犬骨骼肌成肌细胞体外分离纯化及培养方法改良探索

DOC格式论文，方便您的复制修改删减 犬骨骼肌成肌细胞体外分离、纯化及培 养方法改良探索

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作者：苏冠华,刘启云，卢永昕，米少华，孙雨霏，刘晓明， 帅欣欣 【摘要】 目的：探讨犬骨骼肌成肌细胞（SkMS体外分离、纯 化及培养方法的改良并研究其生物学特性。 方法：采用机械分离结合 H型胶原酶、中性蛋白酶双酶一步消化法分离犬骨骼肌成肌细胞 ， 经差速贴壁法纯化后，在骨骼肌细胞生长培养基（SKGM中进行原代 和传代培养，免疫细胞化学染色鉴定。结果：改良后的培养方法适于 获取犬骨骼肌成肌细胞，SKGM培养基适于犬骨骼肌成肌细胞的体外 培养。SkMs在细胞密集或低血清分化培养基作用下可融合成肌管。 结蛋白（desmin）单克隆抗体（mAb细胞化学染色鉴定SkMs呈阳性， 纯度在90%以上。结论：通过改良后的双酶一步消化法获得的 SkMs 在合适的培养条件下能够增殖、 分化并保持其生物学特性，为其在 基因治疗和组织工程中的应用奠定了基础。 【关键词】犬；骨骼肌成肌细胞；细胞培养；生物学特性 DOC格式论文，方便您的复制修改删减 1961年，Mauro等首次在蛙骨骼肌中发现了具有自我更新和分化 形成肌纤维能力的肌卫星细胞(muscle satellite cells )。从骨骼

肌中分离获得的肌卫星细胞在体外分离培养时被统称为骨骼肌成肌 细胞(skeletal myoblasts, SkMs)。来源于骨骼肌的成肌细胞具有取 材方便、免疫源性低、植入后容易与宿主的肌纤维融合、 体外培 养条件下较易被携带外源基因的病毒转染、 转染外源基因的成肌细 胞可释放重组蛋白到局部或体循环中等优点 [1]。因此，成肌细胞被 广泛应用于基因治疗和组织工程方面的实验研究。 本研究以获取基因 治疗载体SkMs为目的，探讨建立简便、 经济的成肌细胞分离、 纯 化及培养方法。 1材料和方法 1.1材料

实验犬由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。 中性蛋白 酶购自美国Roche公司，H型胶原酶、 结蛋白(desmin)单克隆抗 体(mAb购自美国Sigma公司；SKBM培养基和SKGM Bullet Kit 购 自美国Lonza公司；亲和素拟生物素拟过氧化物复合物法 (avid in拟biotin complex, ABC )免疫组化试剂盒购自美国 Vector 公司,DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司 ；胰蛋白酶、DMEM M199培养基购自美国 Hyclone公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS ,小牛血清购自美国Gibco公司。 1.2方法 DOC格式论文，方便您的复制修改删减 1.2.1 SkMs的原代培养 完全生长培养基70SKGM各成分按以下比例SKGM DMEM FBS= 70 : 25 : 5配制。无菌全麻下自5〜8 kg左右杂种犬股四头肌取3〜5 g肌肉，将其移入盛有PBS勺90 mm培养皿中剔除筋膜、 脂肪、肌 腱和血管组织后剪为碎糜状，将组织块移入盛有约30 mL的4 g/L中 性蛋白酶和1 g/L H型胶原酶混合消化酶溶液的 100 mL玻璃瓶中， 37C恒温摇床60 r/min, 1 h 。然后吸取9 mL上清液经孔径75卩m 的不锈钢网筛（200 目）过滤到10 mL玻璃离心管中，再加入1 mLFBS 中和，1 000 r/min, 离心5 min,弃上清。力口 70SKGM培养基重悬细 胞沉淀，种入明胶预包被的培养瓶。再加入双酶溶液重复消化上述剩 余的组织块，反复3〜4次。计数、台盼蓝染色确认细胞成活率。2 d 后换液，以后每2〜3 d换液1次，在倒置显微镜下观察细胞形态和 生长情况。 1.2.2 SkMs的传代培养及纯化 倒置显微镜下观察细胞生长情况，当细胞生长到培养瓶面积的 70%〜80%寸,以2.5 g/L胰蛋白酶+ 0.2 g/L EDTA混合溶液消化，中 止消化后离心，重悬细胞后将细胞悬液接种另一培养瓶，静置于培 养箱内约8〜10 min后取出，轻轻晃动培养瓶，动员未贴壁的细胞， 吸出培养液接种另一培养瓶，反复差速3次。最后按1 : 2或1 : 3比 例进行传代，每2〜3 d换液1次。4 g/L台盼蓝染色确认细胞成活 率。 1.2.3 SkMs细胞生长曲线测定 DOC格式论文，方便您的复制修改删减 取处于对数生长期的细胞，用上述EDTA胰酶溶液消化后制 成单细胞悬液，细胞计数后以5X 103细胞/孔接种于24孔板，共接 种8组，每组3孔，每天取一组细胞进行计数，计算平均值，连续8 d,绘成细胞生长曲线。未计数孔细胞每 2〜3 d换液1次。

