人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定
Hartley豚鼠耳朵成纤维细胞分离培养与鉴定分析
Hartley豚鼠耳朵成纤维细胞分离培养与鉴定分析
陈瑞平;赵明一;朱平;吴楚漫;周文怡;姜浩东;吴越;彭俊崴;郭惠明;黄焕雷;朱烁基
【摘 要】本文旨在建立快速获取豚鼠耳朵成纤维细胞的方法,为豚鼠体细胞重编程技术提供起始细胞.首先采用0.05％ Trypsin-EDTA和Collagenase Ⅳ两种消化酶对脱毛后的耳朵组织碎块进行消化;然后对获取的细胞进行体外培养和形态学观察,支原体检测,Vimentin蛋白免疫荧光鉴定,测定细胞生长曲线计算细胞倍增时间;用绿色荧光蛋白的逆转录病毒感染后用流式细胞仪检测感染效率,核型鉴定检测病毒对核型的影响.分离的豚鼠耳朵成纤维细胞为贴壁生长细胞,消化后2～3h即大部分贴壁并基本完全伸展,细胞呈梭形或多角形,胞浆饱满,立体感强,细胞核清晰形态良好,支原体检测阴性.细胞表达成纤维细胞特异性蛋白Vimentin.生长曲线为S形,符合体外培养细胞正常生长增殖规律,细胞倍增时间为24.85 h.逆转录病毒感染效率达75.6％,病毒感染后染色体2n=64的细胞占90％,遗传稳定核型正常.本研究提供的体细胞获取方法操作简单,效率高,获取的细胞状态良好,细胞增殖速度快,细胞感染率高,是一种非常合适的豚鼠耳朵成纤维细胞分离手段,为后续进一步研究豚鼠体细胞重编程提供了技术基础.
【期刊名称】《激光生物学报》
【年(卷),期】2019(028)003
【总页数】7页(P245-251)
【关键词】Hartley豚鼠;耳朵;成纤维细胞;生物学特性
【作 者】陈瑞平;赵明一;朱平;吴楚漫;周文怡;姜浩东;吴越;彭俊崴;郭惠明;黄焕雷;朱烁基 【作者单位】华南理工大学医学院,广东广州510006;广东省心血管病研究所,广东省人民医院,广东省医学科学院,广东广州510080;中南大学湘雅三医院,湖南长沙410013;华南理工大学医学院,广东广州510006;广东省心血管病研究所,广东省人民医院,广东省医学科学院,广东广州510080;中国科学院广州生物医药与健康研究院,广东广州510530;广东省心血管病研究所,广东省人民医院,广东省医学科学院,广东广州510080;华南理工大学医学院,广东广州510006;广东省心血管病研究所,广东省人民医院,广东省医学科学院,广东广州510080;华南理工大学医学院,广东广州510006;华南理工大学医学院,广东广州510006;广东省心血管病研究所,广东省人民医院,广东省医学科学院,广东广州510080;广东省心血管病研究所,广东省人民医院,广东省医学科学院,广东广州510080;广东省心血管病研究所,广东省人民医院,广东省医学科学院,广东广州510080
人卵巢颗粒细胞的体外培养方法探讨
人卵巢颗粒细胞的体外培养方法探讨
刘玉霞;董静霞;金玉洁;申春艳;徐健
【摘 要】目的 建立人卵巢颗粒细胞分离纯化、体外培养的有效方法.方法 收集体外受精-胚胎移植( IVF-ET) 穿卵时的卵泡液,用胰蛋白酶消化法及密度梯度离心法分离纯化颗粒细胞并用不同培养基进行培养.结果 用体积分数为50 %的 Percoll细胞分离液分离,DMEM/F12或McCoy'5a液体培养基进行培养,细胞纯度高,存活率高,后续生长良好.结论 建立了人卵巢颗粒细胞体外培养的稳定模型,为颗粒细胞的体外研究奠定良好的基础.%Objective To establish effective methods of
purification and culture in vitro of human o-varian granulosa cells.
