小鼠骨骼肌细胞使用说明
钼对小鼠骨骼肌上皮细胞氧化损伤及细胞骨架的影响
动物营养学报２０１９，３１（１２）：５６６４⁃５６７１ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ㊀ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６⁃２６７ｘ．２０１９．１２．０３２钼对小鼠骨骼肌上皮细胞氧化损伤及细胞骨架的影响马淑浩㊀杨自军∗㊀杜伯强㊀李光照㊀张㊀才㊀汪纪仓㊀王宏伟㊀孔㊀涛（河南科技大学动物科技学院，环境与畜产品安全河南重点学科开放实验室，洛阳４７１０００）摘㊀要：本试验旨在探究钼（Ｍｏ）对小鼠骨骼肌上皮细胞氧化损伤及细胞骨架的影响㊂试验以小鼠原代骨骼肌上皮细胞为材料，利用Ｍｏ浓度分别为０（Ⅰ组）㊁０．１（Ⅱ组）㊁０．２（Ⅲ组）㊁０．４（Ⅳ组）㊁０．８ｍｍｏｌ／Ｌ（Ⅴ组）的培养基对其进行细胞培养２４ｈ㊂倒置显微镜观察细胞形态变化，四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）法测定细胞活力，比色法检测细胞抗氧化能力及氧化损伤，实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ⁃ＰＣＲ）和蛋白质免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ⁃ｂｌｏｔ）测定细胞骨架蛋白波形蛋白（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）㊁α－肌动蛋白（α⁃ａｃｔｉｎ）㊁β－肌动蛋白（β⁃ａｃｔｉｎ）的ｍＲＮＡ和蛋白表达㊂结果显示：１）Ⅰ和Ⅱ组细胞形态正常，Ⅲ㊁Ⅳ和Ⅴ组细胞间隙增大，细胞肿大，且Ⅴ组细胞出现明显畸形㊂２）与Ⅰ组相比，Ⅱ㊁Ⅲ㊁Ⅳ和Ⅴ组的小鼠骨骼肌上皮细胞活力极显著下降（Ｐ＜０．０１）㊂３）与Ⅰ组相比，Ⅱ㊁Ⅲ㊁Ⅳ和Ⅴ组小鼠骨骼肌上皮细胞的超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力均极显著下降（Ｐ＜０．０１），丙二醛含量极显著升高（Ｐ＜０．０１）㊂４）与Ⅰ组相比，Ⅱ和Ⅲ组小鼠骨骼肌上皮细胞中Ｖｉｍｅｎｔｉｎ㊁α⁃ａｃｔｉｎ和β⁃ａｃｔｉｎ的ｍＲＮＡ相对表达量显著升高（Ｐ＜０．０５），Ⅴ组显著降低（Ｐ＜０．０５）；Ⅲ㊁Ⅳ和Ⅴ组小鼠骨骼肌上皮细胞中Ｖｉｍｅｎｔｉｎ㊁α⁃ａｃｔｉｎ和β⁃ａｃｔｉｎ的蛋白相对表达量均显著降低（Ｐ＜０．０５）㊂综上所述，小鼠骨骼肌上皮细胞在经过高浓度的Ｍｏ作用后，形态发生异常，出现畸形，细胞活力下降，细胞抗氧化能力会受到抑制从而导致了氧化损伤的加剧，同时还抑制了Ｖｉｍｅｎｔｉｎ㊁α⁃ａｃｔｉｎ和β⁃ａｃｔｉｎ的ｍＲＮＡ和蛋白的表达㊂关键词：钼；骨骼肌上皮细胞；氧化损伤；细胞骨架蛋白中图分类号：Ｓ８１６．７２㊀㊀㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号：１００６⁃２６７Ｘ（２０１９）１２⁃５６６４⁃０８收稿日期：２０１９－０６－１７基金项目：国家自然科学基金项目（３１０４００８１）作者简介：马淑浩（１９９５ ），男，河南柘城人，硕士研究生，研究方向为动物营养代谢与中毒病㊂Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｑａｚｍｓｈ＠１２６．ｃｏｍ∗通信作者：杨自军，教授，硕士生导师，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｎｋｄｓｙｎｋ＠１６３．ｃｏｍ㊀㊀中国作为世界钼（Ｍｏ）矿最丰富的国家，大规模的Ｍｏ开采会对土壤及牧草造成一定的影响，并通过食物链富集作用导致动物Ｍｏ中毒，因此，研究Ｍｏ对动物的影响是十分必要的㊂Ｍｏ在动物机体内的存在形式主要是金属酶，含Ｍｏ酶的生物学功能是通过Ｍｏ原子的五价和六价之间转化传递电子来实现的㊂现有的研究显示含Ｍｏ酶都为氧化还原酶，参与并影响着机体内的核酸和蛋白质的代谢［１］㊂机体内Ｍｏ的含量处于动态平衡之中，如果打破这种平衡，则会出现机能障碍㊂细胞骨架是一种复杂且重要，并处于动态稳定的细胞成分，是细胞内蛋白质纤维聚合物构成的网状结构［２］，在维持细胞形态㊁细胞运动㊁细胞凋亡和细胞分泌等生理和病理过程中起着重要作用［３］㊂王亚垒等［４］的研究结果证实，高剂量的Ｍｏ会引起骨皮质变薄㊁骨小梁变稀疏㊁骨密度降低，从而导致骨骼扭转及冲击韧性的下降㊂有相关研究表明，小鼠砷元素中毒会导致其骨骼肌的细胞骨架损伤［５］，低浓度的砷可致肌纤维排列紊乱，高浓度的砷则可明显引起肌原纤维的凝聚㊁漂移㊁撕裂状１２期马淑浩等：钼对小鼠骨骼肌上皮细胞氧化损伤及细胞骨架的影响况，重者呈现出锯齿状结构［６］㊂生产中发现过量的Ｍｏ可导致动物运动能力减退，但未见有Ｍｏ对骨骼肌细胞骨架影响的相关研究，作用机理不明确，因此，本试验以小鼠原代骨骼肌上皮细胞为材料进行细胞培养，在培养基中添加不同浓度的Ｍｏ，通过显微镜观察细胞形态以及检测细胞活力㊁相关氧化抗氧化指标㊁细胞骨架相关ｍＲＮＡ和蛋白表达的情况，探讨Ｍｏ对小鼠骨骼肌上皮细胞氧化损伤及细胞骨架的影响，为今后更加深入的探究Ｍｏ对动物骨骼肌毒性作用提供可靠的试验依据㊂１㊀材料与方法１．１㊀试验动物㊀㊀无特定病原体（ＳＰＦ）级ＢＡＬＢ／ｃ雄性小鼠，５日龄，郑州大学实验动物中心提供㊂１．２㊀主要试剂及仪器㊀㊀主要试剂：ＤＭＥＤ培养基和胎牛血清购自上海拜力生物科技有限公司㊂超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）㊁过氧化氢酶（ＣＡＴ）㊁乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）活性和丙二醛（ＭＤＡ）含量以及总抗氧化能力（Ｔ⁃ＡＯＣ）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所㊂动物组织／细胞ＲＮＡ提取试剂盒㊁ＨｉＦｉＳｃｒｉｐｔｃＤＮＡ第一链合成试剂盒及ＵｌｔｒａＳＹＢＲＭｉｘｔｕｒｅ均购于宝瑞医疗科技（北京）有限公司㊂四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）细胞活力检测试剂盒㊁放射免疫沉淀（ＲＩＰＡ）法裂解液㊁二奎啉甲酸（ＢＡＣ）蛋白定量试剂盒㊁超敏化学发光试剂（ＥＣＬ）显色液㊁兔抗鼠α－肌动蛋白（α⁃ａｃｔｉｎ）㊁β－肌动蛋白（β⁃ａｃｔｉｎ）㊁波形蛋白（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）一抗和羊抗兔免疫球蛋白Ｇ（ＩｇＧ）二抗为武汉博士德生物工程有限公司产品㊂钼酸钠（Ｎａ２ＭｏＯ４）购自天津市化学试剂四厂㊂㊀㊀主要仪器：普通倒置光学显微镜［ＣＫＸ３１，奥林巴斯（中国）有限公司］㊁酶标仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］㊁分光光度计（Ｕｖｍｉｎｉ－１２４０，日本岛津公司）㊁实时荧光定量ＰＣＲ仪（ＦＡＳＴ，ＡＢＩ７５００，上海普迪生物技术有限公司）㊁十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ）电泳槽及槽式转印系统［伯乐生命医学产品（上海）有限公司］㊂１．３㊀分离培养小鼠原代骨骼肌上皮细胞㊀㊀将小鼠脱臼处死，浸泡于酒精中１ｍｉｎ杀菌㊂无菌条件下，剪下四肢并切除爪子，将四肢置入磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）中清洗，剔除脂肪并剥离骨骼㊂用眼科剪将肌肉组织剪成１ｍｍ３左右的碎块，移到２５ｃｍ２细胞培养瓶中，排放均匀㊂加入含１８％胎牛血清的ＤＭＥＭ细胞培养液，将培养瓶翻转并放入３７ħ㊁５％ＣＯ２的细胞培养箱中进行细胞贴壁预处理，２ｈ后翻转培养瓶正常培养㊂２４ｈ后弃去培养基，ＰＢＳ冲洗后加入ＤＭＥＭ细胞培养液㊂继续培养２４ｈ，待骨骼肌细胞伸展并均匀贴于瓶壁后，将细胞消化㊁收集并调整细胞密度为１ˑ１０６个／ｍＬ，将细胞分装至２４孔细胞培养板中，每孔体积为５００μＬ㊂将细胞培养板置于ＣＯ２培养箱中培养２４ｈ㊂待细胞完全贴壁变形后，弃培养液，ＰＢＳ冲洗３次［７］㊂向各孔添加浓度分别为０（Ⅰ组）㊁０．１（Ⅱ组）㊁０．２（Ⅲ组）㊁０．４（Ⅳ组）㊁０．８ｍｍｏｌ／Ｌ（Ⅴ组）的含Ｍｏ无血清培养基培养２４ｈ，收集细胞用于后续试验㊂１．４㊀细胞活力的检测㊀㊀将培养的小鼠骨骼肌上皮细胞添加至９６孔板中，调整每孔细胞数量为２０００个㊂利用ＭＴＴ法，每孔内添加１０μＬＭＴＴ，３７ħ条件下孵育４ｈ后弃去培养液，加入１００μＬ的Ｆｏｒｍａｎｚａｎ溶液并在室温下暗室中静置３０ｍｉｎ显色㊂将酶标仪的波长设定为５７０ｎｍ，测定各组的吸光度值，计算各组细胞的增殖率以反映其细胞活力㊂１．５㊀抗氧化能力及氧化损伤的检测㊀㊀收集细胞培养基中的培养液，轻轻刮取出小鼠骨骼肌上皮细胞，转移到离心管中，加入ＰＢＳ，以８００ｒ／ｍｉｎ的速度离心５ｍｉｎ，通过超声波裂解细胞１ｍｉｎ，随后收集细胞裂解液上清，通过比色法检测细胞裂解液中ＳＯＤ㊁ＣＡＴ活性和ＭＤＡ含量以及Ｔ⁃ＡＯＣ，并测定细胞培养液中的ＬＤＨ活性㊂１．