尹 明----胎牛成纤维细胞的分离培养
水凝胶递送碱性成纤维细胞生长因子对氧糖剥夺后NIH3T3_细胞功能的影响
第 49 卷 第 6 期2023年 11 月吉林大学学报 （ 医学版 ）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.6Nov. 2023
DOI：10.13481/j.1671‑587X.20230611
水凝胶递送碱性成纤维细胞生长因子对氧糖剥夺后NIH3T3
细胞功能的影响
惠文婷1, 宋潼潼2, 黄敏1, 陈霞1
（1. 吉林大学基础医学院药理学系，吉林 长春 130021； 2. 吉林大学基础医学院人体解剖学系，
吉林 长春 130021）
［摘要］ 目的目的：探讨水凝胶递送碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对氧糖剥夺（OGD）后小鼠
成纤维NIH3T3细胞功能的影响，并阐明负载bFGF的水凝胶对OGD条件下成纤维细胞氧化应激反应
的改善作用。方法方法：制备bFGF明胶水凝胶，将对数生长期NIH3T3细胞分为空白组、20%明胶组和20%明胶+戊二醛组，采用CCK-8法检测6、12和24 h水凝胶浸出液共培养的NIH3T3细胞活性。将
NIH3T3细胞分为对照组、OGD组和OGD+不同质量 bFGF负载组（OGD+1 ng bFGF组、OGD+
10 ng bFGF组和OGD+100 ng bFGF组）。采用Western blotting法检测各组细胞中α-平滑肌肌动蛋白
（α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白表达水平。检测各组细胞中丙二醛（MDA）水平和乳酸脱
氢酶（LDH）及超氧化物歧化酶（SOD）活性。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测bFGF体外
释放率。结果：CCK-8法检测，与空白组比较，不同浸出时间20%明胶组和20%明胶+戊二醛组NIH3T3细胞活性差异无统计学意义（P>0.05）。Western blotting法检测，与对照组比较，OGD组
NIH3T3细胞中α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）；与OGD组比
ICR小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备
ICR小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备
方驰华;胡海北;郝建志;陈霞
【摘 要】背景:小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层能有效促进胚胎干细胞及诱导多能性干细胞增殖并维持其未分化特性和多潜能性,且效果优于无饲养层单独添加一些细胞因子,而且可以为上述两种细胞提供类似的胚胎发育环境.目的:建立稳定高效的ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于培养人胚胎干细胞及诱导多能性干细胞.方法:使用胰蛋白酶消化法分离ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察不同的胰蛋白酶水平及消化时间对获取小鼠胚胎成纤维细胞的量及其增殖活性的影响;利用不同质量浓度丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞1,1.5,2,2.5,3,3.5 h制备饲养层细胞,MTT法检测其增殖活性,探索其制备饲养层的最佳条件.结果与结论:分离ICR小鼠胚胎原代成纤维细胞最佳胰蛋白酶浓度为0.05%,消化时间为12～15 min,丝裂酶素最佳作用质量浓度和时间为10 mg/L作用2.5 h,成纤维细胞饲养层可以维持8～12 d.0.05%胰蛋白酶消化15～20 min效果优于0.15%,0.25%胰蛋白酶消化;10 mg/L丝裂霉素C处理胚胎成纤维细胞2.5 h能有效抑制其增殖,表明该条件下的饲养层细胞能很好的支持胚胎干细胞及诱导多能性干细胞生长.
