制备液相色谱技术(LC-MS)

不同：自动化程度不同，效率不同，分离复杂化 合物的能力不同。
经典制备色谱方法
优点： 设备简单，投资小，见效快。能满足一般样 品的 纯化要求。
缺点： 效率低下，收率低，对于过于复杂的化合物， 纯化效果不理想。 高效制备液相色谱
优点：效率高，收率相对较高，特别适合复杂样品、 性质接近化合物的纯化。纯化效果理想。 缺点：设备复杂昂贵，投资大，运行费用较高。
超载(overloading)：
纯度（purity)、产量（throughput） 和收益（yield）（PTY）三者的关系
浓度过载和体积过载
浓度过载
决定于流动相中的溶解度；
位于吸附等温线的“制备”区 域； 产量由选择性决定； 固定相颗粒大小影响较低。
体积过载
决定于进样体积；
位于吸附等温线的“分析”区 域； 产量由柱子的直径决定； 固定相颗粒需要小一些。
各种类型的制备液相展示
应用实例：
人参皂甙Re、Rg1的HPLC制备
结束
为了准确地触发馏分收集器的启动和停止， 必须测定后运行时间。后运行时间可以转换成 与流速无关的延迟体积。 后运行时间测定方法之一： 通过在流路内注射一种染料，当馏分收集 器针尖出现该染料时记录时间。 后运行时间＝t馏分收集器- t检测器
后运行时间测定方法之二：
在馏分收集器内装入一个检测器，该检 测器称为延迟传感器。将延迟校正物注入流 路，两个检测器都记录信号。两个检测器之 间的时间差就是后运行时间。
Time-based
用峰的时间分割，按峰收集馏分
色谱峰重叠严重，重叠面积很大，收集到的 两个馏分将明显不纯 。－－－这时应考虑使用 Time-based。
Time-based
基于峰（Peak-based）
根据色谱峰的正负斜率，触发馏分收集器， 以色谱峰正负斜率作为馏分收集器动作的指令 参数。
特点： 馏分纯度高。 馏分保留时间的不稳定不会影响到馏分的 纯度。 参数设置不方便（斜率参数需计算）；受 色谱峰峰形改变的影响较大。 样品收益低。
通常浓度过载和体积过载结合着使用。而由于 产量较高的缘故，因而更喜欢使用浓度过载。
浓度过载和体积过载色谱示意图
什么时候使用浓度过载?
什么时候使用体积过载?
一般情况下，由于需要有较大的 throughput ，所以浓度过载使用较多，但当 样品浓度过稀，又没有合适的方法浓缩时或 流动相溶解样品的能力较弱时，这时就应当 使用体积过载。
由分析型色谱如何扩展到制备型色谱？
扩展计 算
扩展计算
扩展计算举例
r1=1.5mm, r2=10.6mm, V1=0.6mL/min
V2=?
计算结果：30mL/min
扩展计算举例
?
=30ml/min
计算结果25mg
0.35mL/min流速下的色谱图
（分析型）
经扩展计算，采用不同的柱径、进样量和流速样品的色谱图
制备液相色谱又称纯化系统，是目前高效 率制备纯化合物最有力的方法，广泛应用于： 1.天然产物的分离与纯化 2.合成药物的纯化 3.合成反应中间产物或副产物的制备 4.手性药物的分离与纯化 5.药物杂质的分离制备 ... ...
重复性
选择性要求
色谱柱吸附等温线
正常载荷(loading)：
色谱柱吸附等温线
高效制备液相色谱技术
高效制备ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ相色谱的原理：
色谱分离原理无论是分析型色谱还是制备型色谱都是相同的， 那就是色谱理论。 但是在理论的遵循上，制备型有时需打折扣。 这是由于两种类型的色谱最终的目的是不同的。 分析型色谱：分离度高，灵敏度高，以含量测定为目的。 制备型色谱：要求纯度、产量和收益。
经典的制备色谱方法与高效制备液相色谱的异同 及优缺点： 经典制备色谱方法：柱色谱、薄层色 谱…… 相同：目的相同；某些方法原理也相同。
上述五种色谱状态的参数：
在分析型色谱柱上，不同进样量的色谱图
在制备型色谱柱上的色谱图
制备液相馏分收集的三种方式
1. 基于时间（Time-based） 2. 基于峰（peak-based） 3. 基于质量（Mass-based）
基于时间（Time-based）
根据馏分的保留时间及其色谱峰宽， 以时间作为馏分收集器动作的指令参数。 特点： 参数设置方便，样品收益高、损失少。 色谱保留时间的不稳定会影响到馏分 的纯度和收益。
根据校正时所用的流速，系统将自动计 算出准确的延迟体积，并保存，同时也能计 算出每个流速下的后运行时间，当流速改变 时，不需要再校正后运行时间。
扩散
扩散使峰（谱带）变宽 ，严重削弱了 色谱的分辨（分离）能力。 谱带变宽与流速成反比，与管线长度 和管线内径成正比。
三种不同管径的扩散影响
所以，制备液相色谱中更应注意缩短管路的长度，减 少不必要的死体积。
不足之处是注入的其他样品组分不能回 收。
按质量数进行馏分收集的结果
三种馏分收集方式的比较
X-Based Time Peak 馏分纯度 不高 高 馏分收益 高 不高
Mass
高
高
三种馏分收集方式如何选择？
它们与纯度、产量和收益（PTY）的关 系怎样？
结合实际需求合理选择。
高效制备液相色谱流路示意图
基于质量（Mass-based）
根据馏分的质量作为指令参数，触发馏 分收集器。 特点： 馏分纯度高、且收益高； 馏分保留时间以及色谱峰峰形改变都不会 影响到馏分的纯度； 参数设置方便； 需配备MS检测器，设备费用投入较大。
Mass-based
当使用按质量进行馏分收集时，只有当 MSD 检测到色谱峰含有目标质量数，且该目 标质量数的强度超出特定的阈值时，馏分收 集才被触发。这就确保了在每次进样中只收 集含目标化合物的馏分。大部分情况下只有 一个馏分。
Peak-based
利用正、负斜率按峰进行馏分收集。
正、负斜率和阈值可预先设置。
当色谱信号都超出预先设置的正斜率和阈值两 个参数时，将触发峰的收集信号；
当色谱信号低于阈值或低于预先设置的负斜率 时，将触发停止收集信号。 设置阈值的目的是为了消除噪声的影响。
Peak-based实例（只收集后面这一组分）
两个问题：
1、延迟体积校正 2、扩散影响
什么是延迟体积？
理想情况下，当检测器检测到组分信号 时，同一时刻，组分也被馏分收集器收集到。 实际情况下，这是做不到的，因为存在 一个延迟体积。 延迟体积：检测池到馏分收集器之间管 路的体积。
高效制备液相色谱流路示意图
延迟体积校正
后运行时间：是指分析物组分从检测池到 馏分收集器所用的时间。