Methods Human ovarian granulosa cells were obtained in conjunction with
oocyte aspiration from women undergoing hormone treatment for in vitro
fertilization. Cells were treated with trypsin and density gradient
centrifugation, and then cultured with different media. Results Centrifuged
by 50% (v/v) Percoll PLUS, and cultured with DMEM/F12 or McCoy'5a
liquid medium, cells were of great purity, high survival rate, and good
subsequent growth. Conclusion We have established a stable model of
一种新的人胚胎干细胞自身来源的滋养层支持其体外培养
- 1 -一种新的人胚胎干细胞自身来源的滋养层
支持其体外培养1
安世民*，曾桥*，滕祥云，龙志高，李娟，潘乾，邬玲仟，梁德生，夏昆，
夏家辉，张灼华
中南大学医学遗传学国家重点实验室, 长沙（410078）
E-mail: nlmglcy@
摘 要：通过人胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）经体内分化获取间充质干
细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)为人胚胎干细胞提供一种新的滋养层。将约5×106个
hESCs注射入重症免疫联合缺陷小鼠形成畸胎瘤，8周后再从畸胎瘤中分离MSCs并鉴定，
将MSCs作为hESCs的滋养层细胞，并检测和观察hESCs的生长情况、细胞特性和分化能
力。从畸胎瘤中获得了纯度较高的具有类似骨髓来源的MSC特性的细胞群，其形态相似、
表面抗原标志相似(CD34和CD45阴性，CD29、CD49b、CD105、CD73和CD90阳性)，经
诱导可以向成骨细胞和成脂细胞分化。将hESCs在MSCs滋养层细胞上传代培养10代以上，
hESCs依然具有正常的细胞形态，反转录PCR证实其特异转录因子Oct4、Nanog的表达，
干细胞表面标记SSEA-1显示为阴性，SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81显示为阳性，碱性磷
酸酶染色显示为阳性，并且核型正常。体外EB形成和体内畸胎瘤形成证明了其全能性。因
此来源于hESCs本身的MSCs可以被用来作为支持胚胎干细胞生长并维持其未分化状态的
滋养层细胞。
关键词：人胚胎干细胞，间充质干细胞，滋养层
中图分类号：Q2-33
1. 引 言
人胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）来自于早期的囊胚或桑椹胚, 它具
有以下两个最重要的特性：全能性和自我更新能力。该特性使得其在再生医学和器官移植等
早胜牛胚胎和耳缘成纤维细胞分离培养与鉴定
早胜牛胚胎和耳缘成纤维细胞分离培养与鉴定
陈士恩;仝伟建;郭鹏辉
【摘 要】为了建立早胜牛胚胎和耳缘成纤维细胞体外分离培养体系,采用植块法和酶消化法制备这两种组织成纤维细胞.结果显示,用植块法制备了耳缘成纤维细胞,组织块直径较小的成活率较高且生长速度较快；用酶消化法制备了胚胎和耳缘两种组织成纤维细胞,复苏后细胞的存活率:胚胎(96.8％)＞耳(94.7％00).2种组织成纤维细胞生长曲线均呈“S”型,胚胎组织(倍增时间29.7 h)生长速度快于耳组织(倍增时间31.2 h).用免疫组织化学染色鉴定证实,分离培养的成纤维细胞中间丝被染成棕黄色,波形蛋白呈阳性反应.%The embryo and ear marginal fibroblasts in
Zaosheng cattle were isolated and identified in vitro using enzyme
digestion and explant culture. The survival rate of ear marginal fibroblasts
cultured with smaller explant were higher than that with bigger tissue. The
growth curves of the embryo and ear marginal fibroblasts cultured with
enzyme digestion were sigmoid type. The doubling time of embryo
