人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定
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作者：马英智 张丽红 孙梅 李玉林
【摘要】 目的 对人真皮成纤维细胞(hFbs)进行分离培养及鉴定，为组织工程复合皮肤的构建提供种子细胞。方法 利用组织块培养法、消化传代纯化培养hFbs，通过细胞形态的观察及免疫细胞化学、流式细胞术等方法对其进行鉴定。结果 经组织块培养法获得的细胞可以传代培养，从P1代到P6代细胞形态保持一致，呈纤维细胞样生长;免疫细胞化学检测可见波形蛋白(vimentin)呈阳性反应，通过流式细胞术检测P3及P6代的细胞vimentin阳性表达量均达到95%以上，角蛋白15(cytokeratin 15)呈阴性表达。结论 成功建立体外稳定培养hFbs的方法，为组织工程皮肤的研究提供了理论与实验基础。
【关键词】 成纤维细胞;分离;培养;鉴定
【Abstract】 Objective To explore a method of the
isolation, culture and identification of human fibroblasts
(hFbs) in vitro for the provision of seed cells in tissue
engineering skin. Methods The cells were cultured and expanded
and observed under phase contrast microscope, and they were
identified with immunocytochemistry and flow cytometry
(antivimentin, cytokeratin 15). Results With phase contrast
microscope, the cells were observed to uniformed population of
cells and fibroblastlike. Immunocytochemistry and flow
cytometry showed all cultural cells were fibroblasts (positive 文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编辑,有帮助欢迎下载支持.
1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑. for vimentin, negative for cytokeratin 15). The cells were
subcultured 6 generations. Conclusions A method for isolating
and culturing hFbs in vitro is established successfully.
【Key words】
Fibroblasts;Isolation;Culture;Identification
成纤维细胞是构成皮肤真皮的主要细胞，其正常的增殖、分化维系着皮肤正常的结构和生理功能。本实验旨在探索一种简单、高效分离培养人真皮成纤维细胞(human fibroblasts，hFbs)的技术方法，为进一步利用组织工程学构建复层皮肤奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 DMEM/F12(Gibco)，优等胎牛血清，DispaseⅡ(Roche)，胰蛋白酶(Sigma)，Triton X100(Sigma)，鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(Santa)，兔抗人角蛋白15单克隆抗体(Abcam)，免疫组化SP试剂盒(迈新)，DAB显色液(迈新)，FITC标记的抗鼠和抗兔IgG(北京中杉)。
1.2 hFbs的分离培养
1.2.1 原代培养 取包皮环切术的正常皮肤组织，用含青链霉素的PBS冲洗3次，尽量去除皮下结缔组织;将皮肤剪成小块，真皮面朝下平铺于平皿中，加入DispaseⅡ4℃条件下过夜;次日分离表皮真皮，将真皮剪切成小块，接种于35 mm培养皿中，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养1 h，加入少量含10%优等胎牛血清的DMEM/F12(3∶1)，次日加入足量培养基继续培养，以后每3 d换一次液。 文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编辑,有帮助欢迎下载支持.
1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑. 1.2.2 传代 用0.25%胰酶0.02%EDTA消化约1 min，在显微镜下观察细胞回缩变圆、细胞间隙增大后，加入含10%优等胎牛血清的DMEM/F12(3∶1)终止消化，用吸管吹打细胞，以1∶3比例传代培养。
1.3 形态学观察 利用倒置相差显微镜观察细胞生长情况及形态变化。
1.4 免疫细胞化学 取爬片的P6代细胞，PBS清洗3次，4%多聚甲醛室温固定20 min;PBS清洗，0.1%Triton X100孵育10
min;3%的过氧化氢室温阻断20min;PBS清洗，血清覆盖20 min;稀释度为1∶100的鼠抗人波形蛋白(Vimentin)一抗和兔抗人角蛋白(Cytokeratin，CK)15一抗4℃过夜;PBS清洗，加入二抗室温孵育30
min;PBS清洗后加DAB，苏木素复染;同时用PBS代替一抗作阴性对照，显微镜下观察照相。
1.5 流式细胞术 用0.25%胰酶0.02%EDTA消化收集P3和P6代细胞，使其细胞数为2×105个/每例样本;PBS清洗，0.1%Triton
X100室温10 min;PBS清洗，用稀释度为1∶50的鼠抗人Vimentin一抗和兔抗人CK 15一抗常温下孵育30 min;PBS清洗，加入稀释度为1∶50的FITC标记的抗鼠和抗兔的IgG为二抗，4℃避光孵育30
min;PBS清洗2次，加入400 μl PBS重悬细胞用于FACS分析。 2
结 果
2.1 形态学观察 利用倒置相差显微镜观察培养不同阶段的细胞形态，原代培养3 d后，可见有细胞从组织块周围爬出，细胞呈文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编辑,有帮助欢迎下载支持.