６㊀ｃＤＮＡ合成和引物序列的设计㊀㊀依照ＲＮＡ提取试剂盒说明书的具体步骤提取细胞总ＲＮＡ㊂使用ＨｉＦｉＳｃｒｉｐｔｃＤＮＡ合成试剂盒对已提取的总ＲＮＡ进行操作，合成ｃＤＮＡ㊂根据ＧｅｎＢａｎｋ中小鼠Ｖｉｍｅｎｔｉｎ㊁α⁃ａｃｔｉｎ㊁β⁃ａｃｔｉｎ和甘油醛－３－磷酸脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）的ｍＲＮＡ序列，利用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０软件设计实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ⁃ＰＣＲ）引物，并使用Ｂｌａｓｔ⁃Ｐｒｉｍｅｒ验证其特异性，ｑＲＴ⁃ＰＣＲ试验中有关基因的引物序列见表１㊂５６６５㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３１卷表１㊀ｑＲＴ⁃ＰＣＲ试验中有关基因的引物序列Ｔａｂｌｅ１㊀ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｉｎｑＲＴ⁃ＰＣＲｔｅｓｔ引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅｓ引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ引物编号Ｐｒｉｍｅｒｎｕｍｂｅｒ引物长度Ｐｒｉｍｅｒｌｅｎｇｔｈ／ｂｐα－肌动蛋白α⁃ａｃｔｉｎＦ：５ᶄ－ＧＣＣＧＡＧＣＧＴＧＡＧＡＴＴＧＴＣＣ－３ᶄＲ：５ᶄ－ＣＣＧＴＣＡＧＧＣＡＧＴＴＣＧＴＡＧＣ－３ᶄＮＭ＿００７３９２．３１２５β－肌动蛋白β⁃ａｃｔｉｎＦ：５ᶄ－ＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＣＴＣＴ－３ᶄＲ：５ᶄ－ＧＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣ－３ᶄＮＭ＿００７３９３．３２２０波形蛋白ＶｉｍｅｎｔｉｎＦ：５ᶄ－ＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＧＧＧＡＣＡＡ－３ᶄＲ：５ᶄ－ＣＡＧＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＡＧＧＴ－３ᶄＮＭ＿０１１７０１．４２９４甘油醛－３－磷酸脱氢酶ＧＡＰＤＨＦ：５ᶄ－ＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡ－３ᶄＲ：５ᶄ－ＣＴＴＣＴＧＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧＧ－３ᶄＮＭ＿００１２８９７２６．１３８８１．７㊀ｑＲＴ⁃ＰＣＲ检测相关细胞骨架蛋白ｍＲＮＡ的表达㊀㊀利用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ染色法，将荧光定量试剂ＰｒｉｍｉｘＥｘＴａｑ应用于ＡＢＩＰＲＩＳＭ７５００ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅＰＣＲ系统，测定小鼠骨骼肌上皮细胞中骨架蛋白相关基因α⁃ａｃｔｉｎ㊁β⁃ａｃｔｉｎ和Ｖｉｍｅｎｔｉｎ的ｍＲＮＡ表达情况㊂运用２－әәＣｔ法，计算每个基因的ｍＲＮＡ相对表达量，并以ＧＡＰＤＨ作为内参基因进行校正㊂１．８㊀蛋白质免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ⁃ｂｌｏｔ）检测相关细胞骨架蛋白的表达㊀㊀严格按照ＰＩＰＡ裂解液说明进行试验操作，将细胞裂解并提取蛋白质，ＢＣＡ法测定蛋白浓度后调至同一浓度，按１ʒ５的比例加入６ˑＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ上样缓冲液中，煮沸１０ｍｉｎ，离心，－８０ħ下冻存㊂取样进行ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ凝胶电泳，转移至聚偏二氟乙烯（ＰＶＤＦ）膜上；含５％脱脂奶粉的ＴＢＳＴ缓冲液封闭２ｈ，加一抗（α⁃ａｃｔｉｎ㊁β⁃ａｃｔｉｎ和ＧＡＰＤＨ按１ʒ２０００稀释，Ｖｉｍｅｎｔｉｎ按１ʒ２５００稀释）４ħ孵育过夜，ＴＢＳＴ缓冲液洗涤５次，５ｍｉｎ／次，加入二抗（按１ʒ２０００稀释）室温孵育２ｈ，ＴＢＳＴ缓冲液洗涤５次，５ｍｉｎ／次㊂逐滴加入超敏ＥＣＬ显影液，孵育２ｍｉｎ后，用胶片在暗室中曝光显影㊂１．９㊀统计分析㊀㊀首先使用Ｅｘｃｅｌ２０１０处理试验所得数据，然后使用统计软件ＳＰＳＳ２２．０对数据进行单因素方差分析（ｏｎｅ⁃ｗａｙＡＮＯＶＡ），统计结果表示为平均值ʃ标准差，并使用Ｄｕｎｃａｎ氏检验法进行各组间多重比较㊂Ｐ＜０．０５表示差异显著，Ｐ＜０．０１表示差异极显著，Ｐ＞０．０５则表示差异不显著㊂２㊀结㊀果２．１㊀Ｍｏ对小鼠骨骼肌上皮细胞形态的影响㊀㊀如图１所示，正常状态下（Ⅰ组）的骨骼肌上皮细胞成纤维样梭形，细胞细长且细胞间排列致密，生长方向统一，移植的组织块一旦贴壁正常生长后，细胞延展速度会加快，还会在短时间内汇聚成单层细胞㊂Ⅱ组与Ⅰ组的细胞形态差距并不大，均呈纤维状梭形，且生长致密，具有一定的方向性㊂Ⅲ组与Ⅳ组细胞形态相似，细胞间隙明显有增大趋势，且细胞呈多足状，多数细胞生长明显凸起，轮廓明显，形态逐渐肿大㊂Ⅴ组细胞则明显出现较大幅的间隙，细胞形态明显肿大，且细胞呈无方向性的生长，多数细胞明显畸形，相同视野内细胞个数远少于Ⅰ和Ⅱ组㊂２．２㊀Ｍｏ对小鼠骨骼肌上皮细胞活力的影响㊀㊀如表２所示，用不同浓度梯度的Ｍｏ培养２４ｈ后，Ⅰ Ⅴ组小鼠骨骼肌上皮细胞的增殖率分别为１００．０％㊁９０．９％㊁９２．５％㊁７８．５％和６０．５％㊂随着培养基中Ｍｏ浓度的增加，小鼠骨骼肌上皮细胞的增殖率趋于下降，Ⅱ Ⅴ组极显著低于Ⅰ组（Ｐ＜０．０１），其中Ⅱ和Ⅲ组之间差异不显著（Ｐ＞０．０５）㊂２．３㊀Ｍｏ对小鼠骨骼肌上皮细胞ＳＯＤ㊁ＣＡＴ㊁ＬＤＨ活性㊁ＭＤＡ含量及Ｔ⁃ＡＯＣ的影响㊀㊀如表２所示，用不同浓度梯度的Ｍｏ培养２４ｈ后，与Ⅰ组相比，随着培养基中Ｍｏ浓度的增加，Ⅱ Ⅴ组小鼠骨骼肌上皮细胞的ＳＯＤ活性极显著下降（Ｐ＜０．０１），其中Ⅱ㊁Ⅲ和Ⅳ组之间差异不显著（Ｐ＞０．０５）㊂与Ⅰ组相比，随着培养基中Ｍｏ浓度的增加，Ⅱ Ⅴ组小鼠骨骼肌上皮细胞的ＣＡＴ活性先升高后降低，Ⅱ组差异不显著（Ｐ＞０．０５），Ⅲ组６６６５１２期马淑浩等：钼对小鼠骨骼肌上皮细胞氧化损伤及细胞骨架的影响极显著升高（Ｐ＜０．０１），而Ⅳ和Ⅴ组极显著下降（Ｐ＜０．０１）㊂与Ⅰ组相比，随着培养基中Ｍｏ浓度的增加，Ⅱ Ⅴ组小鼠骨骼肌上皮细胞的Ｔ⁃ＡＯＣ均极显著下降（Ｐ＜０．０１），其中Ⅱ㊁Ⅲ和Ⅳ组之间差异不显著（Ｐ＞０．０５）㊂与Ⅰ组相比，随着培养基中Ｍｏ浓度的增加，Ⅱ Ⅴ组小鼠骨骼肌上皮细胞的ＭＤＡ含量极显著升高（Ｐ＜０．０１），其中Ⅱ㊁Ⅲ和Ⅳ组之间差异不显著（Ｐ＞０．０５）㊂与Ⅰ组相比，Ⅱ和Ⅲ组小鼠骨骼肌上皮细胞的ＬＤＨ活性无显著差异（Ｐ＞０．０５），Ⅳ和Ⅴ组极显著升高（Ｐ＜０．０１）㊂图１㊀Ｍｏ对小鼠骨骼肌上皮细胞形态的影响Ｆｉｇ．１㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＭｏｏｎｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｏｆｍｏｕｓｅ表２㊀Ｍｏ对小鼠骨骼肌上皮细胞活力的影响Ｔａｂｌｅ２㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＭｏｏｎｖｉａｂｉｌｉｔｙｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｏｆｍｏｕｓｅ％组别Ｇｒｏｕｐｓ增殖率ＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅⅠ１００．０ʃ０．０ＡａⅡ９０．９ʃ１．０ＢｂⅢ９２．５ʃ４．０ＢｂⅣ７８．５ʃ８．０ＣｃⅤ６０．５ʃ４．０Ｄｄ㊀㊀同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５），不同大写字母表示差异极显著（Ｐ＜０．０１），相同或无字母表示差异不显著（Ｐ＞０．０５）㊂下表同㊂㊀㊀Ｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎ，ｖａｌｕｅｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｌｅｔｔｅｒｓｕ⁃ｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５），ａｎｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０１），ｗｈｉｌｅｗｉｔｈｔｈｅｓａｍｅｏｒｎｏｌｅｔｔｅｒｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓｍｅａｎｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＞０．０５）．Ｔｈｅｓａｍｅａｓｂｅｌｏｗ．２．４㊀Ｍｏ对小鼠骨骼肌上皮细胞中α⁃ａｃｔｉｎ㊁β⁃ａｃ⁃ｔｉｎ㊁ＶｉｍｅｎｔｉｎｍＲＮＡ表达的影响㊀㊀如图２所示，与Ⅰ组相比，随着培养基中Ｍｏ浓度的增加，Ⅱ Ⅴ组小鼠骨骼肌上皮细胞中α⁃ａｃｔｉｎ㊁β⁃ａｃｔｉｎ和Ｖｉｍｅｎｔｉｎ的ｍＲＮＡ相对表达量呈现出先上升后下降的变化趋势㊂Ⅱ和Ⅲ组小鼠骨骼肌上皮细胞中α⁃ａｃｔｉｎ㊁β⁃ａｃｔｉｎ和Ｖｉｍｅｎｔｉｎ的ｍＲＮＡ相对表达量均显著高于Ⅰ组（Ｐ＜０．０５），Ⅳ组与Ⅰ组差异不显著（Ｐ＞０．０５），而Ⅴ组显著低于Ⅰ组（Ｐ＜０．０５）㊂２．