fibroblasts (29. 7 h) was shorter than ear marginal bibroblast (31. 2 h). The
survival rate of defrozen embryo fibroblasts (96. 8%) was higher than that
脐带血间充质干细胞体外分离_纯化及培养
脐带血间充质干细胞体外分离、纯化及培养
陈镭1,惠国桢2,栾文忠1,苗宗宁3,王玲3,陆华3,吴智远2,芦奕2
(1.天津医科大学,天津,300070;2.江苏省无锡市第三人民医院细胞实验室,江苏无锡,214019;3.苏大学附属第一医院神经外科,江苏苏州,215006)
摘要:目的研究脐带血(HUCB)中含有的间充质干细胞(MSCs)体外分离、纯化及培养条件,探究其作为种子细胞应用于实验和临床的可行性。方法无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的MesencultTM作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞层,用流式细胞仪检测MSCs表面抗原。结果来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞,间充质细胞为成纤维样的细胞形态,并表达MSCs相关的抗原(CD29、CD44、CD166),但不表达造血细胞抗原(CD34、CD45),这与源于骨髓的MSCs一致。结论脐带血来源的MSCs能在体外培养、扩增,而用于满足实验和临床的需要。
关键词:脐带血;间充质干细胞;体外培养
中图分类号:R3292文献标识码:A文章编号:16722353(2004)01001203
THEISOLATIONPURIFICATIONAND
CULTUREOFHUCAMSCs
CHENLei,HUIGuozen,RUANWenzong,MIAOZongning,WANGLing,
LUHUA,WUZhiyuan,LULi
(1.TianjinMedicalUniversity,Tianjin,300070;2.CellDepartment,ThirdHospitalofWuxi,Wuxi,Jiangsu,2140001;3.DepartmentofNeurosurgery,FirstAffiliatedHospitalofSuzhouUniversity,Suzhou,Jiangsu,215006)
人脐静脉血内皮克隆形成细胞的分离培养与鉴定
人脐静脉血内皮克隆形成细胞的分离培养与鉴定
周丽;常青;李自成
【期刊名称】《中国医学工程》
【年(卷),期】2013(021)005
【摘 要】目的 体外建立一种简便的人脐静脉血内皮克隆形成细胞(ECFCs)分离培养方法,并对其进行鉴定.方法 无菌条件下收集脐静脉血,以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞(MNCs),诱导分化为ECFCs,倒置显微镜下观察其原代及传代培养细胞生长状况并通过流式细胞仪、免疫细胞化学、荧光双染色对ECFCs进行鉴定.结果 ECFCs培养过程可出现边界清楚的类圆形单层鹅卵石样细胞集落,细胞增殖能力强,连续传十几代细胞形态稳定,ECFCs高表达内皮系细胞表面抗原,而不表达造血系表面标记；可吞噬Dil-ac-LDL并结合FITC-UEA-1.结论 通过简单、可靠的实验方法获得了ECFCs,为进一步探讨其生物学功能及临床应用提供了基础.
【总页数】3页(P7-8,11)
【作 者】周丽;常青;李自成
【作者单位】暨南大学附属第一医院心内科,广东广州510630;暨南大学医学院组织学与胚胎学系,广东广州510632;暨南大学附属第一医院心内科,广东广州510630
【正文语种】中 文
【中图分类】R394.2
【相关文献】 1.人脐血来源CD34+内皮祖细胞的分离、培养、鉴定及集落形成特性 [J], 李国强;刘珍珍;孙晟轩;安广宇;周海斌
2.人脐静脉血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定 [J], 宋显晶;杨萍;刘斌;姜峰
3.人脐血和外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定★◆ [J], 李欢欢;赵丽静;何旭;王娟;刘亢丁
4.人脐血和外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定 [J], 李欢欢;赵丽静;何旭;王娟;刘亢丁;
5.人隐静脉血管内皮细胞的分离、培养及鉴定 [J], 李斌;刘宁
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人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定
人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定