124 SkMs的诱导分化 取培养至第2〜3代的细胞，消化后以1X105细胞/孔接种于放 有盖玻片的6孔培养板中，加入生长培养基进行培养，待细胞分裂、 增殖至70%〜80%匚合后，加入分化培养基（含 200 mL/L FBS的M199 培养基）继续培养，倒置显微镜下观察细胞生长及分化情况。 1.2.5 SkMs的免疫细胞化学染色

将细胞接种于有盖玻片的6孔板，待长至培养面积的80%取 盖玻片。40 g/L多聚甲醛固定后，以ABC法行免疫化学染色，以鼠 抗desmin mAb为一抗，DAB显色。 1.2.6差速贴壁组与非差速贴壁组纯化所得细胞 desmin阳性数 比较 取等量的第2代细胞悬液种于25 cm2培养瓶，差速贴壁纯化组 与非差速贴壁组各2瓶，制作细胞爬片行desmin免疫化学染色。每 组取4片，每片随机取5个视野进行采样，以Olympus BX50显微摄 像系统进行阳性细胞计数，所得数据以x 2检验进行统计学处理。 2结果

2.1 SkMs体外培养的生物学特点 DOC格式论文，方便您的复制修改删减 经酶消化分离出的成肌细胞为圆形小亮点，悬浮于培养液中。有 活力的细胞能够在48 h内完全贴壁，变扁并向四周伸展而成为一梭 形或纺锤形细胞，有折光性（图1A）。约3~4 d后进入对数生长期 （图1B） , 6〜7 d后因接触抑制生长速度减慢。细胞增多后逐渐按 一定方向呈有序排列。 2.2骨骼肌成肌细胞体外培养的鉴定 221多核肌管形成 在体外培养的成肌细胞当细胞密集或改变培养基中的血清浓度 时，可清楚地观察到长轴方向胞质融合后形成多核肌管（图 2）。 2.2.2 desmi n细胞免疫化学染色 差速纯化后培养的成肌细胞经 desmin进行免疫化学染色（DAB 显色），成肌细胞胞质呈阳性反应，细胞核外周及胞质呈棕黄色，表 明培养的细胞为成肌细胞（图3）。多核肌管呈强阳性。 2.3成肌细胞生长活性测定和生长曲线的绘制 原代细胞进行台盼兰染色，结果发现97%以上的细胞均不着色， 表明本实验方法培养的细胞存活率高。细胞连续计数所绘制的成肌细 胞生长曲线显示：细胞在培养的3〜5 d增殖达高峰，5〜7 d后基本 达生长平台期。 2.4成肌细胞的差速纯化 将差速贴壁组与非差速贴壁组纯化所得细胞进行 desmin免疫化 学染色，发现两组阳性细胞数有显著差异，经计算得x 2值为5.47, P0.05为具有统计学意义。 DOC格式论文，方便您的复制修改删减 3讨论 SkMs是位于骨骼肌纤维膜与基底膜之间的组织干细胞。当骨骼肌受 损伤时，可被启动形成新的骨骼肌纤维［2］。一般来讲，肌肉来源的 动物越老，分离肌肉细胞所需要的时间越长，而且单个核前体细胞 的产量也越低。国内大多数研究取成年犬的骨骼肌组织坚韧，同时由 于成肌细胞量少，提取困难。本实验综合国内外研究经验，采用了约 5〜8 kg的未成年犬进行原代培养，产量较高。目前提取犬成肌细胞 大多采用机械分解法结合三步消化法［3］（1型胶原酶，透明质酸酶, 链霉蛋白酶）或二步消化法［4］ （I型或IV型胶原酶+胰蛋白酶） 获得单细胞悬液，步骤繁琐，成本均较高。蛋白水解酶如胰蛋白酶， 链霉蛋白酶等往往还存在可能损伤细胞、 在孵育的过程中不稳定、可 能成为支原体污染的来源等缺点。而中性蛋白酶则能够克服以上缺 点。故本研究创新性地采用中性蛋白酶/ H型胶原酶混合酶溶液一步 消化法，大大简化了流程并以较少的代价获得足量的原代成肌细胞。 研究认为，原代细胞中混有大量的成纤维细胞，既往为提高纯度往 往采用不连续密度梯度离心法］5］、免疫磁珠分离法］6］、不完全消 化法等方法，但均以操作复杂、产量低或价格昂贵为代价。差速贴壁 操作方法简单有效，具有很大的适用性。原理是利用成纤维细胞的贴 壁能力强于成肌细胞，10 min 左右即可贴壁，而成肌细胞多数仍处 于悬浮状态，此时移出培养液，即为纯化的成肌细胞。本实验中采用 3次预贴壁，每次10 min进行差速纯化获得的成肌细胞经鉴定阳性 率均在90%以上,符合组织工程拟基因治疗的纯度要求。

据已有文献报道，不同种属动物SkMs的最佳培养条件不 同。目前犬 SkMs常用的生长培养基有 M199, MEM, DMEM, F12以及 RPMI1640等。SkMs体外增殖、分化除受血清浓度改变的影响之外，还 要受到多种因子的调节，如胰岛素、肝细胞生长因子（HGF、胰岛素 样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EDF、碱性成纤维生长因子（bFGF 等。研究证实]7],在不含任何生长因子的 DMEMM199等生长培养 基进行培养时，原代细胞中混杂的成纤维细胞迅速生长 ，并随着传 代次数的增多呈几何级数增长逐渐占据优势。包含特定生长因子的生 长培养基更适合于SkMS的增殖培养。SKGM培养基中含有胰岛素，EGF, 地