一种建立肝细胞癌顺铂耐药细胞株的方法
一种建立肝细胞癌顺铂耐药细胞株的方法 2016-11-21 13:33来源：内江洛伯尔材料科技有限公司作者：研发部
一种建立肝细胞癌顺铂耐药细胞株的方法
原发性肝癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在恶性肿瘤中排名
第 六，死亡率则居第三，且大多数肝癌患者诊断时已是中晚期，术后频频复发转移，
导致肝癌 患者的预后较差。化疗是治疗肝癌的重要手段之一，但化疗中常出现且难
以解决的是肿瘤 多药耐药性（multidrugresistance,MDR)，即肿瘤同时对多种结构
和作用机制不同的化学 药物产生交叉耐药，它是化疗失败的主要原因。因此克服肿
瘤多药耐药性以及防止或逆转 肿瘤多药耐药的发生对于提高化疗效果十分重要。而
建立肿瘤耐药细胞株对于研究肿瘤耐 药机制、肿瘤细胞耐药性逆转、开发及评价新
药等具有重要的应用价值。
顺铂（cis-diaminedichloroplatinum，Q)DP)属细胞周期非特异性药物，具有细 胞
毒性，可抑制癌细胞的DNA复制过程，并损伤其细胞膜上结构，有较强的广谱抗癌
作用， 为临床治疗肝癌常用药物。
本发明提供一种建立肝细胞癌顺铂耐药细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、取人肝癌细胞LM3细胞复苏后用DMEM培养液，于培养箱中培养；步骤二、
取对数生长期LM3细胞种于24孔板中，分别加入0.1μmol/L、0.25μmol/L、0.5
μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L顺铂，适时传代或换夜。以
顺铂加入后细胞可以保持长期生长的最大浓度为最佳浓度。步骤三、寻找到最佳浓
度为0.5μmol/L，后用最佳浓度长期刺激细胞4个月，得到肝细胞癌顺铂耐药细胞
株。本发明得到的肝细胞癌顺铂耐药细胞株可用于发现肿瘤耐药标志物以及筛选和
评估新型抗肿瘤药物等。
藤梨根提取物对肺腺癌A549细胞顺铂耐药的影响
临床医药文献电子杂志
Electronic Journal of Clinical Medical Literature2019 年第 6 卷第 63 期
2019 Vol.6 No.63
161
藤梨根提取物对肺腺癌A549细胞顺铂耐药的影响
方亚妮，刘金辉（陕西中医药大学医学技术学院，陕西 咸阳 712046）
【摘要】患者对顺铂为基础的化疗产生获得性耐受是非小细胞肺癌临床治疗中面临的难题。找到一种可
逆转肺癌患者顺铂耐药的方法对于其临床治疗有着重大的意义。本研究通过药物敏感性实验初步证实：藤梨
根的乙酸乙酯提取物可显著提升肺腺癌耐药细胞A549/DDP对顺铂的敏感性。
【关键词】肺癌；顺铂；耐药；藤梨根
【中图分类号】R734.2 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095-8242.2019.63.161.02
肺癌是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率占据全球所有
恶性肿瘤的第一位，发病率也有逐年日益上升的趋势。目
前，晚期肺癌的治疗主要以放化疗为主。尽管以铂类药物
为基础的化疗是目前针对肺癌中晚期患者最有效治疗方案
之一，其真实的临床的应答率仍仅为17%～22%，5年的总
生存率只在11%左右[1]。临床研究表明，患者对顺铂的耐
药，包括原发性耐药以及更为普遍的获得性耐药，是造成
患者应答率和总体生存率低的重要原因[2]。因此，发现一种有
效的逆转NSCLC顺铂耐药的方法成为亟待解决的科学问题。
藤梨根是猕猴桃科植物中华猕猴桃（Actinidia chinensis Planch）或软枣猕猴桃（A.arguta Planch）的干燥根，含有
熊果酸、齐墩果酸、槲皮素、积雪草酸、β-谷甾醇等多种
成分[3-5]。藤梨根味甘、微涩、性凉，具有清热解毒、祛风
湿、消肿疥、利尿止血等作用，可用于黄疸，水肿，淋浊
带下，风湿痹痛，跌打损伤等病症的治疗，是临床上常用
的组方用药[3]。在中医临床研究中，藤梨根首先被证实对胃
癌[6]，食管癌[7]，结肠癌[8]等消化道肿瘤有一定的抗肿瘤功
肿瘤多药耐药模型建立方法的应用进展