1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑. 纺锤状，如纤维细胞样生长。第7～10天时可见大量细胞生长，呈鱼群样。见图1。传代培养的hFbs生长旺盛，3～4 d达到汇流，形态与原代相似、更加趋向一致。细胞呈长梭形，核呈椭圆形，可见1～2个核仁。本实验中hFbs可传代培养至11代，其形态及生长特点无明显改变。
2.2 免疫细胞化学 免疫细胞化学结果显示P6代hFbs中胞浆染成深棕色，见图2。Vimentin呈阳性，CK 15呈阴性表达。
图1 原代培养第10天(×4)图2 免疫化学染色(×20)
2.3 流式细胞术 通过流式细胞术检测hFbs的标志，经3代以上传代后，细胞成分均一，Vimentin阳性细胞占总数的95%以上，具有较高的纯度;CK 15阳性细胞占总数的4%以下，为阴性表达。
3 讨 论
组织工程是在20世纪80年代正式提出来的一个新概念，综合应用工程学和生命科学的基本原理、基本理论和基本技术将分离培养的高密度功能细胞接种在可降解的三维支架材料上，其中种子细胞的研究是组织工程众多研究领域中最基础、也是最重要的环节〔1〕。由于成纤维细胞具有较强的分裂、增殖能力，适应性强，易培养、性状稳定，而且还能分泌一些细胞因子和细胞外基质成份，可促进表皮细胞的增殖、移动与成熟，在调节表皮细胞形态及真皮重组方面起重要作用〔2〕。因此，成纤维细胞在构建组织工程皮肤中起着至关重要的作用。本实验的远期目标是构建组织工程复合皮肤，而建立一种简单、高效分离培养hFbs的技术方法是最基本的。采用组织块培养法进文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编辑,有帮助欢迎下载支持.
1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑. 行原代培养，方法简单、时间短，3 d即可见有hFbs从组织块中爬出;实验过程使用的基本培养基是在人表皮干细胞培养中使用的DMEM/F12(3:1)培养基，细胞在此培养基中生长旺盛，增殖能力强，可在短期内获得足够量的细胞。通过免疫细胞化学和流式细胞仪的方法检测，经过传代3次以上所获得的hFbs高表达相对特异的标记物Vimentin，而不表达表皮细胞中相对特异表达的角蛋白〔3〕。经过连续几次传代培养后，可得到纯度较高的成纤维细胞，为组织工程皮肤的研究打下了坚实的基础。另外，真皮成纤维细胞的改变在皮肤衰老过程中起着重要的作用〔4〕，获得hFbs也可为今后皮肤美容方面的研究提供实验基础。
【参考文献】
1 杨志明.组织工程学〔M〕.北京：化学工业出版社，2002：7.
2 Ghalbzouri A，Lamme E，Ponee M.Crueial role of
fibroblasts in regulating epidermal morphogenesis〔J〕.Cell
Tissue Res，2002;310:18999.
3 Lyle S，Christofidou SM，Liu Y,et al.Human hair
follicle bulge cells are biochemically distinct and possess an
epithelial stem cell phenotype〔J〕.J Investig Dermatol Symp
Proc,1999;4(3)：296301.
4 赵 辨.临床皮肤病学〔M〕.南京：江苏科学技术出版社，2001：38.
