分别检测细胞中p 62蛋白表达水平和细胞自噬水平，以流式细胞术检测自噬激活对仑伐替尼敏感性的影响。

结果与亲本细胞相比，Huh 7-LR 细胞的耐药指数为6.2，其p 62蛋白的表达水平显著升高，凋亡率、Beclin-1蛋白的表达水平和LC 3Ⅱ/LC 3Ⅰ比值均显著降低（P ＜0.05或P ＜0.01），自噬水平有所下降。

自噬激活可显著升高Huh 7-LR 细胞中p 62蛋白的表达水平（P ＜0.05）和自噬水平，并显著升高其凋亡率（P ＜0.05）。

结论自噬参与了仑伐替尼耐药，激活自噬可一定程度逆转肝癌细胞对仑伐替尼耐药。

关键词自噬；仑伐替尼；肝癌细胞；耐药Regulatory effect of autophagy on the resistance of human liver cancer cell Huh 7 to lenvatinibCHEN Dahong ，WU Yafei ，DIAO Wenjing ，YANG Huihua ，MAO Pengjuan ，LI Qin （Dept. of Clinical Pharmacy ， Shanghai General Hospital ， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine ， Shanghai 200080， China ）ABSTRACTOBJECTIVE To investigate the regulatory effect of autophagy on the resistance of human liver cancer cell Huh 7 tolenvatinib. METHODS Using human liver cancer cell Huh 7 as subject ， the lenvatinib-resist cell model （Huh 7-LR ） was generated by the low-dose gradient method combined with long-term administration. The sensitivity of parental cell Huh 7 and drug-resistant cell Huh 7-LR to lenvatinib was detected by using CCK-8 assay and flow cytometry. Western blot assay and GFP-mCherry-LC 3 plasmid transfection were performed to detect the expression levels of autophagic protein Beclin-1， autophagic adapter protein sequestosome 1 （p 62）， microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC 3） and autophagic level. Furthermore ， an autophagy activation model was constructed by cell starvation ， the protein expression of p 62 and autophagy level were detected by using Western blot assay and GFP-mCherry-LC 3 plasmid transfection ， and the effect of autophagy activation on the sensitivity of Huh 7-LR cells to lenvatinib was detected by flow cytometry. RESULTS Compared with parental cells ， the drug resistance index of Huh 7-LR cells was 6.2； protein expression of p 62 was increased significantly ， while apoptotic rate ， protein expression of Beclin-1 and LC 3Ⅱ/ LC 3Ⅰ ratio were all reduced significantly （P ＜0.05 or P ＜0.01）； the level of autophagy was decreased to some extent. Autophagy activation could significantly increase the protein expression of p 62 in Huh 7-LR cells （P ＜0.05） and autophagy level ， and significantly increase its apoptotic rate （P ＜0.05）. CONCLUSIONS Autophagy is involved in lenvatinib resistance ， and activating autophagy can reverse the resistance of liver cancer cells to lenvatinib to some extent.KEYWORDSautophagy ； lenvatinib ； liver cancer cell ； drug resistance2020年全球肝癌确诊病例超90万，死亡病例达83万，是全球范围内第六大常见癌症和第三大常见癌症死亡原因[1]。

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耐药细胞株构建
实验目的：采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导肿瘤细胞对特定细胞产生耐药性
实验材料：
试剂：培养基（GIBCO），血清（CIBCO）
仪器：超净工作台、CO2培养箱、生物倒置显微镜
实验内容与方法：
1．体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导细胞的耐药性
2． MTT法测定药物对亲本细胞和耐药细胞的IC50，计算耐药指数
实验信息（客户提供）：
1．生长状况良好的宿主细胞株，并提供细胞特性，培养条件及相关注意事项。
2．诱导剂
服务周期：6个月
结果提交：提交实验报告书（耐药指数、实验试剂与设备、实验过程、结果分析、原始数据、细胞图片等）、
耐药细胞株、亲本细胞株
收费标准：
5000元/株
实验范例 :
凯基已诱导建立了A2780/Taxol（耐药指数：30）、Patu8988/5-FU(耐药指数：40)、
Bel/5-FU（耐药指数：200）等10余株耐药细胞株
罗丹明123（Rhodamine123）外排法测定药物在细胞中的积累
人卵巢癌细胞A2780

人卵巢癌细胞紫杉醇耐药株A2780/Taxol
RT-PCR法测定基因表达