·综述· 山东医药２０１８年第５８卷第７期 肿瘤多药耐药模型建立方法的应用进展 汤婷婷 ，刘华钢 ，梁燕 ，范玉琴 。吴余燕 （１广西中医药大学药学院，南宁５３０２９９；２广西医科大学药学院） 摘要：肿瘤多药耐药（ＭＤＲ）模型的建立是肿瘤耐药机制和耐药逆转方法研究的前提。肿瘤ＭＤＲ模型分为体 外和体内模型。目前，肿瘤ＭＤＲ体外模型建立方法主要有高浓度反复间歇诱导法、药物浓度递增诱导法、高浓度 反复间歇诱导与药物浓度递增相结合法、转基因结合药物筛选法和三维细胞培养法，其中三维细胞培养法建立的 ＭＤＲ模型生物学活性与在体肿瘤更接近且能模拟体内微环境，弥￥ｂＴ其他方法的不足，但培养系统较复杂、实验周 期长。肿瘤ＭＤＲ体内模型主要通过移植和诱导两种方法构建，两种方法制作的ＭＤＲ动物模型均能保持动物原有 的组织学构造及原肿瘤细胞的各项特性，重现原始肿瘤结构，模拟体内微环境，反映体内肿瘤形成情况。 关键词：肿瘤耐药；多药耐药；耐药细胞模型；动物模型 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－２６６Ｘ．２０１８．０７．０３０ 中图分类号：Ｒ７３－３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１８）０７－００９６＿０３ 目前治疗肿瘤的主要方法是化疗。超过一半的 肿瘤会对化疗药物产生多药耐药（ＭＤＲ），而肿瘤 ＭＤＲ的出现是致使化疗失败的原因之一。ＭＤＲ是 指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物耐药的同时，对非同 类型的结构和作用机制不同的其他抗肿瘤药物也产 生交叉耐药性。耐药性的产生给肿瘤治疗带来巨大 挑战。肿瘤耐药机制复杂，主要包括：ｐ－糖蛋白（Ｐ－ ｇｐ）、多药耐药相关蛋白（ＭＲＰ）、乳腺癌耐药蛋白 （ＢＣＲＰ）及肺耐药蛋白（ＬＲＰ）等高表达使得细胞内 化疗药物外排，药效作用减轻或消失；ｌｎｃＲＮＡ通过 调控与肿瘤耐药信号通路相关基因、蛋白的表达来 调控ＭＤＲ的产生；ＭＤＲ相关酶如谷胱甘肽Ｓ．转移 酶（ＧＳＴｓ）、蛋白酶ｃ（ＰＫＣ）、ＤＮＡ拓扑异构酶Ⅱ （ＴｏｐｏⅡ）等活性增强或过度表达；抑制自噬可能导 致肿瘤细胞ＭＤＲ的产生；细胞凋亡机制异常；低氧 诱导因子一１仅（ＨＩＦ－１ ０【）表达上调 。目前关于肿 瘤ＭＤＲ机制的研究成为热点。ＭＤＲ体内和体外模 型的建立为进一步阐明ＭＤＲ的机制、逆转肿瘤 ＭＤＲ和提高化疗效果奠定了基础 ｌ５ Ｊ。随着各种 ＭＤＲ模型建立方法的出现，建模方法的优劣势也在 实践中充分体现。现对相关文献报道的肿瘤 ＭＤＲ 建模方法及其优劣势综述如下。 １ 肿瘤ＭＤＲ体外模型建立方法 主要分为高浓度反复间歇诱导法、药物浓度递 基金项目：国家自然科学基金资助项目（８１２６０６５７）。 通信作者：刘华钢（Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｇｌｉｕ＠２６３．ｎｅｔ） ９６ 增诱导法、高浓度反复间歇诱导与药物浓度递增相 结合法、转基因结合药物筛选法和三维细胞培养法。 上述５种建模方法各有优劣势，需根据实验需要进 行选择。 １．１高浓度间歇诱导法高浓度间歇诱导法是指 选择使用高剂量的药物短时间作用后正常培养恢 复，反复进行直到产生耐药性 Ｊ。李 春等 取对 数生长期的人卵巢癌细胞ＯＶＣＡＲ－３以Ｉｃ 。（１０．０ ￣ｍｏｌ／Ｌ）的阿霉素（ＡＤＭ）孵育２ ｈ后，根据预实验 结果，舍弃含药培养液改用普通１６４０继续培养，保 留存活细胞待长满培养瓶后，再按相同的浓度给药， 反复重复上述换液、消化、传代过程，每４周检测耐 药性，４个月后最终获得能完全耐受１０．０￣ｍｏｌ／Ｌ ＡＤＭ的细胞株ＯＶＣＡＲ一３／ＡＤＭ。张丹等 选取终 浓度为５００ ｎｇ／ｍＬ的培美曲塞二钠（ＰＥＭ）作为干 预浓度作用于对数生长期的肺腺癌细胞Ａ５４９，经过 ４个月反复冲击，最终成功建立Ａ５４９细胞培美曲塞 耐药株模型，获得所需要耐药指数为２７．１８士１．１６ 的耐药细胞株Ａ５４９／ＰＥＭ，诱导成功的Ａ５４９／ＰＥＭ 较亲本株Ａ５４９形态不规则，两种细胞株在倍增时 间、生长曲线方面很相近，且脱药４周后Ａ５４９／ＰＥＭ 细胞仍能稳定生长、传代。高浓度反复间歇法虽然 诱导所需周期比较长，但制作过程更近似临床周期 性化疗的用药模式 。 １．２药物浓度递增诱导法该法为从低到高逐渐 增加药物浓度，直到诱导出ＭＤＲ细胞系。洪广亮 等＿１