５㊀Ｍｏ对小鼠骨骼肌上皮细胞中α⁃ａｃｔｉｎ㊁β⁃ａｃ⁃ｔｉｎ和Ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白表达的影响㊀㊀如图３所示，与Ⅰ组相比，随着培养基中Ｍｏ浓度的增加，Ⅱ组小鼠骨骼肌上皮细胞中α⁃ａｃｔｉｎ㊁β⁃ａｃｔｉｎ和Ｖｉｍｅｎｔｉｎ的蛋白相对表达量差异不显著（Ｐ＞０．０５），而Ⅲ㊁Ⅳ和Ⅴ组均显著低于Ⅰ组（Ｐ＜０．０５）㊂３㊀讨㊀论３．１㊀Ｍｏ对小鼠骨骼肌上皮细胞形态的影响㊀㊀骨骼肌细胞作为影响机体运动的重要组成部分，起到缓冲外力㊁保护机体和维持协调运动的物理防护功能，并且还在血糖的利用方面起到重要的作用㊂电子显微镜观察显示，高浓度的Ｍｏ对大鼠骨骼肌上皮细胞的损伤主要集中在膜结构的破坏，从而使骨骼肌上皮细胞的细胞核膜和内质网７６６５㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３１卷扩张，线粒体收缩，基质内的电子密度增加或者空泡化［８］㊂本试验通过体外培养法，利用倒置显微镜对各组小鼠骨骼肌上皮细胞的形态观察发现，Ⅱ组与Ⅰ组差异不大，均呈纤维状梭形，且生长致密㊁具有一定的方向性，而当Ｍｏ浓度高于０．２ｍｍｏｌ／Ｌ时会引起细胞生长的延缓，同时细胞间隙明增大，形态轮廓突显且逐渐肿大，随着Ｍｏ浓度的升高，细胞逐渐呈现出无方向性的生长，并且形态逐渐变差，出现畸形㊂这说明在高浓度Ｍｏ的作用下，骨骼肌上皮细胞直接受到Ｍｏ刺激，引起直观的形态学变化，这与早期的动物体试验结果相似，均是在高浓度Ｍｏ组动物的骨骼肌组织最快出现形态学病理变化，同时会伴随着细胞凋亡㊁畸形并且严重空泡化㊂表３㊀Ｍｏ对小鼠骨骼肌上皮细胞ＳＯＤ㊁ＣＡＴ㊁ＬＤＨ活性㊁ＭＤＡ含量及Ｔ⁃ＡＯＣ的影响Ｔａｂｌｅ３㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＭｏｏｎＳＯＤ，ＣＡＴ，ＬＤＨａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，ＭＤＡｃｏｎｔｅｎｔａｎｄＴ⁃ＡＯＣｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｏｆｍｏｕｓｅ（ｎ＝５）组别Ｇｒｏｕｐｓ超氧化物歧化酶ＳＯＤ／（Ｕ／ｍｇ）过氧化氢酶ＣＡＴ／（Ｕ／ｍｇ）总抗氧化能力Ｔ⁃ＡＯＣ／（Ｕ／ｍｇ）丙二醛ＭＤＡ／（ｎｍｏｌ／ｍｇ）乳酸脱氢酶ＬＤＨ／（Ｕ／Ｌ）Ⅰ７８．４５ʃ２．３５Ａａ３０．６７ʃ２．５８Ａａ１２．６４ʃ２．５０Ａａ０．７３ʃ０．０７Ａａ３４６．３４ʃ７．４９ＡａⅡ４８．５８ʃ１．０５Ｂｂ３６．２６ʃ３．６２Ａａ５．９２ʃ１．４５Ｂｂ１．３５ʃ０．２１Ｂｂ３７２．３５ʃ９．７１ＡａⅢ５０．８２ʃ２．９６Ｂｂ４８．４５ʃ２．１５Ｂｂ５．４０ʃ１．１４Ｂｂ１．３９ʃ０．２２Ｂｂ３６６．６６ʃ９．４９ＡａⅣ５６．６０ʃ３．０７Ｂｂ６．５２ʃ１．８２Ｃｃ５．１９ʃ１．０９Ｂｂ１．４８ʃ０．０６Ｂｂ４３８．１１ʃ４．１２ＢｂⅤ４４．１５ʃ５．８１Ｃｃ７．４２ʃ１．０７Ｃｃ２．３８ʃ０．７５Ｃｃ１．８８ʃ０．１２Ｃｃ４１８．０８ʃ６．６５Ｃｃ㊀㊀∗表示与对照组相比差异显著（Ｐ＜０．０５）㊂下图同㊂㊀㊀∗ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｓａｍｅａｓｂｅｌｏｗ．图２㊀Ｍｏ对小鼠骨骼肌上皮细胞中α⁃ａｃｔｉｎ㊁β⁃ａｃｔｉｎ和ＶｉｍｅｎｔｉｎｍＲＮＡ表达的影响Ｆｉｇ．２㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＭｏｏｎｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆα⁃ａｃｔｉｎ，β⁃ａｃｔｉｎａｎｄＶｉｍｅｎｔｉｎｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｏｆｍｏｕｓｅ３．２㊀Ｍｏ对小鼠骨骼肌上皮细胞活力的影响㊀㊀本试验通过不同浓度Ｍｏ对小鼠原代骨骼肌上皮细胞进行处理，细胞培养２４ｈ后，利用ＭＴＴ法检测细胞增殖率，反映其细胞活力，从而可以从细胞整体的生命状况层面体现出Ｍｏ对于小鼠骨骼肌上皮细胞的影响作用㊂从试验结果可以看出，小鼠骨骼肌上皮细胞的增殖率随着Ｍｏ浓度的增加而降低，这证明了高浓度的Ｍｏ对小鼠骨骼肌上皮细胞的增殖率具有显著的抑制作用㊂然而从其他相关的文献资料中我们了解到，对体外培养的细胞经适量的Ｍｏ处理后，可以明显抑制一些病毒微生物的繁殖能力，并且能够增强细胞的抵抗能力［９］，这与本试验高浓度的Ｍｏ可以抑制骨骼肌上皮细胞的增殖率，同时影响细胞活力的结果有所差别，产生这种差异可能与本试验所设计的Ｍｏ浓度㊁处理时间或者细胞种类的不同有关㊂３．３㊀Ｍｏ对小鼠骨骼肌上皮细胞抗氧化能力的影响㊀㊀本试验以体外培养小鼠原代骨骼肌上皮细胞为材料，测定了细胞中ＳＯＤ㊁ＣＡＴ㊁ＬＤＨ活性和ＭＤＡ含量及Ｔ⁃ＡＯＣ，研究检测了不同浓度Ｍｏ处理后，细胞的抗氧化能力和氧化损伤状况㊂ＳＯＤ可以有效去除生物体内代谢产生的有害超氧自由基，及时修复受损细胞，对减缓机体衰老起着很重要的调控作用［１０］，ＳＯＤ的生理活性可以作为一个指标来反映生物机体对氧化自由基等有害物质的清除能力［１１］；广泛存在于细胞过氧化物酶中的ＣＡＴ是过氧化物酶体的标志性酶，大约占过氧化物酶体酶总量的４０％，其主要的功能是将代谢生成的过氧化氢分解为水（Ｈ２Ｏ）和氧气（Ｏ２），中断８６６５１２期马淑浩等：钼对小鼠骨骼肌上皮细胞氧化损伤及细胞骨架的影响有害物质氢氧根离子的合成［１２］，起到机体抗氧化的功能；Ｔ⁃ＡＯＣ反映了生物体总的抗氧化能力㊂自由基作用于脂质过氧化，最终的氧化产物是ＭＤＡ，它可以引起生命大分子如蛋白质㊁核酸等的联结聚合，因此ＭＤＡ具有细胞毒性，通过检测ＭＤＡ的含量可以反映生物体组织细胞所受的氧化损伤程度［１３］㊂ＬＤＨ是一种糖酵解酶，在机体的正常状态下细胞内的ＬＤＨ活性比细胞外高出１０００倍之多，而当细胞内㊁外环境发生改变时，细胞中的酶合成量㊁细胞的结构㊁膜通透性等发生变化，可导致细胞内的ＬＤＨ释放到血液中，从而使血液中的ＬＤＨ活性升高［１４－１５］㊂㊀㊀Ａ：α⁃ａｃｔｉｎ㊁β⁃ａｃｔｉｎ㊁Ｖｉｍｅｎｔｉｎ和ＧＡＰＤＨ的ＥＣＬ显色条带；Ｂ：相对灰度值分析㊂㊀㊀Ａ：ＥＣＬｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｂａｎｄｓｏｆＶｉｍｅｎｔｉｎ，α⁃ａｃｔｉｎ，β⁃ａｃ⁃ｔｉｎａｎｄＧＡＰＤＨ；Ｂ：ｒｅｌａｔｉｖｅｇｒａｙｖａｌｕｅａｎａｌｙｓｉｓ．图３㊀Ｍｏ对小鼠骨骼肌上皮细胞中α⁃ａｃｔｉｎ㊁β⁃ａｃｔｉｎ和Ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白表达的影响Ｆｉｇ．３㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＭｏｏｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆα⁃ａｃｔｉｎ，β⁃ａｃｔｉｎａｎｄＶｉｍｅｎｔｉｎｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｏｆｍｏｕｓｅ㊀㊀以往的相关研究表明，外源有害物质会抑制生物体组织细胞内的抗氧化酶活性或大量消耗抗氧化物质，最终可以导致机体的抗氧化功能下降［１６］，如铜（Ｃｕ）和砷（Ａｓ）联合可以诱导鸡骨骼肌的氧化损伤［１７］㊂本试验的研究结果显示，高浓度的Ｍｏ导致了小鼠骨骼肌上皮细胞中ＳＯＤ㊁ＣＡＴ活性和Ｔ⁃ＡＯＣ的降低，以及上皮细胞中ＭＤＡ含量和ＬＤＨ活性的升高㊂由此可知，小鼠骨骼肌上皮细胞经一定浓度的Ｍｏ处理后，细胞清除氧化自由基等有害物质的抗氧化能力会受到抑制，并且导致细胞的氧化损伤加剧㊂３．４㊀Ｍｏ对小鼠骨骼肌上皮细胞细胞中α⁃ａｃｔｉｎ㊁β⁃ａｃｔｉｎ和Ｖｉｍｅｎｔｉｎ的ｍＲＮＡ和蛋白表达的影响㊀㊀细胞骨架分布在真核细胞上，参与细胞中遗传物质的转运和表达过程㊂对细胞骨架的研究显示，细胞骨架的功能障碍已经成为许多疾病的标志性病理过程［１８］㊂α⁃ａｃｔｉｎ是一种关键的细胞骨架蛋白，具有稳定细胞黏附㊁维持细胞形态㊁调节细胞运动的生物学功能㊂Ｊｉａｎｇ等［１９］研究发现，心衰患者心肌细胞中α⁃ａｃｔｉｎ的ｍＲＮＡ相对表达量相较于未患病人出现明显的下调，并证实此结果与心肌细胞的凋亡有关，由此可以看出α⁃ａｃｔｉｎ在肌细胞的形成㊁发育和成熟过程中起着十分重要的作用㊂β⁃ａｃｔｉｎ是细胞骨架的主要成分，参与淋巴细胞的迁移㊁浸润和凋亡等过程［２０］；其编码序列非常的保守，但非编码序列却有着比较大的差异［２０－２１］㊂相关的研究显示，高浓度的硒可以抑制软骨细胞β⁃ａｃｔｉｎ的ｍＲＮＡ及蛋白的表达［２１］㊂另有研究发现，喹乙醇可以通过干扰肌动蛋白分支蛋白复合物和肌动蛋白结合蛋白的表达来破坏小鼠睾丸支持细胞的细胞骨架结构［２２］㊂Ｖｉｍｅｎｔｉｎ是细胞骨架蛋白中重要的中间丝蛋白，它能够结合细胞膜和核膜之间的许多膜结构，在确保细胞流动性的同时，在稳定细胞形态和传输物质的过程中起着重要的作用［２３－２４］㊂对内毒素血症大鼠心肌细胞骨架蛋白测定发现，随着疾病的发展，肌动蛋白的含量急剧下降，且呈不规则的排列状态㊂除具体病症能引起细胞骨架蛋白的改变外，机械性损伤也会对细胞骨架造成不可逆式的损害，例如随负重的加强，大鼠骨骼肌组织中α⁃ａｃｔｉｎ的ｍＲＮＡ表达呈下降趋势［２５］㊂本试验结果表明，当细胞培养基中Ｍｏ浓度高于０．