肖建红;张阳春;张常然;杨兴
【摘 要】背景：脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞，在组织工程中比骨髓间充质干细胞具有更多优势，是当今的研究热点之一。 目的：在体外建立一种分离纯化人皮下脂肪来源脂肪干细胞的方法，进行体外培养扩增及诱导其向成骨、成脂细胞分化。 方法：通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。倒置显微镜下观察人脂肪干细胞的细胞形态和生长特性。选取第2代及第5代细胞，用CCK-8法检测细胞活性，绘制细胞生长曲线，用流式细胞仪检测细胞表面抗原标记。选取第5代细胞，分别进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。 结果与结论：①采用密度梯度离心和贴壁培养相结合方法，可成功从人脂肪组织中获得纯度较高的人脂肪干细胞。②人脂肪干细胞经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，符合正常细胞的生长规律，且其生长具有对数生长期，其倍增时间较短。③人脂肪干细胞表达干细胞表面抗原标记，具有低免疫原性，且具有成脂成骨多向分化潜能。④DAPI是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI不损伤细胞活性，对细胞标记率高。%BACKGROUND:Adipose-derived stem cels are a kind of mesenchyam stem cels with multipotent
differentiation capacity, which have more advantages than bone marrow
mesenchymal stem cels in tissue engineering research. OBJECTIVE: To
establish a method to isolate and purify adipose-derived stem cels from
人骨关节炎软骨细胞的体外分离与培养
人骨关节炎软骨细胞的体外分离与培养
魏钰;魏民
【摘 要】背景:大量针对骨关节炎细胞水平的研究仍集中在动物模型关节软骨细胞的体外培养.动物模型引发的退变效应与人骨关节炎的发生并不完全一致.如何利用人骨关节炎软骨组织构建体外细胞模型并研究其特征性蛋白变化趋势,是模拟体内骨关节炎软骨退变过程的关键.目的:探讨人骨关节炎软骨细胞的体外分离、培养方法,观察原代至第3代人骨关节软骨细胞的形态学特性和相关蛋白表达变化.方法:取6例因重度骨关节炎行关节置换术患者的废弃软骨组织(获得中国人民解放军总医院医学伦理委员会批准,伦理批号为S2017-23-7),男2例,女4例;年龄62-72岁,平均(68.3±3.39)岁,采用一步酶消化法(Ⅱ型胶原酶)分离培养人骨关节炎软骨细胞,并进行传代培养,从而构建体外人骨关节炎软骨细胞培养体系.倒置相差显微镜观察各代细胞形态;苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫荧光染色方法进行细胞鉴定.采用Western blot法检测各代软骨细胞于70％融合率时Col2a、Aggrecan与MMP-13的表达.结果与结论:经过Ⅱ型胶原酶消化后,培养1周左右可见组织块周围爬出散在的细胞,3周左右可传代进行下一步研究;形态学、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色与Ⅱ型胶原免疫荧光染色证明培养出的细胞为人软骨细胞.第3代软骨细胞Col2a、Aggrecan的相对表达量与原代比较有明显降低(P<0.01),且随着培养代数增加表达逐渐降低;MMP-13随着培养代数的增加表达逐渐增强(P<0.01).结果表明,Ⅱ型胶原酶一步消化法可成功从标本中分离出骨关节炎软骨细胞并传代培养.体外培养的骨关节炎软骨细胞去分化特性随着传代次数增加而逐渐增强,功能性蛋白表达整体下降.3代以内的软骨细胞符合人骨关节炎时软骨退变的表现,可能是用于实验研究的最佳选择. 【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2019(023)025
新生小鼠皮肤成纤维细胞的分离培养与鉴定
２０１１年１Ｏ月第８卷第２９期 ・专家论坛・
新生小鼠皮肤成纤维细胞的分离培养与鉴定
胡素贤 ，倪晓妍 ，王嘉逊 ，高丰光
１．厦门大学附属第一医院呼吸内科，福建厦门 ３６１００３；２．厦门大学医学院基础医学部免疫学实验室，福建厦门３６１００５
【摘要】目的：建立一种简单易行的自新生小鼠皮肤分离培养成纤维细胞的方法，并对分离细胞进行鉴定。方法：无菌
取新生Ｂａｌｂ／ｃ小鼠背部皮肤，剪碎呈１ ｍｍ 大小，组织块均匀放置于培养皿并以ＤＭＥＭ（含１０％胎牛血清）培养基对