【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2010(014)023
【总页数】4页(P4299-4302)
【关键词】胚胎成纤维细胞;丝裂霉素C;饲养层;胚胎干细胞;诱导多能性干细胞
【作 者】方驰华;胡海北;郝建志;陈霞 【作者单位】南方医科大学附属珠江医院肝胆一科,广东省广州市,510180;南方医科大学附属珠江医院肝胆一科,广东省广州市,510180;南方医科大学附属珠江医院肝胆一科,广东省广州市,510180;南方医科大学附属珠江医院超声诊断科,广东省广州市,510180
【正文语种】中 文
【中图分类】R394.2
不同饲养层对牛胚胎干细胞培养的影响
不同饲养层对牛胚胎干细胞培养的影响
张守宝1，柏学进1，2，朱金香1，王文明1，刘玮1，董雅娟1，2
（1．青岛农业大学动物胚胎工程中心，山东青岛266109；
2．山东布莱凯特牧业科技有限公司，山东淄博256306）
摘要：本研究建立牛胚胎干细胞（BovineEmbryonicStemCellsESCs）的分离培养体系，摸索牛ESCs的培养条件。对牛运用FSH减量注射法进行
超数排卵获取胚胎。从获得的胚胎中分离ESCs，在不同的饲养层（牛骨髓间充质干细胞、牛成纤维细胞、牛乳腺干细胞）上培养，对牛ESCs进
行形态学观察及鉴定。牛MSCs做饲养层与牛SFCs、牛MaSCs相比差异显著，牛MSCs的效果最佳（P＜0.05）。牛ESCs在牛MSCs做饲养层的条
件下更易生长。分析了不同饲养层对牛ESCs分离培养的影响，建立了一种分离培养牛ESCs的饲养层体系，为进一步深入研究ESCs的诱导分化
和应用打下基础。
关键词：超数排卵；饲养层；牛胚胎干细胞
中图分类号：S814.6文献标识码：A文章编号：0529-5130（2010）05-0044-05
胚胎干细胞（ESCs）指从桑椹胚的卵裂球（seg-
mentationsphere），附植前胚胎的内细胞团（Inner
CellMass，ICM），上胚层细胞（EpiblastCell）或原
始生殖嵴细胞（Primordialgermcells，PGCs）分离出
来全能干细胞。饲养层细胞是通过细胞接触机制和非
接触机制促进ESCs增殖并阻止其分化。它能分泌多
种细胞因子，提供ESCs生长的环境和信号。饲养层
对ESCs的分化抑制是其分泌的多种因子共同作用的
结果。不同ESCs的最佳饲养层不尽相同，不同的饲
养层细胞在使用上也各具优缺点。最可靠的方法还是
根据动物种类筛选最佳饲养层来对ESCs进行培养。
LeroyStevens发现小鼠畸胎瘤细胞（embryoniccarci-
nomacell，EC），揭开了研究动物胚胎干细胞的序
血管成纤维细胞原代细胞提取培养
血管成纤维细胞分离与培养
一、 实验动物
8-10周龄C57小鼠10只。大鼠
二、 试剂及配制
高糖DMEM、0.25%胰蛋白酶, 胎牛血清、青霉素-链霉素混合液。
培养液: 10%DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）
20%FBS DMEM
三、 实验仪器
超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机
四、 组织分离与贴壁
1、将小鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用75%乙醇消毒胸、腹部皮肤。
2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。用眼科虹膜剪沿剑突处正中线向上剪开胸骨, 沿正中线向下剪开腹膜，将腹部内脏拨至一旁，充分暴露主动脉，从肾动脉分支处直至心脏剪下, 取出心脏及主动脉, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。
3、将鼠心脏主动脉全部取出后, 剪去心房心脏、剔除主动脉上脂肪，预冷ＰＢＳ液清洗3次, 去除血污。
4、纵向剖开血管腔，血管内膜面朝上铺于培养皿上，手术剔除内膜和中膜，PBS漂洗余下半透明血管外膜。
5、贴块法：将血管外膜转移至20%FBS DMEM中，剪成约1mm3的小块，吸弃多余的培养基，培养皿底面朝上置于37℃5%CO2培养箱，干涸4-6h，待组织块贴壁后，将培养皿慢慢翻转放平，滴加含有20%FBS DMEM培养基，使培养液完全浸泡组织块，置于37℃，5%CO2培养箱，每2天换培养液1次，待细胞生长达融合状态（7-10天），胰酶消化传代10%DMEM。