芥子气促进真皮成纤维细胞分泌IL-10的时效和量效研究
芥子气促进真皮成纤维细胞分泌IL-10的时效和量效研究
田泾;陆坚;杨积顺;胡晋红
【摘 要】目的:探讨芥子气诱导真皮成纤维细胞分泌IL-10的规律.方法:采用ELISA方法,检测不同浓度梯度的芥子气调节IL-10分泌的量效和时效关系.结果:成纤维细胞自身可分泌一定量的IL-10,芥子气作用成纤维细胞后,显著上调IL-10的分泌(P<0.05).并呈时间依赖性和剂量依赖性.结论:芥子气治疗银屑病的作用机制可能与促进细胞分泌抗炎因子IL-10有关.
【期刊名称】《药学实践杂志》
【年(卷),期】2009(027)003
【总页数】3页(P177-178,188)
【关键词】芥子气;真皮成纤维细胞;IL-10;银屑病
【作 者】田泾;陆坚;杨积顺;胡晋红
【作者单位】第二军医大学研究生管理大队,上海200433;第二军医大学研究生管理大队,上海200433;第二军医大学长海医院药学部,上海200433;第二军医大学长海医院药学部,上海200433
【正文语种】中 文
【中图分类】R986
银屑病是一种T细胞引发并维持的自身免疫性疾病[1]，病人机体免疫系统紊乱，健康细胞受到攻击，导致临床上各种形态的皮肤红斑鳞屑性炎症病变。银屑病全层皮肤均存在异常，真皮成纤维细胞在银屑病发展中扮演重要的调节作用。芥子气(sulfur mustard，SM)的化学名为“二氯二乙硫醚”，对皮肤有较强的渗透性。芥子气霜(1:10 000)，作为一种疗效确切的治疗银屑病的常用经典药物，在我校长海医院曾有多年的应用历史，临床经验证明：对银屑病症状及机体炎性状态的改善发挥了重要的作用。但其治疗机制尚不清楚。实验证实：当芥子气浓度<500
μmol/L时，对人体表皮细胞是没有毒性的[2]。本文将研究芥子气对真皮成纤维细胞分泌IL-10的影响，进而为研究芥子气治疗银屑病的机制做贡献。
单道数字可调微量移液器(日本NICHIRYO公司)，流式细胞计数仪(FACSCAN) 胶原酶(CLS-1,Worthington Biochemical Corp.)；分散酶(AMRESCO)；胰蛋白酶(tissue culture grade，AMRESCO)；小牛血清(GIBCO)； DMEM(high glucose,
高浓度葡萄糖对成纤维细胞增殖活性的影响
高浓度葡萄糖对成纤维细胞增殖活性的影响
陈代勇
【期刊名称】《内蒙古中医药》
【年(卷),期】2013(032)023
【摘 要】目的:探讨成纤维细胞在高浓度葡萄糖环境中的增殖活性.方法:分离培养人真皮成纤维细胞,传代后分别用含不同高浓度葡萄糖的DMEM培养基培养,在不同时段进行细胞记数并用流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:随着葡萄糖浓度的增高,成纤维细胞的增殖数量明显减少,凋亡细胞比例显著增加.结论:高浓度葡萄糖对成纤维细胞的增殖活性可能有抑制作用.
【总页数】2页(P36-37)
【作 者】陈代勇
【作者单位】贵阳中医学院基础医学院机能实验室,550002
【正文语种】中 文
【中图分类】R965
【相关文献】
1.氟对成纤维细胞增殖活性影响的剂量-效应关系2.高浓度葡萄糖对培养兔角膜上皮细胞增殖活性的影响3.高浓度葡萄糖对人牙周膜成纤维细胞成骨分化能力的影响4.强脉冲光对成纤维细胞及血管内皮细胞增殖活性及血管内皮细胞生长因子分泌水平的影响5.丹酚酸A对心肌成纤维细胞在高浓度葡萄糖刺激下Wnt信号通路的影响 因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买
人表皮干细胞的分离培养
人表皮干细胞的分离培养
【摘要】 目的 探索人表皮干细胞原代培养方法。方法 将皮肤标本进行分离， 用DispaseⅡ酶消化表皮皮片后， 重悬细胞， 接种于铺有Ⅳ型胶原的培养瓶进行培养。表皮干细胞的鉴定采用免疫细胞化学技术检测其表面标记物β1整合素、CK19的表达。对表皮干细胞与角质形成细胞的克隆形成情况进行比较。结果 倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况良好， 表皮干细胞β1整合素及CK19角蛋白染色阳性。表皮干细胞克隆形成率高于角质形成细胞（P＜0.05）。结论 采用本方法进行人表皮干细胞的培养较为理想。
【Abstract】 Objective The present research was performed to find primary cell