顺铂耐药的分子机制及中药干预的研究进展
顺铂耐药的分子机制及中药干预的研究进展
顺铂是临床上广泛应用的一线抗癌药物，但顺铂耐药性的产生降低了顺铂的疗效。顺铂是一种细胞周期非特异性药物，其主要作用靶点是细胞内具有亲核性的蛋白质、DNA和RNA。顺铂耐药机制是多因素的，其中转运蛋白的异常表达、细胞内解毒作用的增强、DNA修复能力的增加以及细胞凋亡受阻是顺铂耐药的主要机制。中药在肿瘤治疗中具有独特的优势，中药与顺铂联用能够提高疗效。该文对顺铂耐药的机制和近年来中药与顺铂联合应用的研究进展进行综述。
标签：顺铂；耐药；联合用药；中药
顺铂（cisplatin，DDP）是临床治疗肿瘤的广谱抗癌药，自1978年首次被FDA批准用于治疗膀胱癌和睾丸癌以来，多用于肺癌、卵巢癌、头颈癌等其他实体瘤的治疗[1]。继第一代铂类药物顺铂之后，相继研发出第二代卡铂和第三代铂类药物奥沙利铂，但顺铂在卵巢癌三期等临床治疗中仍是最主要的药物[2]。由于顺铂在治疗肿瘤的过程中会出现原发性耐药和获得性耐药，其中获得性耐药的迅速出现是顺铂化疗失败的主要原因[3]。
迄今为止，顺铂进入细胞内的机制仍旧没有完全明确，顺铂在血浆及细胞外结构稳定，由于细胞内的氯离子浓度相对于血浆以及细胞外液偏低，顺铂的氯离子解离后被水分子取代而具有亲电子特性，易与细胞内亲核物质如谷胱甘肽、金属硫蛋白、蛋氨酸、DNA等结合而形成加合物[4]。顺铂耐药是一个多因素、多基因的复杂过程，有研究发现：中药与顺铂联用能够提高顺铂对肿瘤细胞的增殖毒性作用，诱导细胞凋亡从而提高肿瘤细胞对顺铂的敏感性。
1 顺铂耐药机制
1.1 顺铂的转运和代谢改变 顺铂的理化性质决定了顺铂进入细胞和发挥细胞毒性的方式。药物代谢的改变能够引起原发耐药和获得性耐药，与顺铂代谢有关的耐药研究较多，包括顺铂的摄取、流出和解毒过程。很长一段时间内，人们认为顺铂是通过被动扩散进入细胞内，然而研究发现参与细胞铜代谢平衡过程的膜蛋白铜转运蛋白1（copper transporter 1，CTR1）参与顺铂的转运过程。Ishida等[5]研究发现敲除酵母菌的CTR1基因后，顺铂在细胞内的积累减少，并且引起酵母菌对顺铂的耐药。More等[6]运用铜（CTR1的主要配体）进行细胞前处理时，发现细胞不受顺铂影响。另研究发现CTR2与CTR1具有相反的功能，能够将顺铂泵出细胞外而降低顺铂的细胞毒性[7]。铜转运P型三磷酸腺苷ATP7A和ATP7B也参与了顺铂的外排和耐药[8]，它们都是是铜外排蛋白，与CTR1同属铜转运蛋白家族成员而参与细胞内铜代谢平衡。临床研究显示ATP7B的表达水平对卵巢癌和子宫内膜癌顺铂敏感性有预示作用[9-10]。
β-Catenin信号转导通路在肺癌A549细胞顺铂耐药中的作用
６ 辽孝ｇ压Ｍｅ亏ｄｉｃ琵ａｌ学报 ２０ｌ１ Ｆｅｂ．３２（１）Ｊ Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ …１ Ｊ ｕ‘ Ｉ３一Ｃａｔｅｎｉｎ信号 转导通路在肺癌 Ａ５４９细胞Ｉｒｉｓ 耐药中的作用 陶黎阳，龙捷 （广州医学院病理教研室，广东广州５１０１８２） 摘要：目的建立肺癌Ａ５４９顺铂多药耐药细胞株，研究肺癌耐药的机制。方法使用顺铂逐步增加剂量和 间歇大剂量冲击相结合的方法诱导肺癌Ａ５４９细胞，以建立其多药耐药细胞株Ａ５４９／ＤＤＰ；Ｍ ｒｒ细胞毒实验比较 Ａ５４９与Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对顺铂的敏感性；绘制Ａ５４９和Ａ５４９／ＤＤＰ细胞生长曲线，观察二者的增殖速度变化； Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ实验显示Ａ５４９和Ａ５４９／ＤＤＰ细胞之间Ａｋｔ、Ｐ—Ａｋｔ、ＧＳＫ一３１３、Ｐ～ＧＳＫ一３Ｂ和Ｂ—Ｃａｔｅｎｉｎ蛋白 的表达改变。结果经过３０周的诱导我们建立了肺癌Ａ５４９细胞的顺铂耐药细胞株Ａ５４９／ＤＤＰ；ＭＴＦ细胞毒实验 结果显示顺铂对Ａ５４９和Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的ＩＣ 值分别为（１．３７±０．０９）和（１１．６３±０．７４）￣ｍｏｌ／Ｌ，与Ａ５４９细 胞比较，Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对顺铂耐药８．