6.胰酶消化法：？
五、细胞形态学观察和免疫荧光鉴定
成纤维细胞：波形蛋白，内皮细胞：CD31,平滑肌细胞
1：分离血管内中外膜比较费时，可以先在显微镜下练习，然后肉眼练习，再到超净台内练，动作尽量要熟练轻柔，避免牵拉过度。
2：剪的组织块要小，最好能小于1*1mm。可以用刀片切。
3：贴壁距离要小，比5mm*5mm小，可以一次把培养液加到5~7ml，等估计贴牢时可以直接翻瓶。
不同分离方法对鼠胚胎成纤维细胞生长影响的比较
维普资讯 课题背景：课题
为２００３年辽宁
省自然科学基金
项目．由秦书俭
教授、梅晰凡博
士和郑德宇博士
共同主持．目前
课题已经基本完
成。课题组建立
大鼠脊髓半切模
型的制备．成功
培养出胚胎大鼠
神经干细胞，并
在动物实验中获
得成功：现在于
小鼠胚胎千细胞
领域取得突破，
已经获得多个单
克隆小鼠胚胎干
细胞株，正在进
行鉴定和建系工
作。课题完成单
位辽宁医学院解
剖实验室是辽宁
省重点实验室，
参照国际实验室
设计修建．拥有
全套的细胞培养
仪器 ＩＳＳＮ １６７３－８２２５ ＣＮ ２１－１５３９／Ｒ
张海锋，等．不同分离方法对鼠胚胎成纤维细胞生长影响的比较¨ ２ 。 ！
５４．１２％，单细胞悬液法、组织块培养法细胞增殖指数分别为５３．５２％和５３．１５％，３种方法差异无显著性意义（尸 ０．０５），表明
其细胞周期基本相同。
结论：滤网过滤改良法可以在较短时问内培养出优质高采的鼠胚胎成纤维细胞。
关键词：成纤维细胞；胚胎；细胞分离；细胞培养技术
张海锋，单伟，秦书俭．不同分离方法对鼠胚眙成纤维细胞生长影响的比较【Ｊ】．中国组织工程研究与临床康复，２００７，１１（１１）：２００１—２００４
［ｗｗｗｚｇｌｃｋｆｃｏｍｌｚｇｌｃｋｆｌｅｊｏｕｒｎａｌｌｕｐｆｉｌｅｓｌ０７－１１『１ｌｋ－２００１（ｐｓ）．ｐｄｔｌ
０ 引言
胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团或原
始生殖细胞分离出来的、能在体外长久培养
的、具有多方向分化潜能和种系嵌合能力的细
胞系。１９８１年，Ｅｖａｎｓ等【’】和Ｍａｒｔｉｎ［ 】分别从
小鼠囊胚内细胞团和鼠胚中分离出小鼠胚胎
干细胞，胚胎干细胞已成为当今生物学最热门
和最为前沿的研究课题之一。
饲养层细胞对于胚胎干细胞的增殖与维
持未分化状态具有重要作用【３１，尽管某些分化
抑制因子，如白血病抑制因子等也可以保持
胚胎干细胞的未分化状态【 ，但多数研究表
小分子化合物组合将人胚胎成纤维细胞体外编程为神经前体细胞
细胞替代疗法已成为治疗神经性疾病一项非常有前途的措施，研究表明，神经细胞移植能有效治疗神经退行性病变［1-3］。成纤维细胞是一种易获得、耐受性好，便于细胞重编程潜在的初始细胞［4］。利用特定的因子将体细胞诱导产生神经前体（ciNPCs）或神经干细胞（NSCs）为神经退行性疾病如帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）、阿尔兹海默症（AD）的细胞治疗提供了新的途径［5］。有研究证实，利用过表达神经谱系特异性转录因子或采用细胞重编程转录因子，与小分子化合物相结合，可以直接将体细胞重编程为神经元或化学诱导的多能干细胞样细胞（ciPSLC）［6,7］。但由于外源性基因引入和病毒转染存在一定的安全性问题，限制了它们在细胞治疗中的应用。而小分子化合物具有安全性高、易获得、易操作与高细胞渗透性等优势，在不引入任何外源因子的情况下，通过化学介导实现细胞重编程已得到广泛关注［8,9］。小分子化合物组合将人胚胎成纤维细胞体外编程为神经前体细胞
杨盼1，王圆圆1，高群伟1，刘阳1，王翼1，郭俣2，刘长青1，刘高峰1蚌埠医学院1生命科学学院，2检验医学院，安徽蚌埠233000
ChemicalreprogrammingofhumanembryonicfibroblastsintoneuralprogenitorcellsinvitroYANGPan1,WANGYuanyuan1,GAO