２ｍｍｏｌ／Ｌ时，细胞骨架相关蛋白α⁃ａｃｔｉｎ㊁β⁃ａｃｔｉｎ和Ｖｉｍｅｎｔｉｎ的蛋白合成均受到抑制，可见过量的Ｍｏ破坏了其用于维持细胞膜力学稳定和功能的细胞骨架的完整性，从而导致细胞内环境稳态的失衡，细胞功能受损㊂９６６５㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３１卷４㊀结㊀论㊀㊀高浓度的Ｍｏ可导致小鼠骨骼肌上皮细胞形态发生异常，出现畸形，细胞活力下降；抑制小鼠骨骼肌上皮细胞的抗氧化能力，并产生脂质过氧化损伤；同时，还可下调小鼠骨骼肌上皮细胞的细胞骨架蛋白α⁃ａｃｔｉｎ，β⁃ａｃｔｉｎ和Ｖｉｍｅｎｔｉｎ的ｍＲＮＡ表达，抑制蛋白合成㊂参考文献：［１］㊀ＭＥＮＤＥＬＲＲ．Ｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙｏｆｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ［Ｊ］．Ｂｉｏ⁃ｆａｃｔｏｒｓ，２００９，３５（５）：４２９－４３４．［２］㊀ＧＩＲＩＤＨＡＲＡＮＳＳＰ，ＣＡＰＬＡＮＳ．ＭＩＣＡＬ⁃ｆａｍｉｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｃｏｍｐｌｅｘｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｏｆｔｈｅａｃｔｉｎｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ［Ｊ］．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ＆ＲｅｄｏｘＳｉｇｎａｌｌｉｎｇ，２０１４，２０（１３）：２０５９－２０７３．［３］㊀ＳＴＯＵＲＮＡＲＡＳＣ，ＧＲＡＶＡＮＩＳＡ，ＭＡＲＧＩＯＲＩＳＡＮ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅａｃｔｉｎｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎｉｎｒａｐｉｄｓｔｅｒｏｉｄｈｏｒ⁃ｍｏｎｅａｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，２０１４，７１（５）：２８５－２９３．［４］㊀王亚垒，杨自军，张鹏，等．高钼对雄性绵羊骨骼Ｘ线特征及骨密度变化的影响［Ｊ］．河南农业科学，２０１３，４２（４）：１４５－１４８．［５］㊀ＡＵＮＧＫＨ，ＴＳＵＫＡＨＡＲＡＳ，ＭＥＡＫＡＷＡＦ，ｅｔａｌ．Ｒｏｌｅｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｃｈｅｍｉｃａｌｉｎｓｕｌｔｉｎｎｅｕｒｏｎａｌｃｅｌｌｄｅａｔｈａｎｄｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎｄａｍａｇｅ［Ｊ］．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ，２０１５，３８（８）：１１０９－１１１２．［６］㊀孙宝飞，王恒，康朝胜，等．慢性砷中毒对骨骼肌超微结构的影响［Ｊ］．黔南民族医专学报，２０１５，２８（３）：１６５－１６７，２３２．［７］㊀ＭＵＳＡＲÒＡ，ＣＡＲＯＳＩＯＳ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌｓｆｒｏｍｍｏｕｓｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ［Ｍ］／／ＤＩＮＡＲＤＯＰ，ＤＨＩＮＧＲＡＳ，ＳＩＮＧＬＡＤ．Ａｄｕｌｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１７．［８］㊀孙素玲，刘明明，后家蘅．钼对大鼠致畸和致突变作用的研究［Ｊ］．癌变㊃畸变㊃突变，２００７，１９（３）：２５０－２５２．［９］㊀杨平，惠起源．钼及其化合物配合物与胃癌研究进展［Ｊ］．微量元素与健康研究，２０１２，２９（１）：６５－６７．［１０］㊀ＹＥＮＨ，ＬＩＵＳＴ，ＬＩＮＹＹ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆＴＡＴ⁃ＳＯＤａｇａｉｎｓｔｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙｉｎｒａｔｓ［Ｊ］．ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１１，８９（２３／２４）：８６８－８７４．［１１］㊀ＣＡＲＩＬＬＯＮＪ，ＦＯＵＲＥＴＧ，ＦＥＩＬＬＥＴ⁃ＣＯＵＤＲＡＹＣ，ｅｔａｌ．Ｓｈｏｒｔ⁃ｔｅｒｍａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌａｓｐｅｃｔｓ，ｏｘｉｄａｔｉｖｅａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｄｉｅｔａｒｙｍｅｌｏｎｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅｉｎｒａｔｓ［Ｊ］．ＦｏｏｄａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２０１３，５５：３２３－３２８．［１２］㊀ＴＡＭＡＹＯＤ，ＭＵÑＯＺＪＦ，ＡＬＭＥＩＤＡＡＪ，ｅｔａｌ．Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓｓｐｐ．ｃａｔａｌａｓｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｒｏｌｅｉｎａｎｔｉｏｘ⁃ｉｄａｎｔｄｅｆｅｎｓｅａｇａｉｎｓｔｈｏｓｔｄｅｆｅｎｓｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．Ｆｕｎ⁃ｇａｌＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ，２０１７，１００：２２－３２．［１３］㊀ＤＲＡＧＵＮＺ，ＭＡＲＩＪＩＣᶄＶＦ，ＫＲＡＳＮＩＣᶄＩＮ，ｅｔａｌ．Ｍａ⁃ｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎｅａｎｄｇｉｌｌｓｏｆＶａｒｄａｒｃｈｕｂ（ＳｑｕａｌｉｕｓｖａｒｄａｒｅｎｓｉｓＫａｒａｍａｎ）ａｓｉｎｄｉｃａｔｏｒｏｆｌｉｐｉｄｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉ⁃ｅｎｃｅａｎｄＰｏｌｌｕｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１７，２４（２０）：１６９１７－１６９２６．［１４］㊀梁影．血清乳酸脱氢酶检测在巨幼细胞性贫血诊断中的意义［Ｊ］．临床医学研究与实践，２０１６，１（２２）：３２－３３．［１５］㊀ＳＵＮＸＲ，ＳＵＮＺ，ＺＨＵＺ，ｅｔａｌ．Ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅａｎｄｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｖａｌｕｅｏｆｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏ⁃ｇｅｎａｓｅＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１４，９（３）：９１０６８．［１６］㊀ＳＨＩＣＨＩＲＩＭ．Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｌｉｐｉｄｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎｉｎｎｅｕｒｏ⁃ｌｏｇｉｃａｌｄｉｓｏｒｄｅｒｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１４，５４（３）：１５１－１６０．［１７］㊀ＷＡＮＧＹ，ＺＨＡＯＨＪ，ＳＨＡＯＹＺ，ｅｔａｌ．Ｃｏｐｐｅｒ（Ⅱ）ａｎｄ／ｏｒａｒｓｅｎｉｔｅ⁃ｉｎｄｕｃｅｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｃａｓ⁃ｃａｄｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｔｈｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｓｏｆｃｈｉｃｋｅｎ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ，２０１８，２０６：５９７－６０５．［１８］㊀ＫＯＲＯＢＯＶＡＦ，ＲＡＭＡＢＨＡＤＲＡＮＶ，ＨＩＧＧＳＨＮ．Ａｎａｃｔｉｎ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｓｔｅｐｉｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｆｉｓｓｉｏｎｍｅｄｉ⁃ａｔｅｄｂｙｔｈｅＥＲ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆｏｒｍｉｎＩＮＦ２［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３３９（６１１８）：４６４－４６７．