４７倍，生长曲线结果显示Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的增殖速度与Ａ５４９细胞没有显 著性差异；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ的结果显示Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的Ａｋｔ磷酸化水平升高，抑制了下游ＧＳＫ一３Ｂ的活性，导 致了细胞内１３一Ｃａｔｅｎｉｎ蛋白的上调。结论建立了肺癌Ａ５４９顺铂多药耐药细胞系Ａ５４９／ＤＤＰ，Ａ５４９／ＤＤＰ细胞 中Ｂ—Ｃａｔｅｎｉｎ通路的激活与其耐药性的形成有一定的相关性。 关键词：肺癌；Ａ５４９细胞；多药耐药；Ｂ—Ｃａｔｅｎｉｎ信号通路 中图分类号：Ｒ３６１．３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７４—０４２４（２０１１）０１—０００６—０３ Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐ—Ｃａｔｅｎｉｎ Ｐａｔｈｗａｙ ｏｎ ＤＤＰ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ａ５４９ Ｃｅｌｌ ＴＡＯ Ｌｉｙａｎｇ，ＬＯＮＧ Ｊｉｅ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５ １０１ ８２ Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（ＤＤＰ）ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ａ５４９ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ａｎｄ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ Ａ５４９ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｅｘｐｏｓｅｄ ｉｎ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｏｒ ｉｎｔｅｒｖａｌ ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ ｏｆ ＤＤＰ．ＭＴｒ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＤＤＰ ａｇａｉｎｓｔ Ａ５４９ ａｎｄ Ａ５４９／ＤＤＰ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒｓ ｗｅｒｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｔｏ ｄｒａｗ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ．Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ Ａｋｔ，Ｐ—Ａｋｔ，ＧＳＫ一３ Ｂ，Ｐ—ＧＳＫ一 ３Ｂ ａｎｄ Ｂ—Ｃａｔｅｎｉｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ａ５４９ ａｎｄ Ａ５４９／ＤＤＰ ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＤＤＰ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ａ５４９／ＤＤＰ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＤＤＰ ｅｏｎｔｉｎｕＯＵＳ ｉｒｉｄｕｃｉｎｇ．Ｔｈｅ ＩＣ ｎ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ＤＤＰ ａｇａｉｎｓｔ Ａ５４９ ａｎｄ Ａ５４９／ＤＤＰ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ（１．