组织块进行培养；以胰蛋白酶消化分离细胞一重新贴壁法对分离培养细胞进行纯化；以ＮＩＨ３Ｔ３细胞为对照，免疫荧
光、流式细胞术、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测波形蛋白表达情况以对培养的成纤维细胞进行鉴定。结果：新生小鼠背部皮肤组
织培养３ ｄ时可见细胞呈细长梭形或呈多角形，组织培养５ ｄ后可见大量细胞自组织块游离生长．组织培养７ ｄ后
可见细胞呈单层漩涡状排列或纵横交错。贴壁细胞团呈放射状生长。免疫荧光、流式细胞术、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测发现
分离细胞和ＮＩＨ３Ｔ３细胞均表达波形蛋白：流式细胞术证实分离的成纤维细胞波形蛋白表达阳性率和平均荧光密
度分别为１３．３３％和９．８９，而ＮＩＨ３Ｔ３细胞波形蛋白阳性率和平均荧光密度分别为２８．１１％和１４．１６。结论：分离培养
的细胞具有成纤维细胞的形态学特征，并表达成纤维细胞的特征分子波形蛋白。以组织块直接培养法成功自新生小
鼠皮肤分离培养成纤维细胞，为建立肿瘤体外模拟微环境提供实验材料和研究基础。
【关键词１新生小鼠；成纤维细胞；体外培养；波形蛋白
【中图分类号１ Ｒ３９２．１ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１６７３—７２１０（２０１１）１０（ｂ）一００５—０４
Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｎｅｗｂｏｒｎ ｍｉｃｅ ｓｋｉｎ
人脂肪来源干细胞的分离、培养及成骨分化的研究
中国实验诊断学２０１３年４月 第１７卷第４期
ｒｏｌ，２００９，２０（９）：１９９７． ［１２］Ｓｕｒｅｎｄｒａｎ Ｋ，ＭｃＣａｕｌ ＳＰ，Ｓｉｍｏｎ ＴＣ．Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｗｎｔ ４ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｆｉ— ｂｒｏｓｉｓ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００２，２８２（３）：４３１． ［１３］Ｐａｔｅｌ Ｓ，Ｄｏｂｌｅ Ｂ，Ｗｏｏｄｇｅｔｔ ＪＲ．Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ一３ ｉｎ ｉｎ— ｓｕｌｉｎ ａｎｄ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ：ａ ｄｏｕｂｌｅ—ｅｄｇｅｄ ｓｗｏｒｄ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ，２００４，３２（Ｐｔ５）：８０３． ［１４］Ｂｅｕｒｅｌ Ｅ，Ｊｏｐｅ ＲＳ．Ｔｈｅ ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ ｐｒｏ—ａｎｄ ａｎｔｉ—ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｃｔｉｏｎｓ
文章编号：１００７—４２８７（２０１３）０４—０６３９—０５ ６３９一
ｏｆ ＧＳＫ３ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｎｄ ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈ ｗａｙｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，２００６，７９（４）：１７３． ［１５］Ｂｒｕｄｅｒ Ｅ，Ｍｏｃｈ Ｈ，Ｅｈｒｌｉｃｈ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｎａｌ ｙｓｉｓ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ， ２００７，２０（１２）：１２１７． （收稿日期：２０１２—０５—２４）
人脂肪来源干细胞的分离、培养及成骨分化的研究
赵 强 ，吕 爽 ，翟颖仙。，高振平。，石英爱。
（吉林大学ｌ＿第一临床医院儿外科，吉林长春１３００２１；２．白求恩医学院病理生物学教育部重点研究室； ３．白求恩医学院解剖教研室）
摘要：目的体外分离、培养、扩增及鉴定人脂肪来源干细胞（ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｈＡＳＣｓ），并向成 骨诱导分化，为临床骨组织重建提供种子细胞。方法应用胶原酶消化法和贴壁筛选法相结合从人手术切除的脂肪 组织中提取ｈＡＳＣｓ。ＭＴＳ法绘制ｈＡＳＣｓ生长曲线；利用流式细胞术检测ｈＡＳＣｓ表面标志；以低糖ＤＭＥＭ含１Ｏ