耐药胞株构建
解读肿瘤耐药细胞株
解读肿瘤耐药细胞株肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是肿瘤治疗失败的重要因素之一。
迄今，人们主要利用体外建立MDR细胞模型来研究肿瘤产生耐药性的生物学及分子生物学变化。
耐药株机理肿瘤细胞对多种药物产生耐药的原因相当复杂。
肿瘤细胞的耐药可通过很多机制来实现，如细胞膜上的转运蛋白（如ABC转运蛋白和 P-gp 蛋白），以及高表达耐药基因（如MDR1 基因与 MRP 基因），或通过 DNA 损伤修复及抑制细胞凋亡等途径。
由多药耐药基因引起的耐药只是其中一种，这种基因产物是一种膜糖蛋白，它一旦与抗肿瘤药物结合，通过ATP提供能量，可以将药物泵出胞外，使细胞内药物浓度下降，从而表现出耐药现象。
目前发现许多肿瘤耐药细胞具有肿瘤干细胞特性，如人结肠癌 HT29 耐药株、卵巢癌 OVCAR-3、乳腺癌MCF-7、肺癌 H460 等。
肿瘤干细胞学说认为，肿瘤细胞起源于肿瘤干细胞，肿瘤干细胞具有自我更新、多向分化、恶性程度高等特点，肿瘤干细胞是肿瘤耐药的主要原因。
肿瘤细胞对化疗药物产生耐药是目前导致临床化疗失败的主要原因，成为目前阻碍肿瘤治疗的绊脚石。
因此，探索肿瘤细胞产生耐药的原因以及如何改善肿瘤细胞对化疗药物耐药仍是目前研究的热点和难点。
肿瘤细胞耐药的产生是一个复杂的过程，它的机制广泛牵涉到药物代谢学、病理学、生理学等多个学科，这就决定了肿瘤细胞对化疗药物产生耐药的机制是复杂的，因此体外建立化疗药物耐药细胞株仍然是研究肿瘤细胞耐药机制的重要方法。
耐药株建立方法体外建立肿瘤细胞耐药模型是研究肿瘤多药耐药（MDR）的重要手段。
目前已知的体外建立耐药细胞株主要有以下几种方式：大剂量药物冲击法、药物浓度递增法、药物浓度递增与大剂量药物冲击相结合法、转基因结合药物筛选法，也有人采用逆转录病毒转染法。
目前已经在多种肿瘤中建立了耐药模型，如肝癌、结肠癌、乳腺癌等。
其中药物浓度递增法和大剂量药物冲击法成为临床建立肿瘤细胞化疗耐药模型的常用方法。
利妥昔单抗耐药淋巴瘤细胞株构建及其表型分析
生抵 制 。
【 关键词】 非 霍 奇 金 淋 巴瘤 ； Ｃ Ｄ２ ０ ； 单 克 隆抗 体 ； 利妥昔单抗 ； 耐 药
中华 肿 瘤 防 治 杂 志 ， ２ ０ １ ５ ， ２ ２ （ ３ ） ： １ ８ ９ —１ ９ ３
Ｄｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐ ｍｅ ｎｔ ａ ｎｄ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ａ Ｒｉ ｔ ｕ ｘ ｉ ｍａ ｂ — ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｔ ｌ ｙ ｍ ｐｈ ｏ ｍａ ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｉ ｎ ｅ
王 文 廉 万 里 新 屈 中玉
南 阳 市 中心 医院肿瘤 一 病 区， 河南 南阳 ４ ７ ３ ０ ０ ０
【 摘 要】 目 的 构 建 对 利 妥 昔 单 抗 （ Ｒ ｉ ｔ ｕ ｘ ｉ ｍａ ｂ ） 耐药的淋巴瘤细胞株 ， 并 对其 表 型 特征 进行 分 析 ， 为解 决 Ｒｉ ｔ ｕ ｘ ｉ ｍａ ｂ的 耐 药 问题 提 供 新 的 思路 。方 法 采 用“ 梯 度 加 药 法” 在体 外构建 对 Ｒ ｉ ｔ ｕ ｘ ｉ ｍａ ｂ耐 药 的人 淋 巴 瘤 细 胞 株 Ｄ ａ ｕ ｄ ｉ — Ｒ。细 胞 毒 性 检 测 试 剂 盒 检 测 Ｒｉ ｔ ｕ ｘ ｉ ｍａ ｂ诱 导 亲代 和 耐 药 淋 巴 瘤 细 胞 的 补 体 依 赖 的 细 胞 毒 作 用 （ ｃ ｏ ｍｐ ｌ ｅ ｍｅ ｎ ｔ ｄ ｅ ｐ ｅ ｎ ｄ ｅ ｎ ｔ ｃ ｙ ｔ ｏ ｔ ｏ ｘ ｉ ｃ ｉ ｔ ｙ ， Ｃ Ｄ Ｃ） 、 抗 体 依 赖 细 胞 介 导 的 细胞 毒 作 用 （ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙ － ｄ ｅ ｐ ｅ ｎ ｄ ｅ ｎ ｔ ｃ ｅ ｌ ｌ — ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｃ ｙ ｔ ｏ ｔ ０ ｘ ｉ ｃ ｉ ｔ ｙ ， Ａ ＤＣ ｃ） ， Ａｎ ｎ ｅ ｘ ｉ ｎ Ｖ／ Ｐ Ｉ 双 染检 测 Ｒ ｉ ｔ ｕ ｘ ｉ ｍａ ｂ对 亲代 细胞 和抵 制 细 胞 的 诱 导 凋 亡作 用 ， 流 式 细胞 术检 测 耐 药 细 胞表 面 Ｃ Ｄ ２ ０ 、 Ｃ Ｄ ５ ５和 Ｃ Ｄ５ ９的表 达 量 ， 蛋白 质 印 迹 法 检 测 耐 药 细胞 株 细胞 内凋 亡调 节蛋 白 的表 达 量 。 结 果 １ Ｏ 、 ２和 ０ ． ４￣ ｇ ／ ｍＬ 的 Ｒ ｉ ｔ ｕ ｘ ｉ ｍａ ｂ能二 抗 交 联 的 Ｒｉ ｔ ｕ ｘ ｉ ｍａ ｂ诱 导 Ｄａ ｕ ｄ ｉ — ＷＴ 和 Ｄａ ｕ ｄ ｉ — Ｒ 的凋亡 率分别 为（ ２ ６ ． １ １ ４ － ２ ． ７ ８ ） 和（ １ ６ ． １ １４ － ３ ． ５ ０ ） ， ｔ ：