［１９］㊀ＪＩＡＮＧＨＫ，ＱＩＵＧＲ，ＬＩＬＪ，ｅｔａｌ．ＲｅｄｕｃｅｄＡＣＴＣ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｉｇｈｔｐｌａｙａｒｏｌｅｉｎｔｈｅｏｎｓｅｔｏｆｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅｂｙｉｎｄｕｃｉｎｇｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．ＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎＪｏｕｒｎａｌ，２０１０，７４（１１）：２４１０－２４１８．［２０］㊀ＣＨＥＮＸＬ，ＺＨＥＮＧＪ，ＣＡＩＪＹ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｃｙｔｏｓｋｅｌｅ⁃ｔｏｎｐｒｏｔｅｉｎβ⁃ａｃｔｉｎｍａｙｍｅｄｉａｔｅＴｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｄｕｒ⁃ｉｎｇａｃｕｔｅｒｅｊｅｃｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎａｆｔｅｒｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｉｎａｒａｔｍｏｄｅｌ［Ｊ］．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＲｅ⁃ｓｅａｒｃｈ，２０１７，９（１１）：４８８８－４９０１．［２１］㊀李锦，王加丽，罗明秀，等．ＮＩＶ毒素对软骨细胞骨架蛋白的影响及硒的拮抗作用［Ｊ］．国外医学（医学地理分册），２０１３，３４（３）：１４６－１５０．［２２］㊀ＷＵＤ，ＨＵＡＮＧＣＪ，ＪＩＡＯＸＦ，ｅｔａｌ．Ｏｌａｑｕｉｎｄｏｘｄｉｓ⁃ｒｕｐｔｓｔｉｇｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎｉｎｔｅｇｒｉｔｙａｎｄｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎａｒｃｈｉｔｅｃ⁃ｔｕｒｅｉｎｍｏｕｓｅＳｅｒｔｏｌｉｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１７，８（５１）：８８６３０－８８６４４．［２３］㊀韩婧，潘燕，李学军．波形蛋白的结构㊁功能和与肿瘤０７６５１２期马淑浩等：钼对小鼠骨骼肌上皮细胞氧化损伤及细胞骨架的影响的关系［Ｊ］．医学分子生物学杂志，２０１１，８（３）：２６５－２６８．［２４］㊀ＢＡＲＲＩÈＲＥＧ，ＴＡＲＴＡＲＹＭ，ＲＩＧＡＵＤＭ．Ｍｅｔｆｏｒｍ⁃ｉｎ：ａｒｉｓｉｎｇｓｔａｒｔｏｆｉｇｈｔｔｈｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｉｎｏｎｃｏｌｏｇｙ［Ｊ］．ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＡｇｅｎｔｓＭｅｄＣｈｅｍ，２０１３，１３（２）：３３３－３４０．［２５］㊀刘丰彬，赵斌，闫万军，等．负重训练和补充大豆多肽干预大鼠骨骼肌衰老过程的实验研究［Ｊ］．天津体育学院学报，２０１０，２５（１）：３３－３７．∗Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｎｋｄｓｙｎｋ＠１６３．ｃｏｍ（责任编辑㊀武海龙）ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＭｏｌｙｂｄｅｎｕｍｏｎＯｘｉｄａｔｉｖｅＤａｍａｇｅａｎｄＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎｉｎＳｋｅｌｅｔａｌＭｕｓｃｌｅＥｐｉｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌｓｏｆＭｏｕｓｅＭＡＳｈｕｈａｏ㊀ＹＡＮＧＺｉｊｕｎ∗㊀ＤＵＢｏｑｉａｎｇ㊀ＬＩＧｕａｎｇｚｈａｏ㊀ＺＨＡＮＧＣａｉ㊀ＷＡＮＧＪｉｃａｎｇ㊀ＷＡＮＧＨｏｎｇｗｅｉ㊀ＫＯＮＧＴａｏ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｅｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｅｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＯｐｅｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＫｅｙＤｉｓｃｉｐｌｉｎｅｓｆｏｒＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎｄＡｎｉｍａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＳａｆｅｔｙ，Ｌｕｏｙａｎｇ４７１０００，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ（Ｍｏ）ｏｎｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅａｎｄｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｏｆｍｏｕｓｅ．Ｕｓｅｄｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｏｆｍｏｕｓｅａｓｍａｔｅｒｉａｌｓ，ａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ２４ｈｉｎｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈＭｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆ０（ｇｒｏｕｐⅠ），０．１（ｇｒｏｕｐⅡ），０．２（ｇｒｏｕｐⅢ），０．４（ｇｒｏｕｐⅣ），ａｎｄ０．８ｍｍｏｌ／Ｌ（ｇｒｏｕｐⅤ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｉｎｖｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｆｏｒｃｅｌｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｃｈａｎｇｅｓ，ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｔｅｔｒａｚｏｌｅ（ＭＴＴ）ｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙ，ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃａｓｓａｙｆｏｒｃｅｌｌａｎ⁃ｔｉｏｘｉｄａｎｔｃａｐａｃｉｔｙａｎｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅ，ａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅＰＣＲ（ｑＲＴ⁃ＰＣＲ）ａｎｄＷｅｓｔｅｒｎ⁃ｂｌｏｔｆｏｒＶｉ⁃ｍｅｎｔｉｎ，α⁃ａｃｔｉｎａｎｄβ⁃ａｃｔｉｎｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄａｓｆｏｌｌｏｗｓ：１）ｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｃｅｌｌｓｉｎｇｒｏｕｐｓⅠａｎｄⅡｗａｓｎｏｒｍａｌ，ｃｅｌｌｇａｐｓｉｎｇｒｏｕｐｓⅢ，ⅣａｎｄⅤｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｗｏｌ⁃ｌｅｎ，ａｎｄｃｅｌｌｓｉｎｇｒｏｕｐⅤｓｈｏｗｅｄｏｂｖｉｏｕｓｄｅｆｏｒｍｉｔｙ．２）ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｇｒｏｕｐⅠ，ｔｈｅｖｉａｂｉｌｉｔｙｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｏｆｍｏｕｓｅｉｎｇｒｏｕｐｓⅡ，Ⅲ，ⅣａｎｄⅤｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０１）．３）Ｃｏｍ⁃ｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｇｒｏｕｐⅠ，ｔｈｅｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｔｏｔａｌａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｃａｐａｃｉｔｙｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｅｐｉ⁃ｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｏｆｍｏｕｓｅｉｎｇｒｏｕｐｓⅡ，Ⅲ，ⅣａｎｄⅤｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０１），ａｎｄｔｈｅｍａｌｏｎｄｉａｌ⁃ｄｅｈｙｄｅｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０１）．