Qunwei1,LIUYang1,WANGYi1,GUOYu2,LIUChangqing1,LIUGaofeng1BengbuMedicalCollege1SchoolofLifeSciences,2SchoolofLaboratoryMedicine,Bengbu233000,China摘要：目的通过小分子化合物组合将人胚胎成纤维细胞（HEFs）重编程为化学诱导神经前体细胞（ciNPCs）。方法HEFs重编程为ciNPCs涉及两个阶段，第1阶段是小分子组合诱导阶段，常氧条件下，将HEFs在含有小分子化合物组合VCR（VPA，CHIR99021，Repsox）的KSR培养基中培养15d，HEFs形态发生变化，形成致密细胞集落。第2阶段是特异性诱导ciNPCs，将形成的细胞集落胰酶消化后，低粘附板中悬浮培养，可以形成ciNPCs神经球。采用CM-DiI染料标记P3代ciNPCs，并将其移植于6-OHDA法制作的帕金森大鼠模型右脑内侧前脑束（MFB）区，检测ciNPCs在PD大鼠脑内微环境中的存活、迁移以及分化状况。结果VCR组合诱导10d细胞开始出现明显的聚集趋势，15d时，形成致密的细胞集落。单层培养1×105/孔中大约形成40个克隆，且AP染色呈阳性。将细胞集落消化后，低粘附板中悬浮培养培养2d，可见大量神经球形成，即为第1代ciNPCs（P1代）。ciNPC高表达神经前体细胞（NPCs）特异性标记物（Nestin、Pax6和Sox2），经体外神经特异性诱导分化，ciNPCs表达神经元特异性标记物Tuj1和星形胶质细胞特异性标记物GFAP。而且，P3代ciNPCs移植PD大鼠脑内4周后，可以分化为Tuj1+、GFAP+、TH+和GABA+细胞。结论VCR可以将HEFs重编程为ciNPCs，而无需引入外源性基因，为神经科学研究和神经退行性疾病的治疗提供有利的供体材料。关键词：小分子化合物组合；细胞重编程；人胚胎成纤维细胞；神经前体细胞
西藏牦牛胎儿成纤维细胞的分离与培养
一４２一 江苏农业科学２０１１年第３９卷第３期
任子利，赵彦玲，王建洲，等．西藏牦牛胎儿成纤维细胞的分离与培养［Ｊ］．江苏农业科学，２０１１，３９（３）：４２—４５
西藏牦牛胎儿成纤维细胞的分离与培养
任子利，赵彦玲，王建洲，李瑜鑫，强巴央宗
（西藏农牧学院动物科学学院，西藏林芝８６００００）
摘要：对西藏牦牛胎儿成纤维细胞的分离和培养进行了研究。利用组织块法和酶消化法均能成功分离培养西藏
牦牛胎儿成纤维细胞，通过细胞的传代培养、形态学和动力学观察与分析，结果表明，所建立的西藏牦牛胎儿成纤维细
胞系具有典型的成纤维细胞形态；西藏牦牛胎儿成纤维细胞要经历滞留期、对数期、平台期，分别为０～２ ｄ、２～７ ｄ、
７—８ ｄ ｏ试验结果表明，已成功培养了西藏牦牛胎儿成纤维细胞。 关键词：西藏牦牛；胎儿；成纤维细胞；体外培养；分离
中图分类号：￥８２３．９ ９１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２—１３０２（２０１１）０３—００４２—０３
西藏在我国五大牧区中是一个十分独特的地域，其罕见
的海拔高度、复杂的气候环境、广阔的高原草场，故而有极其
丰富的牛种资源，仅家养牛种就有牦牛、黄牛等。根据２００９
年的统计资料，我国现有牦牛１ ４００万头，其中西藏牦牛６４５
万头 Ｊ。西藏牦牛独特的生理结构和较强的高原适应性具 有很高的科研价值，但由于受地理环境和试验设备条件等的
限制，对西藏牦牛细胞特性的研究极为有限，而在寒冷、干旱、 低温、低压、强辐射、高海拔等生境条件下开展西藏牦牛体细
胞的研究，可为转基因牦牛和克隆转基因牦牛等研究提供必
要而又关键的技术依托，同时也为我国青藏高原特有的其他
家畜品种和濒危野生动物的种质资源保护提供借鉴。
自体细胞克隆羊出生以来，克隆技术引起了广泛关
注 。体细胞克隆技术以其在动物繁殖、品种改良及育种中
的巨大潜力及广阔的应用前景而备受广大动物科技工作者关
注。同时，动物体细胞作为保存动物遗传资源的一种补充，日
牛胎儿皮肤成纤维细胞体外培养及其特性研究
ｉ 试验 竞 ｉ
牛胎儿皮肤成纤维细胞
体外培养及其特性研究
周艳喜，曲世磊，李鹏，李 燕，刘春霞
（内蒙古农业大学生物工程学院，内蒙古 呼和浩特０１００１８）
动物细胞培养是细胞工程、胚胎工程等生物
工程研究及生物学基础研究的重要技术Ｈ 。离体细
胞培养的成功为细胞结构与功能的研究创造了条
件，特别是包括从低等动物、高等动物到最高级的
哺乳动物乃至人的各种细胞系和细胞株的建立，
其中有正常细胞株、病毒或其他因子转化的细胞
株、基因突变的细胞株、杂交瘤细胞株等 引。这些
培养细胞已成为细胞生物学、发育生物学、遗传
学、免疫学、肿瘤生物学、神经生物学等学科研究
的重要模型［４ 。该试验以牛胎儿为原料，研究牛胎
儿皮肤组织成纤维细胞的分离、原代培养、传代培
养、纯化方法，观察总结其在体外的生长特性，旨
在获得在体外增殖纯化的牛胎儿皮肤成纤维细