３７±０．０９）ａｎｄ（１ １．６３±０．７４）ｐ￣ｍｏ］／Ｌ ｂｙ ＭＴｒ ａｓｓａｙ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｉｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａ５４９ ａｎｄ Ａ５４９／ＤＤＰ ｃｅｌｌｓ．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｐｈｏｓｐｈｏ—Ａｋｔ ｗａｓ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ Ａ５４９／ＤＤＰ ｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｃｈ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＳＫ一３ ｐ ａｔ ｓｅｒｌｎｅ ９．Ｃｏｒｎ— ｐａｒｅｄ ｔｏ Ａ５４９ ｃｅｌｌｓ，ｔｈｅ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ—Ｃａｔｅｎｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ Ａ５４９／ＤＤＰ ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ａ５４９／ＤＤＰ ｓｈｏｗｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ＤＤＰ ａｎｄ ｗａｓ ａ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｍｕｈｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅ１．Ｔｈｅ Ｂ—Ｃａｔｅｎｉｎ ｐａｔｈｗａｙ ｐｌａｙｅｄ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ Ａ５４９／ＤＤＰ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ；Ａ５４９ ｃｅｌｌ；ｍｕｈｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；Ｄ—Ｃａｔｅｎｉｎ ｐａｔｈｗａｙ 肺癌是人类发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之 一，大约７０％的患者在诊断时已发展至晚期，无 法通过手术治愈，所以化疗在肺癌治疗中占有重要 地位，但是肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药性常 常成为影响肺癌化疗疗效的主要障碍 １ 。多药耐 药是指病人对一种化疗药物产生耐药的同时，对结 基金项目：２０１０年度广州医学院博士、留学回国人员基金项目，编号：２０１０Ｃ１７。 作者简介：陶黎阳（１９７５），男，河南省信阳市人，讲师，博士学位，主要研究方向为肿瘤多药耐药。
顺铂作用于人肝癌细胞系HepG2后肿瘤干细胞标志物增加
顺铂作用于人肝癌细胞系HepG2后肿瘤干细胞标志物增加
赵小鸽;田美丽;杨阳;童冬冬;陈伟
【摘 要】目的 探讨顺铂(cisplatin)作用于人肝癌细胞系HepG2后细胞增殖能力和周期的变化,及残余细胞中CD133、ABCG2及ICAM-1表达量的变化.方法 以人肝癌细胞系HepG2为研究对象,分别采用MTT比色法和PI染色法检测不同浓度cisplatin作用后细胞增殖能力及细胞周期分布的变化;免疫荧光法检测cisplatin对肿瘤干细胞标志物表达量的影响.结果 不同浓度cisplatin作用后均可明显抑制HepG2细胞的增殖.进一步研究发现,分别使用4 mg/L和2mg/L的cisplatin作用48 h后对HepG2细胞周期Go/G1期及S期有显著影响,cisplatin处理使残留HepG2细胞中CD133、ABCG2及ICAM-I的表达量明显升高.结论 HepG2细胞中存在的小部分肝癌干细胞能够逃脱cisplatin的杀伤作用,此种逃避过程的发生可能是临床上肝癌经治疗后复发的重要原因.