４）ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｇｒｏｕｐⅠ，ｔｈｅｍＲＮＡｒｅｌａｔｉｖｅｅｘ⁃ｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＶｉｍｅｎｔｉｎ，α⁃ａｃｔｉｎａｎｄβ⁃ａｃｔｉｎｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｏｆｍｏｕｓｅｉｎｇｒｏｕｐｓⅡａｎｄⅢｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５），ａｎｄｔｈａｔｉｎｇｒｏｕｐⅤｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）；ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｒｅｌ⁃ａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＶｉｍｅｎｔｉｎ，α⁃ａｃｔｉｎａｎｄβ⁃ａｃｔｉｎｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｏｆｍｏｕｓｅｉｎｇｒｏｕｐｓⅢ，ⅣａｎｄⅤｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．Ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ａｆｔｅｒｔｈｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｏｆｍｏｕｓｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＭｏ，ｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｉｓａｂｎｏｒｍａｌａｎｄｄｅｆｏｒｍｉｔｙ，ｃｅｌｌｓｖｉａｂｉｌｉｔｙｉｓｄｅ⁃ｃｒｅａｓｅ，ｔｈｅａｎｔｉ⁃ｏｘｉｄａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｉｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄａｎｄｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅｉｓａｇｇｒａｖａｔｅｄ，ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅｉｔｃａｎａｌ⁃ｓｏｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶｉｍｅｎｔｉｎ，α⁃ａｃｔｉｎａｎｄβ⁃ａｃｔｉｎ．［ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１９，３１（１２）：５６６４⁃５６７１］Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ；ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ；ｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅ；ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌｐｒｏｔｅｉｎ１７６５。
电脉冲刺激的骨骼肌细胞条件培养基逆转内皮细胞胰岛素抵抗和功能障碍
电脉冲刺激的骨骼肌细胞条件培养基逆转内皮细胞胰岛素抵抗和功能障碍赵一贺;张畅;牛文彦【摘要】目的:探讨电脉冲刺激的C2C12肌管细胞条件培养基对内皮细胞的影响.方法:提取常氧和缺氧培养的3T3-L1脂肪细胞上清液为条件培养基CM-N和CM-H,电脉冲刺激的C2C12肌管细胞上清液为条件培养基CM-EPS,单独或按比例混合分别孵育内皮细胞16h.Western blot检测Akt、eNOS、IKK和NF-κB的磷酸化.结果:CM-H降低内皮细胞Akt和eNOS的磷酸化,并升高IKK和NF-κB的磷酸化.CM-EPS逆转此作用.结论:CM-EPS逆转CM-H造成的内皮细胞胰岛素抵抗并改善内皮功能.%Objective:To explore the effects of conditional medium from electric pulse-stimulated C2C 12 myotube on endothelial insulin resistance and dysfunction.Methods:The supernatant of normoxic and hypoxic 3T3-L1 adipocytes were collected as conditional medium CM-N and CM-H,respectively.The supernatant of pulsed electrical-stimulatedC2C12 myotube was collected as conditional medium CM-EPS.Endothelial cells were incubated with CM-N,CM-H and CM-EPS for 16hours,respectively.The phosphorylation of Akt,eNOS,IKK and NF-κB in endothelial cells were analyzed by Western blot.Results:The phosphorylation of Akt and eNOS were increased significantly,and the phosphorylation of IKK and NF-κB were reduced under CM-H treatment,which were reversed by adding CM-EPS.Conclusion:CM-EPS can reverse insulin resistance in endothelial cells and improve endothelial dysfunction induced by CM-H.【期刊名称】《天津医科大学学报》【年(卷),期】2017(023)001【总页数】4页(P1-4)【关键词】电脉冲刺激波;内皮功能障碍;胰岛素抵抗;炎症;糖尿病【作者】赵一贺;张畅;牛文彦【作者单位】天津医科大学免疫学系,天津300070;天津医科大学免疫学系,天津300070;天津医科大学免疫学系,天津300070【正文语种】中文【中图分类】R392.12型糖尿病是一种以葡萄糖代谢异常为特征的代谢性疾病，胰岛素抵抗是其发展的核心环节[1-2]，肥胖是主要诱因。
mdx小鼠骨骼肌组织成肌、成脂、成骨基因的特异性表达
mdx小鼠骨骼肌组织成肌、成脂、成骨基因的特异性表达冷雁;张为西;周琛;郑振扬;张成;李秋玲【摘要】BACKGROUND: Duchenne's muscular dystrophy (DMD) is a fatal recessive X-Iinked form of muscular dystrophy characterized by prog ressive muscular degeneration, and there is no cure for DMD currently. Stem cell transplantation may provide us with a creative perspective. But the myogenic differentiation rate of transplanted cells is quite low in skeletal muscle. OBJECTIVE: The differences of myogenic, adipogenic and osteogenic gene expression levels in skeletal muscle between mdx mice and C57BL/6J mice were compared, with the purpose of investigating the underlying mechanism of pathological changes in skeletal muscle from mdx mice.METHODS : Frozen sections of skeletal muscle from mdx and C57BL/6J mice were prepared, stained with hematoxylin-eosin staining and Vonkossa staining. The morphological changes of the muscles were observed under microscope. Additionally, total RNA of skeletal muscle from mdx and C57BL/6J mice was