culture method of human epidermal stem cells. Methods The skin samples were
isolated by Dispase Ⅱ， the cells were seeded in culture flask which was dealed with
type IV collagen. The epidermal stem cells were identified by immunocytochemical
technique for the detection of integrin β1 and CK19. The cell clone formation of
epidermal stem cells and keratinocyte were compared. Results Cell morphology was
observed under microscope and good growth status inverted， epidermal stem cells
成纤维细胞
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成纤维细胞
科技名词定义
中文名称：
成纤维细胞
英文名称：
fibroblast
定义：
普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。分泌前胶原、纤连蛋白和胶原酶等细胞外基质成分，伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。
所属学科：
细胞生物学（一级学科）；总论（二级学科）
本内容由全国科学技术名词审定委员会 审定公布
百科名片
疏松结缔组织中的成纤维细胞
成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由 胚胎时期的
间充质细胞(mesenchymalcell) 分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，
多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其 细胞核呈规则的卵圆形，核仁 WORD格式
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大而明显。 根据不同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和 纤维
细胞，成纤维细胞功能活动旺盛， 细胞质弱嗜碱性，具明显的 蛋白质合成
和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维
细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分
重要的作用。
目录
细胞的功能活动状态划分
来源
特征
创伤修复
分离培养
原代培养
展望
展开
编辑本段
细胞的功能活动状态划分 WORD格式
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根据不同的功能活动状态，将细 胞分为成纤维细胞和纤维细胞二
型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞，细 胞和细胞核较大，轮 廓
清楚，核仁大而明显，细 胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌
活动；纤维细胞（ fibrocyte）功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核
小着色深，核仁不明显，细胞质少。此二型细胞可互相转化。 [1]
骨骼肌成纤维细胞分离培养
骨骼肌成纤维细胞分离培养
骨骼肌成纤维细胞（skeletal muscle fibroblasts）的分离和培养是一种常用的实验技术，用于研究骨骼肌相关的生物学过程以及肌肉疾病等。
以下是骨骼肌成纤维细胞分离培养的一般步骤：
1.准备离体骨骼肌组织。从小鼠或人的骨骼肌中取出组织，最好是新鲜组织以确保细胞的活力。
2.组织消化。将骨骼肌组织切成小块，用胶原酶或胰蛋白酶等消化酶进行消化，使细胞从组织中释放出来。
3.细胞筛选。通过过筛网或离心的方式将消化后的细胞悬浮液筛选，去除大部分的纤维束和其他细胞类型。
4.细胞培养。将筛选后的细胞悬浮液转移到培养皿中，添加含有合适培养基和补充物的培养液，将培养皿放置在适当的培养箱中。