细胞株构建cld
细胞株构建cld细胞株构建是生物学研究中不可或缺的一环，它为科学家提供了大量可重复使用的细胞系。
细胞株构建的过程包括选择细胞来源、细胞分离与培养、筛选与扩增细胞株以及检测与鉴定细胞株。
在这篇文章中，我们将详细介绍细胞株构建的流程及其相关注意事项，以期为广大研究者提供实用的参考。
一、细胞株构建简介细胞株构建是指从原始细胞中分离出具有特定性质的细胞系，这些细胞系可以在体外持续传代并保持稳定的生长特性。
细胞株在生物医学研究、药物筛选和疾病模型等领域具有广泛的应用。
二、细胞株构建流程1.选择细胞来源细胞株构建的第一步是选择合适的细胞来源。
细胞来源可以是正常组织、肿瘤组织、细胞系等。
选择时需考虑研究目的、实验需求以及细胞来源的稳定性等因素。
2.细胞分离与培养细胞分离是将细胞从组织中脱离并进入培养液的过程。
常用的分离方法有消化法、刮擦法等。
细胞培养则是在适当条件下，使细胞在体外继续生长和繁殖。
培养过程中需要密切关注细胞密度、营养代谢、pH值、温度等因素。
3.筛选与扩增细胞株筛选细胞株是将具有特定性质的细胞挑选出来的过程。
常用的筛选方法有抗生素筛选、荧光标记筛选等。
筛选出目标细胞后，需进行扩增以获得足够数量的细胞株。
扩增方法包括传代培养、细胞悬浮培养等。
4.检测与鉴定细胞株检测细胞株的特性和鉴定细胞株的纯度是构建细胞株的关键环节。
常用的检测方法有形态观察、生长曲线测定、细胞周期分析等。
鉴定细胞株的纯度可采用荧光染色、免疫组化等方法。
三、细胞株构建注意事项1.无菌操作：细胞株构建过程中需严格遵循无菌操作规程，防止外源性污染。
2.细胞密度控制：适当控制细胞密度，避免细胞过度拥挤或过度稀释。
3.营养代谢调控：根据细胞类型提供适当的营养代谢物质，如糖、氨基酸、脂肪酸等。
4.避免细胞接触抑制：适时更换培养皿或采用悬浮培养，以避免细胞接触抑制现象。
5.观察细胞状态：定期观察细胞形态和生长状况，及时发现并处理异常情况。
四、应用与展望随着生物科技的发展，细胞株构建在多个领域发挥着重要作用。
细胞株构建具体流程
细胞株构建具体流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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鼠源乳腺癌多药耐药细胞株的建立及耐药机制的初步研究
鼠源乳腺癌多药耐药细胞株的建立及耐药机制的初步研究目的构建鼠源性乳腺癌5-氟尿嘧啶（5-Fu）耐药细胞株，为研究乳腺癌耐药与体内免疫微环境的关系提供细胞模型。
方法通过体外以浓度递增的方法诱导小鼠乳腺癌4T1细胞对5-Fu产生耐药，MTS法确定其耐药性，平板克隆检测其增殖活性，实时定量和半定量PCR检测其中5-Fu代谢相关酶TS、MTHFR、TK、OPRT、DPD及药泵蛋白MDR1、MRP1的表达，通过流式细胞术检测其周期及CD44+CD24-干细胞亚群的比例。
结果耐药细胞4T1/5-Fu与4T1细胞相比，4T1/5-Fu细胞对5-Fu、吉西他滨和顺铂耐药的耐药指数（RI）明显升高；5-Fu合成代谢相关酶TK、OPRT表达明显降低（P < 0.05），代谢抑制性相关酶TS、MTHFR明显升高（P < 0.05），药泵蛋白MDR1、MRP1表达明显升高（P < 0.05）；流式细胞术结果显示，CD44表达明显升高，肿瘤干细胞群增多。
结论成功构建小鼠乳腺癌多药耐药细胞株，耐药发生可能与5-Fu代谢酶类、药泵蛋白表达以及干细胞比例改变相关。
[Abstract] Objective To construct 5-fluorouracil （5-Fu）resistant murine breast cancer cell line，in order to provide cell model for study of relationship between breast cancer multidrug resistant and immune microenvironment in vitro. Methods 4T1 cells were exposed in stepwise escalatingconcentration of 5-Fu to develop the resistant cell line 