extracted, reversed, and the expression levels of myogenic,adipogenic and osteogenic characteristic genes were examined by real-time PCR.RESULTS AND CONCLUSION: Necrosis and regeneration were found in skeletal muscles of mdx mice, and mild adipose hyperplasia and fibrous connective tissue hyperplasia were also observed. Moreover, calcium deposition nodules were easily detected by Vonkossa staining. The form of skeletal muscle cells from C57 mice was clear, and the nuclei were located in the cell periphery. Osteogenic andadipogenic gene expressions of skeletal muscle from mdx mice were elevated to a certain degree by real-time PCR (P ＜ 0.05), compared with C57 mice, whereas myogenic gene expression was decreased (P＜ 0.05). The reason why adipocyte and osteoblast in skeletal muscle of mdx mice overgrew may be due to degeneration and necrosis of skeletal muscle which caused by dystrophin gene deletion, and it differentiates into osteoblasts and adipocytes instead of myoblasts.%背景:干细胞移植是治疗肌营养不良症的有效方法之一,但移植的干细胞在病理骨骼肌中成肌表达较低.目的:通过比较mdx 小鼠和C57 小鼠的骨骼肌形态及成肌、成脂、成骨基因表达的差异,探讨mdx 小鼠骨骼肌病理改变的可能机制.方法:取mdx 小鼠与C57 小鼠的骨骼肌组织行冰冻切片,苏木精-伊红染色和Vonkossa染色观察两种小鼠肌肉组织的形态特征;提取mdx 小鼠和C57 小鼠骨骼肌组织总RNA,real-time PCR 检测成肌、成脂、成骨相关基因的表达.结果与结论:mdx 小鼠骨骼肌有肌纤维坏死和再生,伴有轻度脂肪、纤维结缔组织增生,Vonkossa 染色可见钙结节沉积,而C57 小鼠的骨骼肌细胞形态清晰,核位于细胞周边.与C57 小鼠比较,mdx 小鼠肌肉组织成骨、成脂基因表达有不同程度的上调(P < 0.05),而成肌基因表达下调(P <0.05).dystrophin 基因缺失及成肌基因表达下调、成骨和成脂基因上调是造成mdx 小鼠肌肉组织变性坏死的原因.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2011(015)033【总页数】4页(P6173-6176)【关键词】肌营养不良症;mdx小鼠;dystrophin;基因;骨骼肌;基因表达【作者】冷雁;张为西;周琛;郑振扬;张成;李秋玲【作者单位】中山大学附属第一医院神经科,广东省广州市,510080;中山大学附属第一医院神经科,广东省广州市,510080;中山大学附属第一医院神经科,广东省广州市,510080;中山大学附属第一医院神经科,广东省广州市,510080;中山大学附属第一医院神经科,广东省广州市,510080;中山大学附属第一医院神经科,广东省广州市,510080【正文语种】中文【中图分类】R3180 引言杜氏肌营养不良症(Duchenne’s muscular dystrophy, DMD)是一种渐进的致死性X连锁隐性遗传性肌肉疾病，该疾病常累及四肢骨骼肌、膈肌和心肌，表现为肌细胞变性坏死，逐渐出现钙沉积或被结缔组织和脂肪组织取代。
PTARGETTCRVβ52真核表达质粒的构建及表达
［文章编号］!"""#$$%!（&""’）"!#""(’#")!"#$%&"’"($)!*+,真核表达质粒的构建及表达马丽平，李蕴，赵文明!，刘振龙（首都医科大学免疫学系，北京!"""%(）［收稿日期］&""%*"+*&+；［修回日期］&""%*"%*&%［基金项目］北京市自然科学基金项目（’",&"!!）和北京市教委科技发展计划基金项目（&""&-."$,）资助［作者简介］马丽平（!(’$*），女，辽宁沈阳市人，硕士生，主要从事免疫调节方面的研究。
（/01）"!"#$+(!!)+$；（2#3451）6784954［摘要］目的构建含大鼠/>?@!,=&基因的重组真核表达质粒。
方法以?/#A>?法扩增B0C5D 大鼠脾脏淋巴细胞的/>?@!,=&基因片段，将目的基因直接克隆到真核表达载体E/F?G2/中，构建重组质粒E/F?G2/#/>?@!,=&。
连接产物转化!="#$%.H!"(细胞后进行蓝白斑筛选，并经菌落A>?和IJF 测序进行鉴定。
将重组质粒以肌注法免疫K41LM8小鼠，用?/#A>?和免疫组化方法分别检测重组质粒在注射部位的转录和表达。
通过脂质体介导，将重组质粒转染>NO#’细胞进行瞬时表达，用免疫细胞化学染色法检测目的基因在真核细胞内的表达。
结果测序鉴定证实，/>?@!,=&基因已被正确插入到E/F?#G2/载体中，并检测到肌肉组织和>NO#’细胞内目的蛋白的表达。
骨骼肌的原代培养法
骨骼肌的原代培养一.试剂1.包被用多聚赖氨酸poly-lysine的配制与包被1）准备0.94%硼酸溶液称取0.94硼酸粉末溶于80ml水中，用NaOH将pH值调至8.4，再定容。
2）按每4.9mg多聚赖氨酸粉末溶解于98ml0.94%硼酸溶液配制100ml.3）0.22µM过滤分装，-20°C储存，避免反复冻融。
4）包被：按10cm皿用4ml包被液进行包被，4°C过夜或37°C 2 小时后，吸干，回收包被液，包被过的皿置4°C保存可达一个月，临用前用PBS或灭菌的去离子水洗3遍再使用，整个包被过程均为无菌操作。
多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。
也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。
多聚赖氨酸包被培养板使用前是用灭菌的去离子水稀释，最好不要用双蒸水或别的，因为多聚赖氨酸包被的原理是通过改变器皿表面的电荷而促进细胞的黏附。
2. 0.1% I型胶原酶（1mg/ml）100mg I型胶原酶溶于100ml D-hank’s液中，过滤后4°C保存。
3. D-hank’s液（可以直接购买使用）KCl 0.40g，KH2PO4 0.06g，NaCl 8.00g, NaHCO30.35g, NaH2PO4·7H2O 0.09g，酚红0.01g。
以上均为分析纯，加三蒸水定容至1L后高压灭菌，4℃分装备用;4. 血清的灭活:常用的血清要先在56℃水浴中灭活30min方可使用。
灭活后-20℃保存备用;5. 细胞生长液的配制(100mL):即含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液。
取20ml灭活的血清，再加青、链霉素各100IU，然后用DMEM/F12培养基补充到100 mL，4℃保存备用。
6. 0.1%胶原酶II(100 mL)的制备:称取胶原酶II 100mg用100mL DMEM/F12液充分溶解，0.22µM过滤后分装备用，-20℃保存;7. 75%乙醇8. Mini-Q(超纯水)--灭菌无离子水二.实验器械1、培养皿2、培养瓶3、直剪和眼科剪4、眼科镊和止血钳5、烧杯6、15ml离心管三、正常小鼠原代骨骼肌细胞培养实验流程取肌肉于平皿，Hank’s洗3次↓剔除脂肪、结缔组织↓肌肉标本剪约0.1cm3小块↓移至离心管，Hank’s洗3次↓静置1min，弃去上层液及漂浮组织↓0.25%胰酶，37度水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次↓生长培养基终止消化，反复吹打，依次100，200，400目过筛↓离心，1000rmp,10min，弃去上清↓重悬，计数细胞，接种密度以5 × 105个/ml↓悬液加入未经PPL包被培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度，1h↓转移包被瓶中，生长培养基培养，培养37℃，5%CO2↓4d换液，以后每天换四、实验操作1、新生小鼠拉颈椎处死，乙醇消毒腿部，在超净工作台内，取肌肉于平皿，Hank’s 洗3次，剔除脂肪、结缔组织，将肌肉标本剪约0.1cm3小块；2、将剪碎的肌肉移至离心管，Hank’s洗3次，静置1min，弃去上层液及漂浮组织；3、向上述离心管中加入0.25%胰酶，37度水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次离心管，然后加入生长培养基终止消化；4、反复吹打后，依次100，200，400目过筛，滤液收集后，1000r/min离心10min；5、弃去清夜，用生长培养基重悬细胞，悬液加入未经PPL包被的培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度培养1h后，转移包被瓶中，生长培养基培养，4d 换液，以后每天换液1次。