5.培养条件。骨骼肌成纤维细胞通常在37°C的孵育箱中，与5%
CO2的空气保持湿润的环境中培养。
6.细胞生长和传代。骨骼肌成纤维细胞会在培养皿中黏附并开始增殖。当细胞达到一定密度时，可以进行传代，将细胞分离并分散到新的培养皿中。
需要注意的是，分离和培养骨骼肌成纤维细胞需要一定的实验技巧和设备，以保证细胞的存活和生长。同时，细胞的培养基选择和培养条件的控制也对细胞的生长和功能有重要影响。因此，在进行这项技术时，需要按照具体实验要求和相关文献中的方法进行操作。
人外周血内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定
１３１８ 中国美容医学２０１２年８月第２１卷第８期（上１ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ａｕｇ．２０１２．Ｖｏ１．２１．Ｎｏ．８
射脱毛小鼠背部分皮肤，按照射能量密度和微孔密度高、中、
低组合，理论上有９个组合方案，如果按每个组合方案治疗
２Ｏ例患者×５次（月）推算，临床研究可能约需３年时间。为
缩短研究周期和为临床应用提供理论参考，本组实验在９个
组合方案中选择了３个具有一定代表性的组合方案（高能量
密度／高微孔密度、高能量密度／低微孔密度和中能量密度
／高微孔密度）进行筛选优化。结果显示在照射８次后各照
射组小鼠真皮厚度、成纤维细胞计数、胶原纤维和弹力纤维
均增加，增加幅度以高能量密度／高微孔密度组＞高能量密
度／低微孔密度组＞中能量密度／高微孔密度组，并且各照
射组间与未照射对照组间均有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０１），这与
Ｗａｌｇｒａｖｅ和Ｋｏｎｏ￣ 们的研究结果相似。
除弹力纤维外，本实验未发现各照射组真皮厚度、成纤维
细胞计数和胶原纤维随时间变化趋势，分析其原因，我们初步
认为可能与真皮炎性水肿吸收、成纤维细胞和胶原纤维代谢
较快，而弹力纤维代谢较慢和初次取材时间较晚等因素有关。
本实验结论提示：①ｌ ５５０ｎｍ铒玻璃点阵激光治疗光老
化及嫩肤疗效肯定、可靠，如果停止治疗后其疗效有可能维
持数月仍不会反弹至术前水平；②治疗参数的选择建议在采
用较高能量密度基础上适当提高微孔密度更有利于提高临
床疗效；⑨虽然昆明小鼠皮肤较薄，与人类皮肤组织存在一
定差异，但本结论对铒玻璃点阵激光治疗皮肤光老化和嫩肤
的参数选择仍具有一定参考价值。
［参考文献］
【１］Ｍａｎｓｔｅｉｎ Ｄ，Ｈｅ￣ｏｎ Ｇ，Ｓｉｎｋ ｅｔ ａ１．Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｓ：Ａ ｎｅｗ ｃｏｎｃｅｐｔ ｆｏｒ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｔｈｅｒｍａｌ ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．Ｌａｓｅｒｓ Ｓｕｒｇ Ｍｅｄ，２００４，３４（５）：４２６—４３８． 【２】张淑兰，应朝霞，王永贤．非剥脱性点阵激光在皮肤科的应用四．中国
应用胶原蛋白构建组织工程皮肤的实验研究
第１９卷 第３期 ２００７年 菏泽医学专科学校学报
ＪｏＵＲＮＡＬ ｏＦ ＨＥＺＥ ＭＥＤＩＣＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ ＶＯＬ．１９ Ｎｏ．３ ２００７
应用胶原蛋白构建组织工程皮肤的实验研究
孙文娟①，陆景华，蔡霞 ，唐胜建 （青岛经济技术开发区第一人民医院，山东 青岛 ２６６５５５； 潍坊医学院整形外科研究所）
摘要： 目的探讨以胶原蛋白为支架构建组织工程皮肤的体外培养理想方法。方法体外分离、培养、
鉴定角朊细胞和成纤维细胞；利用本室自制胶原蛋白，制备胶原凝胶和胶原海绵两种组织工程支架；在成功构 建人工真皮的基础上，种植角朊细胞，构建人工复合皮肤，并进行组织学及免疫组化检查。结果制备的胶原
海绵孔径平均１００ １５０￣ｍ，孔隙率８９％，组织相容性良好；两种皮肤替代物免疫组化染色显示Ⅳ型胶原、纤维
连接蛋白（ＦＮ）和层粘连蛋白（Ｌａｍｉｎｉｎ）阳性，ＨＥ染色可见均具有表皮和真皮双层结构，厚度约３ｍｍ，在形态 结构上与正常皮肤相似。结论培养的人角朊细胞和成纤维细胞种植于胶原蛋白支架上气一液界面培养可构
建出具有类似天然皮肤结构的组织工程皮肤。
关键词： 细胞培养；胶原蛋白；胶原支架；组织工程皮肤 中图分类号：Ｑ５１；Ｒ３１８文献标识码：Ａ文章编号：１００８—４１１８（２００７）０３—００１０—０３