4T1/5-Fu. And the chemosensitivity and proliferation of 4T1/5-Fu were determined by MTS and colony forming experiments，respectively. Furthermore，real-time RT-PCR and semi quantitative PCR were used to measure expression levels of 5-Fu related genes，such as TS，MTHFR，TK，OPRT，DPD，MDR1，MRP1. In addition，cell cycle and the proportion of CD44+CD24- stem cell subsets were evaluated by flow cytometry. Results Comparing to 4T1 cells，the resistance index of 4T1/5-Fu cells to 5-Fu，GEM，cDDP was increased. The results showed that compared with 4T1 cells，the expression levels of TK and OPRT were significantly decreased （P < 0.05），while TS，MTHFR，MDR1 and MRP1 were remarkably increased in 4T1/5-Fu cells （P < 0.05）. Flow cytometry assay showed that the propotion of tumor stem cells CD44+CD24- was evidently increased in 4T1/5-Fu cells than that of 4T1 cells. Conclusion This article has successfully constructed multidrug resistant cell line 4T1/5-Fu，whose resistance may be associated with up-regulation of the 5-Fu metabolic enzymes，drug pump proteins expression and tumor stem cells percentage change.[Key words] Tumor resistance；4T1 cell；5- fluorouracil；Tumor stem cells乳腺癌是严重危害女性健康和生命的重大疾病，化学治疗是乳腺癌综合治疗中不可或缺的治疗方法，而不可避免的化疗耐受是严重影响乳腺癌治疗效果的瓶颈问题。
非小细胞肺癌奥希替尼获得性耐药细胞株的建立及耐药后化疗敏感性
非小细胞肺癌奥希替尼获得性耐药细胞株的建立及耐药后化疗敏感性杜豆;周娟;邱英;马灏川;纪佳朋;张为民【摘要】Objective Establishment of an osimertinib-resistant PC-9/ZDOR cell line of human non-small cell lung cancer (NSCLC) , and exploration of its drug resistance mechanisms and the sensitivity of themotherapeutic drugs. Methods An osimertinib-resistant PC-9/ZDOR cell line was induced by increasing doses of osimertinib to gefitinib-resistant cells PC-9/ZD. Mutation analysis of EGFR genes was performed by NGS. Cell growth was measured by CCK-8 assay and the sensitivity of chemotherapy was determined via analysis of resistance index (RI).The expression of EGFR and its signal transduction protein was determined by western blot. Results (1) An osimertinib-resistant human NSCLC cell line PC-9/ZDOR was successfully established