小鼠骨髓间充质干细胞使用说明
小鼠骨髓间充质干细胞小鼠骨髓间充质干细胞产品说明：为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的小鼠骨髓间充质干细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
注意事项：1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。
培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。
4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。
5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。
小鼠骨髓间充质干细胞产品简介：产品名称：小鼠骨髓间充质干细胞组织来源：正常小鼠骨髓产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶小鼠骨髓间充质干细胞简介：小鼠骨髓基质系统内存在的骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stemcells，BM-MSCs）是一种除造血干细胞以外的、具有多向分化潜能的干细胞，可以向骨、软骨、肌组织、皮肤、脂肪、神经等多种组织分化，因此可以作为组织工程中的种子细胞。
本公司生产的小鼠骨髓间充质干细胞采用冲洗骨髓，密度梯度离心，骨髓基质细胞专一性选择培养筛选获得，经检验细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
MyoD在不同发育阶段小鼠骨骼肌中的表达与定位
MyoD在不同发育阶段小鼠骨骼肌中的表达与定位薛霖莉;任华伟;郝晓静;冀云燕;李艺雷;耿建军;赫晓燕;王海东;邢海云【摘要】本试验旨在研究MyoD基因在不同发育阶段小鼠骨骼肌上的表达量及表达位置.我们采用了固定切片、H.E.染色、RNA提取、实时荧光定量以及免疫组织化学方法进行分析.结果显示MyoD基因在幼龄小鼠的骨骼肌中表达量最高,在老龄小鼠体内的表达量次之,在体成熟小鼠体内的表达量最低.分析表明MyoD基因在不同发育阶段小鼠骨骼肌上表达存在差异,其与骨骼肌的发育存在相关性,结果将为后续研究MyoD提供理论依据.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2018(054)005【总页数】6页(P103-107,封3)【关键词】MyoD;小鼠;腓肠肌;表达差异【作者】薛霖莉;任华伟;郝晓静;冀云燕;李艺雷;耿建军;赫晓燕;王海东;邢海云【作者单位】山西农业大学信息学院,山西太谷030800;山西农业大学动物科技学院,山西太谷030800;山西农业大学信息学院,山西太谷030800;山西农业大学动物科技学院,山西太谷030800;山西农业大学信息学院,山西太谷030800;山西农业大学信息学院,山西太谷030800;山西农业大学信息学院,山西太谷030800;山西农业大学信息学院,山西太谷030800;山西农业大学信息学院,山西太谷030800;中国奶业协会,北京海淀100193【正文语种】中文【中图分类】S852.1MRFs家族包括 MyoD、Myogenin、MYF5 和MRF4四种转录因子,这4种基因相互作用调控,共同促进肌细胞的生成,调控肌肉组织的生长发育[1-2]。
MyoD基因是该家族中调节成肌细胞分化方向的关键转录因子,是脊椎动物胚胎期肌肉发育的主导调控基因之一,对骨骼肌的形成和分化起主要作用,其缺失可导致成肌细胞的增殖和分化无法进行[3]。
有研究表明,在成肌细胞形成早期MyoD开始表达出现,一直持续表达到肌肉分化完成,成肌细胞的命运也受到MyoD表达变化的影响[4]。
骨骼肌成纤维细胞分离培养
骨骼肌成纤维细胞分离培养
骨骼肌成纤维细胞（skeletal muscle fibroblasts）的分离和
培养是一种常用的实验技术，用于研究骨骼肌相关的生物学过程以及
肌肉疾病等。
以下是骨骼肌成纤维细胞分离培养的一般步骤：
1.准备离体骨骼肌组织。
从小鼠或人的骨骼肌中取出组织，最好是新鲜组织以确保细胞的活力。
2.组织消化。
将骨骼肌组织切成小块，用胶原酶或胰蛋白酶等消化酶进行消化，使细胞从组织中释放出来。
3.细胞筛选。
通过过筛网或离心的方式将消化后的细胞悬浮液筛选，去除大部分的纤维束和其他细胞类型。
4.细胞培养。
将筛选后的细胞悬浮液转移到培养皿中，添加含有合适培养基和补充物的培养液，将培养皿放置在适当的培养箱中。
5.培养条件。
骨骼肌成纤维细胞通常在37°C的孵育箱中，与5% CO2的空气保持湿润的环境中培养。
6.细胞生长和传代。
骨骼肌成纤维细胞会在培养皿中黏附并开始增殖。
当细胞达到一定密度时，可以进行传代，将细胞分离并分散到
新的培养皿中。
需要注意的是，分离和培养骨骼肌成纤维细胞需要一定的实验技巧和设备，以保证细胞的存活和生长。
同时，细胞的培养基选择和培
养条件的控制也对细胞的生长和功能有重要影响。
因此，在进行这项
技术时，需要按照具体实验要求和相关文献中的方法进行操作。
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小鼠骨骼肌细胞
小鼠骨骼肌细胞产品说明：
为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的小鼠骨骼肌细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的小鼠骨骼肌细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
小鼠骨骼肌细胞注意事项：
1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。
培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。
4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。
5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。
小鼠骨骼肌细胞产品简介：
产品名称：小鼠骨骼肌细胞
组织来源：小鼠肌肉组织
产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶
小鼠骨骼肌细胞简介：
小鼠骨骼肌细胞分离自鼠肌肉组织，细胞多呈梭行，具有一定的方向性。
刚开始的细胞呈单个圆形或梭形，处于有丝分裂后期，细胞的活动性强，核成椭圆形，位于细胞中央，胞质内嗜碱性逐渐变为嗜酸性。
本公司生产的小鼠骨骼肌细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度75%~85%，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
5、培养基信息：
小鼠骨骼肌细胞培养基类型：
DMEM培养基(GIBCO，添加NaHCO3 1.5g/L，Sodium Pyruvate0.11g/L)；
添加因子：优质胎牛血清10%，细胞生长因子等。
小鼠骨骼肌细胞使用方法：
细胞培1. 取出25cm2 培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO
2
养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。
2. 待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。
3. 细胞传代
1) 吸出25cm2培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；
2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液约1mL至培养瓶中，37℃温浴3min左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；
3) 用吸管轻轻吹打混匀，按1:2的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培
细胞培养箱中培养；
养基至5mL，放入37℃，5% CO
2
4) 待细胞完全贴壁后，培养观察。
之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。
小鼠骨骼肌细胞注意事项：
1. 培养基于4℃条件下可保存3-6个月。
2. 在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作。
3. 传代培养过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态。
4. 该细胞只可用于科研。
备注：由于实验所用试剂与操作环境的不同，以上方法供各实验室参考。
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