【期刊名称】《西安交通大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2015(036)001
【总页数】4页(P89-92)
【关键词】顺铂;肝癌;肿瘤干细胞;细胞增殖;细胞周期
【作 者】赵小鸽;田美丽;杨阳;童冬冬;陈伟
【作者单位】西安交通大学医学院环境与疾病相关基因教育部重点实验室、生物医学基础研究中心,陕西西安710061;西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤放疗科,陕西西安710061;西安交通大学医学院遗传学与分子生物学系,陕西西安710061;西安交通大学医学院遗传学与分子生物学系,陕西西安710061;中国人民解放军南京军区南京总医院,江苏南京210002
【正文语种】中 文
【中图分类】R735.7
肝细胞癌是我国常见的恶性肿瘤，临床治疗效果不甚显著，复发率和死亡率高。近年来，研究人员提出了与肿瘤增殖、转移和复发密切相关的肿瘤干细胞(cancer
一种新的肺腺癌A549细胞耐药株培养方法
临床医药文献电子杂志
Electronic Journal of Clinical Medical Literature2019 年第 6 卷第 32 期
2019 Vol.6 No.32
175
・实验研究・
一种新的肺腺癌A549细胞耐药株培养方法
方亚妮，石小玲（陕西中医药大学医学技术学院，陕西 咸阳 712046）
【摘要】肺腺癌患者对化疗药物顺铂产生的耐药是影响其疗效的一个重要因素，为了探究这种耐药机
制，构建耐顺铂细胞株往往是基础实验的第一步，我们采用浓度梯度递增和大浓度冲击结合的方法构建了A549耐顺铂细胞株，这种方法大大提升了构建耐药株的效率和成功率。
【关键词】顺铂；A549；耐药；大浓度冲击；浓度梯度递增
【中图分类号】R734.2 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095-8242.2019.32.175.02
肺癌是威胁人类健康最常见的恶性肿瘤之一，近年来
肺癌的发病率和死亡率日益增长，根据国家癌症中心发表
的数据显示，2015年，我国肺癌的发病率和死亡率已跃居
所有癌症病例的首位[1]。肺癌按照其病理类型可分为非小细
胞肺癌和小细胞肺癌两种，其中非小细胞肺癌占80%左右。
非小细胞肺癌近一步分为大细胞癌，鳞状细胞癌及腺癌三
种类型，其中腺癌患者所占比重最高，约50%左右[2]。
以铂类药物为基础的化疗是目前针对肺腺癌中晚期患
者最有效的治疗方案之一[3]，但患者治疗后的总体生存率仍
比较低，临床研究表明，患者对顺铂的耐药，是造成患者
应答率和总体生存率低的重要原因[4]。
因此研究肺腺癌患者对顺铂产生获得性耐药的原因，
找到可以提高肺腺癌耐药患者对顺铂敏感性的方法至关重
要。细胞实验是进行临床基础实验的第一步，为探究与肺
腺癌顺铂耐药相关的课题，诱导获得耐药株至关重要。本
研究提供了一种新型的耐药细胞株培养方法，将浓度梯度
递增和大浓度冲击两种方法进行结合，缩短了获得耐药株
的时长，提高了诱导获得耐药株的成功率和耐药倍数。
DDP)作用的研究的开题报告
大蒜素对体外培养的人上皮性卵巢癌耐顺铂细胞株(SKOV-3/DDP)作用的研究的开题报告
研究背景：
卵巢癌是女性恶性肿瘤中发病率最高、致死率最高的一种。即便接受治疗，大约有70%的人最终也会死于该病。目前，耐药是卵巢癌治疗的一大难题，特别是对于常规化疗药物顺铂。因此，探索可用于治疗顺铂耐药的新型化合物和药物具有重要意义。
大蒜素是一种天然化合物，被认为具有抗肿瘤、抗氧化和抗炎等多种生物学活性。已有研究表明，大蒜素对多种恶性肿瘤具有直接抑制效应，而且在治疗肿瘤耐受性方面具有潜在价值。
本研究旨在探讨大蒜素对体外培养的人上皮性卵巢癌耐顺铂细胞株(SKOV-3/DDP)的作用，并进一步阐述其可能的作用机制。通过该研究，将为开发用于治疗顺铂耐药卵巢癌的新型化合物和药物提供理论支持。
研究方法：
1. 细胞株及培养条件：使用体外培养的人上皮性卵巢癌耐顺铂细胞株(SKOV-3/DDP)，在基础培养液中培养。平板琼脂糖凝胶方法筛选细胞，以细胞密度为5×104个/ml分装至96孔板。