烧伤、创伤等各种原因造成的大面积皮肤缺损是 行免疫细胞化学染色。
临床常见病、多发病，但在皮肤移植中，自体供皮不足 １．２胶原蛋白的提取及鉴定 酸溶解法提取鼠尾 是导致皮肤缺损患者得不到及时治疗的根本原因。 胶原，以聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）检测提
我国每年仅因烧伤而需做皮肤移植的就达百万之多。 取物的相对分子质量，紫外分光光度计鉴定提取的胶
随着组织工程学的发展，人们开始应用细胞生物学、 原，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度 分子生物学和工程学的原理和技术体外培育皮肤替 １．３胶原支架及人工真皮的构建
比较两种酶消化法对真皮成纤维细胞的影响
比较两种酶消化法对真皮成纤维细胞的影响
郭吉安;余丕军;王露萍;石莹莹;柳逸;陈炜
【摘 要】背景:目前真皮成纤维细胞研究应用广泛、需求量大、分离方法多,但是用于细胞分离培养的酶消化法尚未有对比研究.目的:比较两种酶消化方法分离的真皮成纤维细胞的细胞产量、形态、迁移、增殖4个方面的差异.方法:分别使用中性蛋白酶+胶原酶或胰蛋白酶分离消化真皮成纤维细胞,并进行细胞计数,原代培养并观察细胞形态学差异,采用细胞划痕实验观察细胞迁移能力并使用CCK-8检测细胞增殖活力.结果与结论:①采用中性蛋白酶+胶原酶消化的成纤维细胞在接种后六七天后融合,通过胰蛋白酶消化分离的成纤维细胞在八九天后融合,两种酶消化法都可获得真皮成纤维细胞;②与胰蛋白酶消化组相比,中性蛋白酶+胶原酶消化组的细胞产量显著增加;③划痕实验结果显示,胰蛋白酶消化的真皮成纤维细胞迁移速度较中性蛋白酶+胶原酶消化的细胞显著减慢;④两种酶消化方法分离的真皮成纤维细胞生长曲线均显示细胞数与培养时间呈正相关关系,在第3,4和5天,中性蛋白酶+胶原酶组的成纤维细胞的吸光度均显着高于胰蛋白酶组细胞的吸光度;⑤结果表明,与胰蛋白酶消化相比,用中性蛋白酶+胶原酶消化的细胞产量、迁移、增殖能力均更高;提示中性蛋白酶+胶原酶消化法优于胰蛋白酶消化法.%BACKGROUND: Dermal
fibroblasts are widely used and demanded, and there are various isolation
methods, but no comparative studies on enzyme digestion methods are
reported. OBJECTIVE: To compare the cell count, morphology, migration
and proliferation of human dermal fibroblasts isolated by two enzyme
人正常食管黏膜上皮细胞的纯化分离和传代培养
人正常食管黏膜上皮细胞的纯化分离和传代培养
【摘要】 目的： 探讨新的食管黏膜细胞的培养方法，以便能够获得大量细胞. 方法： 采用中性蛋白酶和胰酶先后消化从食管黏膜上分离上皮细胞，比较细胞在无血清培养基和含100 ml/L胎牛血清的培养基中的细胞生长曲线和贴壁性；采用细胞角蛋白14、13 (CK14, CK13)和波形丝蛋白抗体三者共同鉴定细胞. 结果： 细胞倍增时间在KSFM中为h (n=3)，而在含100 ml/L血清培养基中不能计算；在KSFM中，贴壁细胞明显为高；CK14阳性细胞百分率KSFM组在不同时段均高，但两组内均随生长时间增加而减少；CK13阳性细胞则恰与其相反；两组中均未见波形丝蛋白阳性表达. 结论：
Dispase消化分离细胞， KSFM作为培养基是食管鳞状上皮可靠的新培养方法.
【关键词】 食管；上皮细胞；细胞培养
0引言 目前食管黏膜的传代培养，就报道的极少的几种方法还存在着很多问题，比如大量的成纤维细胞污染［1］，不能传代扩增或传代次数较少［2］，细胞数量较少. 我们通过改善原代取材时消化方法，进行含血清及不含血清培养基比较研究，探讨出能获得大量细胞的新的正常食管黏膜细胞的培养方法.
1材料和方法1材料
人角朊细胞培养液， 胰酶,
DMEM(Hyclone), Dispase (Gibco)，胎牛血清. SP免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，单可隆抗体细胞角蛋白14、13和波形丝蛋白(vimentin)抗体购自上海长岛生物有限公司. 从3例新鲜食管手术标本上选取正常黏膜标本，浸入4℃ PBS中，当日即进行原代培养. 标本获取均经患者同意，并签订同意书.
方法
将食管黏膜组织放入添加20万u/L青霉素、200 mg/L 链霉素和 g/L庆大霉素的PBS中充分洗涤到无血迹后，洗必泰消毒，后依次采用如下方法消化分离获取黏膜细胞. 4℃条件下标本在 g/L 中性蛋白酶中消化18~24 h后，用眼科镊将黏膜层撕下，放入 g/L胰酶中，37 ℃消化5～10 min. 其后加入等量的含100 mL/L胎牛血清的DMEM终止消化，吹打，成单细胞液，离心，PBS清洗后接种. 静置于37℃，50 mL/L CO2培养箱中，24~48 h后观察细胞贴壁情况，弃取原培养基，其中含未贴壁细胞，加入新鲜培养基后继续培养. 上皮细胞铺满培养皿底的75%，加EDTA的 g/L胰酶消化后可传代. 设无血清培和含血清两种培养基进行对照观察［3,4］. 无血清者成分为：KSFM，每500 mL含 mL牛垂体提取物, g L谷氨酰胺, 3 μL 生长因子; 含血清者在前者的基础上加入100 mL/L胎牛血清，其余成分相同. 余实验方法和实验条件相同. 为结果有可比性，本实验中接种细胞均为在KSFM中生长的细胞. 选取第2代细胞，24孔板接种，观察7 d，绘制两种培养基中细胞的生长曲线. 按最适密度接种，计算两组原代接种后48 h，第1代接种后24 h贴壁细胞数. 选取KSFM中为计算生长曲线而消化下的细胞，以1×104个/cm2重新接种，培养基为KSFM，24 h后将已经贴壁的细胞胰酶消化，并计数. 计算贴壁细胞百分比，观察不同生长时段细胞的贴壁能力. 细胞生长在载玻片上, 用650 mL/L冷丙酮固定20 min, 细胞免疫组化法检测两不同培养基组第2代接种后1, 3, 5, 7 d的细胞CK14, CK13及波形丝蛋白的表达情况. 实验步骤中不加一抗改加PBS为空白对照. 采用如下方法进行半定量比较：在显微镜下，计算相邻20个视野内的阳性细胞，计算阳性细胞百分率.
组织工程构建成纤维细胞-PGA真皮替代物实验论文
组织工程构建成纤维细胞/PGA真皮替代物的实验研究
【摘要】目的 通过将真皮成纤维细胞接种pga（polyglycolicacid）支架材料，观察细胞材料的生物相容性和构建组织工程化真皮的组织形态结构。方法小儿包皮真皮中分离的成纤维细胞，进行传代扩增，观察不同代次细胞体外增殖能力。将成纤维细胞以20million/ml的浓度接种pga支架材料上。相差显微镜和扫描电镜观察细胞材料粘附情况，h.e.染色对其进行组织形态观察。结果 体外扩增培养的第4代、第5代、第6代细胞具有相同的生长特性。相差显微镜和扫描电镜观察细胞在材料上生长良好，分泌细胞外基质丰富，并随时间进展，细胞逐渐融合，细胞外基质分泌逐渐增多。h.e染色观察成纤维细胞均匀分布于真皮替代物中。结论 真皮成纤维细胞与pga支架材料细胞相容性好。通过真皮成纤维细胞接种pga支架材料，能够有效构建组织工程化真皮组织。
【关键词】组织工程 真皮 成纤维细胞 pga
中图分类号：r318文献标识码：b文章编号：1005-0515（2011）10-054-02
近年来，组织工程学取得了长足发展，显现出其在临床各个领域广阔的应用前景。组织工程化皮肤使大面积烧伤和慢性皮肤溃疡等的治疗方法有了新的选择[1]。组织工程学是一门以细胞生物学和材料学相结合，进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科
[2]。组织工程种子细胞是否来源广泛和良好的体外扩增能力和组
织工程支架材料是否具备生物可降解性和生物可吸收性，是体外构建组织工程化产品的关键因素[3]。本实验中，应用真皮成纤维细胞作为组织工程种子细胞，应用pga支架材料作为组织工程支架材料，构建成真皮替代物。观察不同代次细胞体外增殖能力。检测种子细胞的生长动力学，对于细胞在支架材料上生长情况及其组织形态进行观察。