胞，研究其细胞特性，为相关研究奠定试验基础。
１材料与方法
１．１试验材料：牛胎儿购自内蒙古呼和浩特市回
民区屠宰场；胎牛血清为杭州四季青生物工程材
料有限公司产品；链霉素、青霉素为华北制药股份
有限公司产品；胰蛋白酶为Ｓｉｇｍａ公司产品；
Ｔｃｍ１９９培养基为ＧＩＢＣＯ公司产品。
１．２ 方法
１．２．１牛胎儿皮肤组织的采集：取约９０日龄牛胎
儿，用无菌眼科剪、手术刀取牛胎儿皮肤组织，并
剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，加入一定量的
生理盐水浸泡。
１．２．２原代培养：方法ｌ：组织块培养法：将皮肤组
织用７５％酒精溶液浸泡１ ｍｉｎ后再用ＰＢＳ溶液洗
３次，在培养皿中用剪刀将组织块剪成ｌ～２ ｍｍ 大
小的小块转移至卡式培养瓶中．用接种针把组织
收稿１３期：２００８－０４—０８ 作者简介：周艳喜（１９８４一），男，在读硕士研究生，主
要研究方向为动物病理生理。 通讯作者：刘春霞（１９７８一），女，讲师，主要研究方向 为动物发育生物学与胚胎工程，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｕｃｈｕｎｘｉａ一 ０ｏ１＠１６３．ｃｏｒｎ
培养方法及胎牛血清浓度对人胎儿成纤维细胞体外生长的影响
信阳师范学院学报：自然科学版 第２６卷第４期２０１３年１０月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｘｉｎｙａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｖｏ１．２６ Ｎｏ．４ ０ｃｔ．２０１ ３
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００３－０９７２．２０１３．０４．０１４
培养方法及胎牛血清浓度对人胎儿
成纤维细胞体外生长的影响
程 腾，李佳佳，贺小英，刘 娟，马利兵
（内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头０１４０１０）
摘要：采用单细胞培养法和组织块培养法从原代培养人胎儿成纤维细胞，并在不同体积分数胎牛血清 （ＦＢＳ）（０％、４％、８％、１０％、１２％）的奈件下观察人胎儿成纤维细胞培养的状况并采用台盼蓝染色法进行活细 胞计数．结果表明，早期由组织块培养法原代培养获取的细胞形态要比单细胞培养法原代培养获取的细胞稍好 些，且在细胞传代后极少出现无法贴壁的死细胞．ＦＢＳ对ｈＦＦｓ生长影响比较明显．在实际应用中，在体积分数 ８％ＦＢＳ下，采用组织块培养法进行人胎儿成纤维细胞体外培养，效果良好． 关键词：人胎儿成纤维细胞；单细胞培养法；组织块培养法；胎牛血清 中图分类号：￥８２８ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００３－０９７２（２０１３）０４－０５２３－０４
Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ
Ｓｅｒｕｍ ｏｎ ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｆｅｔａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ
Ｃｈｅｎｇ Ｔｅｎｇ，Ｌｉ Ｊｉａｊｉａ，Ｈｅ Ｘｉａｏｙｉｎｇ，Ｌｉｕ Ｊｕａｎ，Ｍａ Ｌｉｂｉｎｇ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，Ｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｏｔｏｕ ０１４０１０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｂｌｏｃｋ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｆｉ— ｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＦＢＳ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｂｌｏｃｋ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｏｎ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