2. 实验分组：把细胞分为大蒜素组和对照组。大蒜素的终浓度分别为50、75、100、150、200、300μmol/L，对照组为阴性对照组和假药对照组。
3. 检测细胞增殖：在24h、48h、72h、96h和120h时，用MTT法检测各组细胞活力。
4. 检测细胞凋亡：分别在大蒜素作用48h和72h时，用Annexin V-FITC/PI法检测各组细胞死亡率。同时，采用Western blot法检测细胞内凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP的表达。 5. 检测顺铂耐药性：将大蒜素与顺铂联合作用，检测各组细胞的IC50值，进一步评价大蒜素在顺铂耐药性治疗方面的潜在效果。
研究意义：
通过本研究，旨在探讨大蒜素对体外培养的人上皮性卵巢癌耐顺铂细胞株(SKOV-3/DDP)的作用，并初步阐述其可能的作用机制。若实验结果表明大蒜素可以抑制细胞增殖、促使细胞凋亡，同时降低顺铂耐药性，那么将为开发新型卵巢癌治疗药物提供理论基础和实验支持。
索拉非尼联合顺铂对肝癌HepG2细胞的抑制作用
索拉非尼联合顺铂对肝癌ＨｅｐＧ２细胞的抑制作用
陈逢生，崔彦芝，罗荣城，伍婧，张华（南方医科大学南方医院肿瘤中心，广东广州５１０５１５）
摘要：目的探讨索拉非尼联合顺铂（ＤＤＰ）对肝癌细胞ＨｅｐＧ２的抑制作用及其可能分子机制。方法单独及联合给药后
以ＭＴＴ法测定ＨｅｐＧ２细胞的增殖，用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ观察ＥＲＫ及ｐＥＲＫ蛋白
的表达。结果索拉非尼及ＤＤＰ单药对ＨｅｐＧ２均有抑制作用，两药联合具有协同或相加作用（Ｐ＜０．０５）。索拉非尼及
ＤＤＰ分别主要使细胞阻滞于Ｇ１及Ｇ２期。两药联用后同时阻滞于Ｇ１及Ｇ２期。联合组凋亡率明显比单药组高（Ｐ＜０．０５）。
单用及联合用药对ＨｅｐＧ２细胞ＥＲＫ表达无明显影响，索拉非尼及联合用药减少ｐＥＲＫ的表达。结论索拉非尼和
ＤＤＰ对肝癌ＨｅｐＧ２细胞有增殖抑制及促凋亡作用，两药联合表现为协同或相加作用，其机制可能与细胞周期的双重
阻滞及细胞增殖通路Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ的抑制有关。
关键词：索拉非尼；顺铂；肝癌；联合用药
中图分类号：Ｒ９７９．１文献标识码：Ａ文章编号：１６７３－４２５４（２００８）０９－１６８４－０４
Ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｏｒａｆｅｎｉｂａｎｄｃｉｓｐｌａｔｉｎｉｎｈｉｂｉｔｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ
ＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ
ＣＨＥＮＦｅｎｇ－ｓｈｅｎｇ，ＣＵＩＹａｎ－ｚｈｉ，ＬＵＯＲｏｎｇ－ｃｈｅｎｇ１，ＷＵＪｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＨｕａ
ＯｎｃｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒ，ＮａｎｆａｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ，ＳｏｕｔｈｅｒｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０５１５，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｆｓｏｒａｆｅｎｉｂｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈｃｉｓｐｌａｔｉｎ（ＤＤＰ）ｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
顺铂诱导三阴性乳腺癌4T1耐药小鼠模型的建立
顺铂诱导三阴性乳腺癌4T1耐药小鼠模型的建立
盛佳钰;陈红风