with resistance index of 44. (2) The evidence from NGS data showed the mutation and amplification of EGFR was eliminated in PC-9/ZDOR cells. (3) The data from Western blot showed that the expression of EGFR and its phosphorylated form protein such as P-AKT and P-ERK was significantly decreased in PC-9/ZDOR cells when compared with those in PC-9/ZD cells (P <0.05). (4) The sensitivity of PC-9/ZDOR cell lines to docetaxel, gemcitabine and paclitaxel was significantly higher than that of PC-9/ZD cell lines (P < 0.05) , while the sensitivity of PC-9/ZDOR cell lines to cisplatin and pemetrexed was similar to the one of PC-9/ZD cell lines (P> 0.05). Conclusions The PC-9/ZDOR cell lines is anosimertinibresistant human NSCLC cell line. Elimination of EGFR gene mutation and/or the decrease of protein expressions of EGFR, p-EGFR, p-ERK and p-AKT maybe serve as the mechanisms of acquired resistance to osimertinib. This osimertinib-resistant cell line, PC-9/ZDOR, showed a elevated level of sensitivity to taxanes and gemcitabine.%目的建立人非小细胞肺癌 (NSCLC) 奥希替尼获得性耐药细胞株PC-9/ZDOR, 探讨其耐药机制及耐药后化疗敏感性.方法体外采用逐步递增奥希替尼剂量诱导已对吉非替尼产生获得性耐药的NSCLC细胞株PC-9/ZD建立奥希替尼耐药细胞株PC-9/ZDOR;二代测序(NGS) 检测EGFR基因突变;CCK-8法检测细胞生长, 通过耐药指数 (RI) 确定化疗药物敏感性;Western blot法检测EGFR及其信号蛋白表达.结果 (1) CCK-8法测得PC-9/ZDOR的RI为44, 显示PC-9/ZDOR为奥希替尼耐药细胞. (2) NGS显示:PC-9/ZDOR的EGFR19及20外显子T790M突变消失, 也无EGFR扩增. (3) Western blot显示:与PC-9/ZD细胞相比, PC-9/ZDOR细胞株EGFR及其磷酸化蛋白表达显著减少 (P <0.05) , p-ERK和p-AKT表达水平下降 (P <0.05) . (4) PC-9/ZDOR细胞株对化疗药物多西他赛、吉西他滨、紫杉醇敏感性较PC-9/ZD细胞增加 (P <0.05) , 而对培美曲塞、顺铂敏感性较PC-9/ZD细胞无明显差别 (P> 0.05) .结论 PC-9/ZDOR为吉非替尼耐药后奥希替尼获得性耐药NSCLC细胞, EGFR基因突变消失和 (或) EGFR及其磷酸化蛋白表达显著减少、EGFR信号传导蛋白减少可能是耐药机制之一, 耐药后细胞株对紫杉类、吉西他滨化疗药物敏感性增加.【期刊名称】《实用医学杂志》【年(卷),期】2019(035)004【总页数】5页(P516-519,524)【关键词】奥希替尼;获得性耐药;非小细胞肺癌;表皮生长因子受体;化疗敏感性【作者】杜豆;周娟;邱英;马灏川;纪佳朋;张为民【作者单位】广州中医药大学研究生院,广州 510006;广州军区广州总医院肿瘤科,广州 510010;广州军区广州总医院肿瘤科,广州 510010;广州军区广州总医院肿瘤科,广州 510010;广州军区广州总医院肿瘤科,广州 510010;广州军区广州总医院肿瘤科,广州 510010【正文语种】中文肺癌是我国发病率和病死率最高的恶性肿瘤［1］，其中非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）约占80%［2］。
乳腺癌耐药蛋白BCRP高表达细胞株的构建
０ 引 言
ＢＣＲＰ（ ｂ ｒ ｅ ａ ｓ ｔ ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｃ ｅ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ） 属 于
表明 Ｂ Ｃ Ｒ Ｐ在 干细胞 中广 泛 表达 ， 可作 为多 种 肿 瘤 干 细胞 的标记 物 喝 ｊ 。 本文采用病 毒 侵染 的方 法 拟构 建 Ｂ Ｃ Ｉ 高表 达
的稳 定 细 胞 株 ， 并 利 用 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｍ－ ｂ ｌ ｏ ｔ和半 定 量 Ｒ Ｔ ＿ Ｐ Ｃ Ｒ方法分别从 蛋 白质水平 以及基 因水平 进行验证 。
ＡＢ Ｃ转 运 蛋 白超 家 族 Ｇ亚 族 的第二 位成 员 ， 能够 利 用 ＡＴ Ｐ水 解提 供 的能 量 将化 学 治 疗 药 物 排 出 细胞 外， 是造 成癌细胞耐药性 （ ｍｕ ｌ ｔ ｉ ｄ ｒ ｕ ｇ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｃ ｅ ， ＭＤＲ ） 的主要原 因Ｅ １ ３ 。
ｍｉ ｃ ｓ 公司； ＤＮＡ 限 制性 内切 酶 Ｎｈ ｅ Ｉ 和Ｅ ｃ ｏ Ｒ Ｉ 购 自 Ｔａ ｋ ａ ｒ ａ 公司 ； 反 转 录试剂 盒购 自上 海莱 枫生 物科
的乳 腺 癌 细 胞 株 ＭＣ Ｆ － ７ ／ Ａｄ ｒ ＶＰ ＿ ３ 中。 随后 ， Ｍｉ ｙ —
ａ ｋ ｅ ｋ 、 Ａｌ ｌ ｉ ｋ ｍｅ ｔ ｓ Ｒ等 相 继 从 米 托 蒽 醌 抗 性 的直 肠 癌 细胞 株 （ 名 为 ＭＸＲ） Ｅ ］ 和人类胎盘组 织 （ 命 名 为
一
要 ：Ｂ Ｃ Ｒ Ｐ属 于 ＡＢ Ｃ转运蛋 白超 家族 Ｇ亚族的 第二位成 员 ， 是 导致 临床 乳腺癌 治疗 失败 的最 主要 原 因之
。
通过构建 ｐ Ｌ Ｊ Ｍ１ — ６ ｃ 重组 质粒 ， 利用病毒侵 染的 方法 ， 将 重组质粒转 染至乳腺 癌细胞株 ＭＣ Ｆ － ７中， 通过嘌呤
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稳定/耐药细胞株构建
一、 服务介绍
稳定表达细胞株（稳转细胞株）指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达。稳
转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上，使细胞长期稳定表达该基因。本公司
可提供普通脂质体转染后单克隆法筛选,以及病毒感染后筛选稳定株和耐药株
二、 技术原理
稳定表达细胞株（稳转细胞株）指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表
达。稳转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上，使细胞长期稳定表达该基
因。用转染质粒或病毒侵染的方法将构建好的含靶基因的载体导入细胞，根据不同的
基因载体中所含的抗性标志选用相应的药物进行筛选混合阳性克隆。在阳性混合克隆
的基础上，得到单细胞长出的阳性单克隆，继而得到稳定转染细胞株。常用的真核表
达载体的抗性标志物有嘌呤霉素（puromycin）、潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）
三、 操作流程
1、 载体构建：将外源基因构建到合适的载体上，如需病毒转染，则包装病毒。
2、 筛选浓度测定：以 14 天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度。
3、 细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和
细胞形状而定
4、 细胞转染：用构建好的载体（或包装好的病毒）转染目的细胞。
5、 抗生素筛选。
6、 鉴定筛选结果
四、客户提供
1. 外源基因及相关基础数据；
2. 生长状态良好的靶细胞系,特殊细胞需提供培养基
3. 与该技术相关其它信息
五、实验结果提供形式
1、 构建完成的稳定/耐药细胞株以及对照细胞株
2、 稳转/耐药细胞株标准实验报告及相关的外源基因表达分析结果
3、 实验流程及报告电子版本一份
六、实验服务周期
约5-8周左右，具体时间根据细胞生长,药物诱导情况而定。
七、质量承诺及舜百优势
a. 稳 定：舜百生物保证20代以内稳定转染细胞稳定表达。
b. 迅 速：一般控制在1.5个月以内完成构建。
c. 经 济：价格实惠，性价比高。
d. 质量保证：对外源基因进行严格鉴定。