）（０％，４％，８％， １０％，１２％）ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｔｈｅｎ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｔｈｅ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｏｕｎｔｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｈｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ，ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｐａｓｓａｇｅ，ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｙ ｔｉｓｓｕｅ ｂｌｏｃｋ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ ｄｅａｄ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｕｎａｂｌｅ ｔｏ ｓｔｉｃｋ ｗａｌｌ ｗｅｒｅ ｓｅｌｄｏｍ ａｐｐｅａｒｅｄ ａｆｔｅｒ ｐａｓｓａｇｅ．ＦＢＳ ｈａｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈＦＦｓ．Ｉｎ ｔｈｅ ｒｅａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＦＢＳ ｗａｓ ８％，ｕｓｉｎｇ ｔｉｓ— ｓｕｅ ｂｌｏｃｋ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｃｕｌｔｉｖａｔｅ ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｈａｄ ａ ｇｏｏｄ ｅｆｆｅｃｔ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ；ｔｉｓｓｕｅ ｍａｓｓ ｃｕｈｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ；ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ
一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法
一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法
真皮成纤维细胞是一种重要的细胞类型，其在生物医学研究、组织工程和再生医学等领域具有广泛的应用前景。以下是一种常用的小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法：
1. 实验前准备：
- 小鼠或大鼠
- 麻醉剂，如异氟醚等
- 消毒剂
- 必需的培养基和培养液
2. 小鼠/大鼠的取材：
- 麻醉小鼠或大鼠，确保其在实验过程中不会感到疼痛或不适。
- 消毒动物的表面，以减少细菌或其他微生物的污染。
- 取下小鼠/大鼠的皮肤。使用消毒剪刀和镊子将皮肤切割成小块，以便后续的分离过程。
3. 细胞的分离和培养： - 将皮肤块转移到含有酶解消化液（如胰蛋白酶）的培养皿中，并在37°C的恒温搅拌器上进行酶解（通常为1-2小时）。
- 将酶解后的皮肤块过滤，移至新的培养皿中，加入培养基和培养液，如DMEM/F12或RPMI-1640，并添加10%胎牛血清。
- 将培养皿放在37°C的细胞培养箱中，保持适当的温度、湿度和CO2浓度。
- 培养皿中的细胞会开始生长和扩增。定期更换培养基，并进行细胞的孵育以保持其正常生长。
4. 细胞的传代：
- 当细胞密度达到80-90%时，使用胰蛋白酶或胰蛋白酶-EDTA溶液将培养皿中的细胞与培养皿底部松散的连接断开。
- 将细胞计数，并根据需要的细胞数量进行传代。一般情况下，将细胞按照1:3或1:4的比例重新分装到新的培养皿中。
- 重复上述步骤，直到获得足够数量且健康的细胞。
这种方法能够有效地分离和培养小鼠或大鼠真皮成纤维细胞，为相关研究提供了重要的细胞资源。通过优化培养条件和细胞的传代方法，可以获得高质量和稳定的细胞群体，以支持各种实验或应用的需要。