【摘 要】Objective To establish a cisplatin-resistant 4T1 mouse model of
triple negative breast cancer .Meth-ods A drug resistant mice model was
established with cisplatin ( DDP ) induction and in-vivo/in-vitro
tumorigenic ap-proach.Its resistance characteristics were identified by MTT
assay .Changes of drug resistance gene ( MDR1, BCRP, MMP7, GST-π) and
protein ( P-gp, BCRP, MMP7) expression, and phosphorate-Akt and total-Akt protein expression were evaluated by real-time PCR,
immunohistochemistry and western blot method , respectively.Small
animal live imaging technology was applied to detect tumor
growth .Results Resistance fold (RF) of cisplatin-resistant 4T1 mouse model
was 12.84.The expression of MDR1, BCRP, MMP 7, GST-πmRNA and P-gp,
BCRP, MMP 7 proteins in the resistant mice were higher than that in the
球体形成实验联合药物筛选建立耐顺铂胰腺癌干细胞株
第２６卷 肝 胆 胰 外 科 杂 志 第１期
球体形成实验联合药物筛选建立耐顺铂
胰腺癌干细胞株
杨德君，傅红兵，卫子然，徐嘉鹏，朱振新，蔡清萍
（第二军医大学附属长征医院 胃肠外科，上海２００００３）
［摘要］ 目的探索建立顺铂耐药人胰腺癌干细胞株，并进行初步鉴定。方法通过球体形成实验联合
顺铂药物筛选建立耐顺铂胰腺癌干细胞株；ＭＴＴ法计算耐药指数；免疫荧光半定量检测ＯＣＴ－４、ＳＯＸ－２表达
水平，检测干细胞标记物；免疫荧光半定量检测ＭＵＣ－１表达水平，检测细胞分化能力；通过流式细胞仪测
量侧群细胞和表面特异抗原标记（ＣＤ４４ ／ＣＤ２４ ）检测肿瘤干细胞含量。结果耐顺铂干细胞株的耐药指数
是亲代株ＰＡＮＣ—ｌ的７１．５倍；干细胞标记物的免疫荧光检测发现，耐药株中ＯＣＴ－４、ＳＯＸ－２、ＭＵＣ－１均有不同
程度的表达；耐药干细胞株及亲代株ＳＰ细胞比例分别为（２５．１士１．１）％和（７．８土０．９）％，差异有统计
学意义（ｔ＝６．８９，ＪＤ＜０．０１）；耐药株及亲代株中ＣＤ４４ ／ＣＤ２４ 表型的细胞亚群分别占（２０．８土１．３）％和
（２．４土０．８）％，差异有统计学意义（ｔ＝１６．１３，尸＜０．０１）。结论球体形成实验联合顺铂药物筛选能建立
耐顺铂胰腺癌细胞株，该细胞株能高效富集胰腺癌肿瘤干细胞。
［关键词］ 胰腺癌；肿瘤干细胞；球体形成实验；耐药；筛选
［中图分类号］Ｒ３９２．１２ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］ｌ００７—１９５４（２０１４）一００３８—０５
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｐｈｅｒｅ－ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｓ－
ｓａｙ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ＹＡＮＧ Ｄｅ－ｊｕｎ，ＦＵ Ｈｏｎｇ—ｂｉｎｇ，ＷＥＩ Ｚｉ－ｒａｎ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓ—