小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养
原代细胞分离与培养，你都掌握了吗？
原代细胞分离与培养，你都掌握了吗？导语对于⼤部分科研⼈员来说，研究中⼀般⽤到均是现成的细胞系/株，我们只需要：进⾏细胞传代和保种。
然⽽，这些细胞系常常由于体外长期培养，⽽丢失原有⽣物学特性，对药物处理的反应差距越来越⼤。
因此，原代细胞的地位⽇渐凸显，Paper中若有了原代细胞的数据都会添⾊不少。
然⽽，就⼩编亲⽣经历，原代细胞分离着实是个技术活，今天我们就结合⾃⾝经验，为⼤家介绍：肿瘤组织和正常组织的原代细胞的分离与培养⽅法。
第⼀部分：原代细胞的基本知识1. 什么是原代细胞培养?原代细胞（Primary cells）：是指直接从机体取出的组织或细胞获得单个细胞并在体外进⾏培养的细胞。
这⾥的组织主要指：组织器官、外周⾎及胚胎等。
原代细胞培养：由于原代细胞⽣长缓慢，繁殖⼀定的代数停⽌⽣长（⼀般10代以内）。
所以⼀般认为：培养的原代的第1和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。
2. 原代细胞与细胞系（cell lines）的区别原代细胞和细胞系的⽐较：Primary cells Cell lines增殖能⼒较弱强繁殖代数⼀般只能传10代以内⽆限增殖，50代左右遗传物质完整性遗传物质未改变遗传物质发⽣改变⽣物特性最接近临床样本偏离临床样本培养容易程度⽐较复杂简单，易操作原代细胞和细胞系的⽐较3. 原代细胞的应⽤由于原代细胞⽣物学特性未发⽣很⼤改变，最接近和反映体内⽣长特性，因此是：(1) 研究⽣物体细胞的⽣长、代谢、繁殖提供有⼒的⼯具；(2)更好实现精准医疗的肿瘤诊治模式，实现个体化精准⽤药的⽬的。
第⼆部分：原代细胞分离和培养技术原代培养的原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常⽤胰蛋⽩酶/胶原酶)、螯合剂(常⽤EDTA)或机械⽅法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以⽣存、⽣长和繁殖，这⼀过程称原代培养。
主要包括取材——分离——培养等3部分；在原代细胞应⽤较多的包括：组织器官（如实体瘤、⽪肤等）、悬浮细胞的取材等。
EPCs分离、培养、鉴定
小鼠内皮祖细胞的分离、培养和鉴定一、小鼠外周循环血的采集⑴材料：穿刺针- 6号注射针头，1ml注射器（麻醉用），解剖板、无菌离心管，消毒酒精，外科剪刀，止血钳，镊子，无菌纱布若干，10％水合氯醛，肝素。
⑵方法：腹主动脉穿刺采血法①健康的昆明小鼠，20-25g，经腹腔注射10％水合氯醛(0.3mL／100g)麻醉5分钟，无菌条件下将大鼠仰卧固定于手术台上，酒精消毒皮肤后,沿腹中线自耻骨上至胸骨下剪开皮肤与腹膜。
②在切口两端向左右各横剪一刀,直达腹侧壁,将腹壁翻向左右两侧,充分暴露腹腔。
术者用右手食指自左向右轻轻推移肠管显露出腹后壁,清除腹膜后脂肪组织,即可于脊柱前清晰见到腹主动脉与腹主静脉。
③仔细辨识腹主动脉（色粉红、有光泽、较细）分成左右骼动脉处,在此分叉处之向心端处为最佳穿刺点。
④持穿刺针朝向心端方向刺入,入针角度约30°，深度5mm左右,当阻力骤减时, 以预先用肝素湿润过的无菌注射器抽吸血液，然后移入预先以肝素湿润过的无菌离心管中.⑶操作技巧：①麻醉过深取血过程中心跳可能停止,会减少血量；过浅,动物躁动影响操作,此时可放乙醚棉球在其口鼻处作补充麻醉。
②穿刺针尖斜面朝下,进针迅速,否则会有血液溅出。
若穿透动脉或穿刺针脱出,可用止血钳夹住动脉,以纱布吸尽视野血液后,沿向心端移数毫米,再行穿刺。
二、EPC的分离和培养⑴材料：①试剂：1×PBS液, 小鼠淋巴细胞分离液（Histopaque-1083-1， sigma 公司),M199培养基（Hyclone公司），纤维连接蛋白（北京博奥森生物技术有限公司）。
②预先准备：无菌移液管、微量加样器，离心管、毛细管、培养皿，常温离心机，计数板，培养皿，倒置显微镜。
⑵方法：密度梯度离心法①在收集的外周循环血中加入等量1×PBS液混匀，使之成为单个核细胞悬液，准备好一支含3ml Histopaque-1083-1液的容积为15ml的无菌离心管（也可以2：3比例加入，须实验时具体尝试），将单个核细胞悬液缓缓平铺在分离液上。
成纤维细胞
成纤维细胞科技名词定义中文名称：成纤维细胞英文名称：fibroblast定义：普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。
分泌前胶原、纤连蛋白和胶原酶等细胞外基质成分，伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。
所属学科：细胞生物学（一级学科）；总论（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布百科名片疏松结缔组织中的成纤维细胞成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。
成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。
根据不同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。
成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。
目录编辑本段细胞的功能活动状态划分根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动；纤维细胞（fibrocyte）功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核小着色深，核仁不明显，细胞质少。
此二型细胞可互相转化。
[1]编辑本段来源成纤维细胞：数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清。
成纤维细胞摄取所需的氨基酸，如脯氨酸和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成前α多肽链（proalpha polypeptide chain），多肽链输送到高尔基复合体后，组成前胶原分子（procollagen）。
前胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞外。
在前胶原肽酶催化下，将每一前α多肽链的尾段除去，成为原胶原分子（tropocollagen）。
小鼠肾成纤维细胞 鉴定 vimentin-概述说明以及解释
小鼠肾成纤维细胞鉴定vimentin-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容主要是对小鼠肾成纤维细胞的研究背景和意义进行简要介绍。
可以根据以下内容进行编写：概述小鼠肾成纤维细胞是一类重要的细胞类型，广泛存在于小鼠肾脏组织中，并在多种生理和病理过程中发挥着重要的作用。
这些细胞具有独特的表型和功能，可以通过特定的鉴定方法来准确识别。
近年来，随着生物学研究和生物医学领域的发展，对小鼠肾成纤维细胞的鉴定与研究引起了广泛的关注和研究兴趣。
通过对小鼠肾成纤维细胞的鉴定，我们可以深入了解其表型和功能特点。
首先，可以通过特定的细胞标记物如vimentin进行免疫细胞化学染色，从而确认其在组织中的定位和分布情况。
其次，通过研究小鼠肾成纤维细胞的特征和功能，可以了解其参与肾脏发育、维持肾脏结构和功能稳定的调节机制。
此外，小鼠肾成纤维细胞在肾脏疾病的发生和发展过程中也扮演着重要角色，其异常激活可能引起肾脏纤维化等病理变化。
深入研究小鼠肾成纤维细胞的重要性不仅可以加深对肾脏生物学过程的理解，也有助于揭示相关疾病的发生机制。
此外，对小鼠肾成纤维细胞进行进一步的应用和研究，也有助于发展针对肾脏疾病的新疗法和药物靶点。
本文将重点介绍小鼠肾成纤维细胞的鉴定方法、特征和功能，以及其在相关研究中的重要性和应用。
我们希望通过本文的撰写和阐述，能够促进对小鼠肾成纤维细胞的深入认识，进一步推动相关领域的研究发展，并为未来的研究方向提供重要参考。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以涉及以下几个方面：文章结构部分介绍了整篇文章的组织框架，主要包括引言、正文和结论三个部分。
引言部分是整篇文章的开篇，用来引入研究主题和背景，概述小鼠肾成纤维细胞的鉴定以及其重要性和应用。
接下来，文章会详细介绍小鼠肾成纤维细胞的鉴定方法、特征和功能，以及其在相关研究中的重要性和应用。
正文部分是本文的核心内容，主要分为2.1、2.2和2.3三个小节。
2.1 鉴定小鼠肾成纤维细胞：这一小节会详细介绍如何进行小鼠肾成纤维细胞的鉴定过程，介绍鉴定所使用的标志物和实验方法，以及鉴定结果的分析和解释。
小鼠早期胚胎发育的研究 )
小鼠早期胚胎发育的研究（实验方案）基础生物学课程设计所在学院生物科学与工程学院专业班级生物科学学生姓名学生学号指导教师XXXX年XX月XX日小鼠早期胚胎发育的研究一、引言胚胎发育一词通常是指从受精卵起到胚胎出离卵膜的一段过程。
而无脊椎动物胚胎学家则常把其概念扩展到胎后发育直到性成熟，甚至整个生活史。
动物胚胎的发育过程虽然动物的种类繁多，但是胚胎的发育依然拥有相似的过程，能够分成受精、卵裂、桑葚胚、囊胚、原肠胚与器官形成等阶段。
此外脊椎动物的胚胎发育过程中，各种动物共同拥有的特征会首先出现(如皮肤)，之后才逐渐发展出特化的构造(如鱼鳞)，而且较复杂的物种与较原始的物种之间一开始相当类似，之后才随着发育的时间而慢慢增加变异。
受精:卵子和精子融合为一个合子的过程。
它是有性生殖的基本特征，普遍存在于动植物界，卵裂:精子与卵子结合之后会形成受精卵，由于卵黄的分布具有不对称的特性，因此受精卵可以分为动物极(会发展成外胚层)和植物极(会发展成中胚层与内胚层)。
在卵裂时期，卵子会先分裂成两个细胞，之后细胞通常会逐次倍增，但是对哺乳类而言，有时候会有不同时分裂并造成只有奇数个细胞的现象。
在这个阶段，胚胎的总体积大致不变。
不同的物种具有不同的卵裂方式，可以分为完全卵裂(holoblastic cleavege)和不完全卵裂(meroblastic cleavage)，分别又可以细分成许多不同方式。
如无脊椎动物的辐射卵裂与螺旋卵裂、哺乳动物的旋转式分裂等。
原肠胚:当细胞分裂成为囊胚之后，会经过一段称为原肠形成的型态发生过程，之后形成原肠胚。
原肠形成过程有许多不同方式，能够大致分成5种:内陷式(Invagination)、衰退式(Involution)、进入式(Ingression)、脱层式(Delamination)、包覆式(Epiboly)，动物的胚胎利用这5种方式形成了外胚层、中胚层与内胚层的组合，而这三种胚层在之后会形成各种细胞。
原代细胞克隆形成实验原理
原代细胞克隆形成实验原理一、引言原代细胞克隆是指通过将原代细胞分离并培养，使其形成与原代细胞相同的克隆细胞群体。
这种技术被广泛应用于生物医学研究、生物工程和农业领域，对于细胞的功能研究、药物筛选和基因改造具有重要意义。
本文将介绍原代细胞克隆形成实验的原理和步骤。
二、原代细胞克隆形成实验原理原代细胞克隆形成实验主要基于细胞的增殖特性和分化能力。
细胞增殖是细胞生命周期中的一个重要过程，通过细胞分裂可以产生两个或更多的细胞。
分化是指细胞在特定条件下转变为特定类型的细胞。
在细胞克隆实验中，我们利用细胞的增殖特性和分化能力，将原代细胞分离并培养，使其形成克隆细胞群体。
三、原代细胞分离原代细胞分离是实现细胞克隆的第一步。
通常，我们从动物或植物组织中取得原代细胞，例如从小鼠胚胎中获取胚胎成纤维细胞。
然后，利用消化酶或机械方法将组织分解成单个细胞。
分离后的细胞可通过显微镜观察验证。
四、原代细胞培养原代细胞分离后，需要将其培养在适当的培养基中，提供细胞所需的养分和环境条件。
培养基的选择对于细胞的生长和分化至关重要。
常见的培养基包括DMEM、RPMI-1640和MEM等。
此外，培养基中还需要添加血清和抗生素等物质，以促进细胞的增殖和防止细菌污染。
五、细胞增殖和分化原代细胞在培养基中经历细胞增殖和分化的过程。
细胞增殖是指细胞通过分裂产生新的细胞，从而形成细胞群体。
细胞分化是指细胞根据特定的信号和环境条件转变为特定类型的细胞，具有特定的功能和形态。
在培养过程中，细胞会不断增殖和分化，形成克隆细胞群体。
六、细胞筛选和传代在细胞克隆形成实验中，为了获取具有相同遗传特性的细胞群体，需要对细胞进行筛选。
常见的筛选方法包括荧光染色和细胞表面标记等。
筛选后的细胞可以进行传代，即将细胞分离并继续培养。
传代可以使细胞持续增殖和分化，保持克隆细胞的稳定性和纯度。
七、应用领域和前景原代细胞克隆形成实验在生物医学研究、生物工程和农业领域有着广泛的应用。
高中生物第章细胞工程.1动物细胞培养学案选择性3
动物细胞培养必备知识·素养奠基一、动物细胞培养概念从动物体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
二、动物细胞培养的条件1。
营养条件:(1)合成培养基：将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成。
（2)天然成分：血清等.（3）一般使用液体培养基,即培养液。
2。
无菌、无毒的环境：(1）培养液和培养用具灭菌处理。
(2）无菌环境下操作.（3）培养液定期更换的目的：清除代谢物,防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
3。
温度、pH和渗透压:(1)适宜的温度：哺乳动物多以36。
5±0。
5℃为宜。
(2）适宜的pH:多数细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。
(3)适宜的渗透压。
动物细胞培养能否体现动物体细胞的全能性？说明你的理由。
提示:不能。
动物细胞培养只是细胞的增殖，没有体现细胞的全能性。
4.气体环境：95％空气和5%CO2。
（1)O2作用：细胞代谢所必需的。
(2）CO2的主要作用：维持培养液的pH。
三、动物细胞培养的过程填一填：基于动物细胞培养的过程，完成下面的问题:（1)过程①处理方法有:机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理的方法.(2）过程②为原代培养,培养的动物细胞有两类:①悬浮在培养液中生长增殖;②贴附于某些基质表面生长增殖。
(3）进行过程③时,悬浮培养的细胞直接用离心法收集;贴壁细胞需要使用胰蛋白酶等处理，然后用离心法收集.（4)过程③为传代培养，进行过程③的原因主要有:细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏和接触抑制等。
四、干细胞培养及其应用1。
干细胞分布：早期胚胎、骨髓和脐带等。
2.种类：胚胎干细胞和成体干细胞。
3.判一判：基于干细胞的类型和应用,判断下列说法的正误。
(1)胚胎干细胞和成体干细胞都具有形成机体的所有组织和器官,甚至个体的潜能. (×)提示:成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
短端粒小鼠与正常小鼠间充质干细胞的分离培养比较
（ ． ｙＬ ｂ ｒｔｒ ｆＨｕ ｎ Ｄ ｓａｅ ｏ ａａｉｅＭｅ ｉｉｅ １ Ｋｅ ａ ｏａｏｙｏ ｍａ ｉｅ ｓｓＣ ｍｐ ｒｔ ｄｃｎ ，Ｍｉｉｔ ｆＨｅ ｌ ｖ ｎｓｒ ｏ ａｔ ｎ ｔｕｅｏ ｄｃ ｌ ａ ｏａｏｙ ｙ ｈ；Ｉｓ ｔｔ ｆＭｅ ｉａ Ｌ ｂ ｒｔｒ ｉ
养板 内， 入 Ｏ ＭＥ 含 １ ％ Ｆ Ｓ及 １ ／ ） 加 Ｌ Ｍ（ — ０ Ｂ ％Ｐ Ｓ 培养 液 ， ３ｏ ５ Ｃ 。 于 ７Ｃ，％ Ｏ 条件 下培 养 ； 种 ３ ｄ 进 行第 接 后 １次换 液 ， 以后 隔 日换 液 。每 天 随 机 抽 取 ３只实 验 动物 的 ＭＳ Ｃ作 细胞 生长 动力 学观 察 ， 至贴 壁 细胞 直
ｔｔ ｄ ｎｓｒ ｉ ｆ ａ ｉ ｏ ａ ｎ ｓ ｄｃｎ ； ｅ ｉｇＵｎｏ ｄｃｎ ｌ ｅ ｅｊ ｇ １ ０ ，Ｃ ｉａ ａｏ Ｔ ｉ Ｃｈ ｅ ｉ ０ 究 ＳａｅＡ ｍｉｉｔ ｔ ｎｏ ｒｄｔ ｎ ｌ ｉｅｅＭｅ ｉｉｅ Ｐ ｋｎ ｉｎＭｅ ｉｉｅＣｏｌｇ ，Ｂ ｉｎ ０ ２１ ｈｎ ； 报 ２ Ｔａ ｊ ｙＬ ｂ ｒｔｒ ｆＭｏｅ ｕａ ｃｅ ｒＭｅ ｉｉｅ ｎ ｔｕｅｏ ａ ｉｔ ｎ Ｍｅ ｉｉｅ ｈｎ ｓ ａ ｅ ｔ ． ｉｎｉ Ｋｅ ａ ｏａｏｙ ｏ ｌｃ ｌｒＮｕ ｌａ ｄｃｎ ，Ｉｓｉ ｔ ｆＲ ｄａｉ ｄｃｎ ，Ｃ ｉｅｅＡｃ ｄ ｍｙｏ、 ｎ ｔ ｏ
的载体 发挥 着重 要作 用 ， 统 获取 小 鼠 ＭＳ 传 Ｃ方法 主
要 来 自骨髓 ， 用 ＭＳ 利 Ｃ细 胞具 有在 塑 料培 养 皿上 贴
摇 １～ 。 回收消 化松 散 的骨 片准备 原代 培养 。 ２ｈ
１ ３ 小 鼠皮质 骨 ＭＳ 的原 代培 养 ． Ｃ 将经 上述 分离 所得 的骨 片种 于 ２ ｍ 平 皿 中 ， ５ａ
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
·1· 小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养 一、实验材料 1. 主要仪器设备 (1) 倒置显微镜（Olympus，Japan） (2) CO2培养箱（BB16HF，上海力申科学仪器有限公司） (3) 100ml的玻璃培养瓶（江苏海门市大路塑料实验仪器厂） (4) 6孔培养板（COSTAR，每孔直径为3.5cm） (5) Eppendroff管 (6) 1ml,2ml,5ml的玻璃滴管各30支；10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿 (7) 离心机 (8) 5ml冻存管 (9) 两套小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊） 2. 主要试剂配制 (1) MEF(mouse embryo fibroblast，小鼠胚胎成纤维细胞)培养液 ——低糖DMEM母液 1) 用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水（购自福州新北生化工业有限公司）； 2) 将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，并冲洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。 3) 每升培养基中添加3.7gNaHCO3。 4) 搅拌直至完全溶解。 5) 用1NHCl或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3，调好PH后，将容器密封（在该实验中用1NHCl调PH至7.3）。 6) 立即用0.22um的滤器过滤除菌，装入高压过的盐水瓶中, 4℃保存(1个月内用完)。 ——MEF培养液 取100ml上述配好的低糖DMEM液体，加入10000IU青霉素钠（6.25mg）和10mg链霉素，溶解后再次调节PH至7.3，经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶中，再添加10ml分装好的新生牛血清（Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需56℃，30min灭活过），4℃保存至使用。 (2) PBS 在500ml超纯水中依次溶入 NaCl 4.0g KCl 0.1g Na2HPO4.12HO2 1.445g KH2PO4 0.1g 于121℃高压灭菌30min或经0.22um的滤器过滤除菌再分装入100ml洁净灭菌的盐水瓶中，再放入4℃冰箱中保存备用。 (3) 0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液 在100ml超纯水中分别溶解 胰蛋白酶干粉(Trypsin, Sigma,T4799) 0.25g EDTA 0.02g ·2·
NaCl 0.7g Na2HPO4.12HO2 0.024g KH2PO4 0.024g KCl 0.037g Tris 0.3g D-葡萄糖 0.1g 酚红 1mg 于4℃过夜，使之充分溶解，用1mol/lHCl调PH至7.6, 0.22um的滤器过滤除菌，在–10～30℃下冻存备用。 (4) 0.1%的明胶水溶液 称明胶0.1g （Sigma, G—9391）溶于100ml超纯水中，先加热溶解，再分装入20ml的血清瓶中于121℃高压灭菌45min，于4℃保存。 (5) 10ug/ml的丝裂霉素C工作液 1) 0.5mg/ml的丝裂霉素C母液 在盛有2mg丝裂霉素C的小瓶中加入4ml高压灭菌的PBS，用高压灭菌的尖嘴混匀。即得0.5mg/ml的丝裂霉素C母液。 注：此步应在胶卷暗盒内操作，然后于4℃避光保存。 2) 10ug/ml的丝裂霉素C工作液 在24.5ml的MEF培养液中加入0.5ml的0.5mg/ml的丝裂霉素C母液，并经0.22um的滤器过滤至25ml血清瓶中。用前临时配制，并在37℃的CO2培养箱中预温30min.。 (6) 冻存液 取2支1.5ml Eppendroff管，每管均加入0.9ml DMEM（低糖型）培养液和0.1ml二甲基亚砜（DMSO，AR纯，中国医药集团上海化学试剂公司），置40C冰箱中预冷60min。 3. 动物： 性成熟期即大于8周龄昆明种小白鼠，领自福建医科大学实验动物中心。
二、实验步骤 1. 获取小鼠胚胎 (1) 将8周龄的昆白♀鼠和12周龄的昆白♂按1:1比例合笼。 (2) 次日晨10:00前观察♀鼠阴道口，有乳白色或蛋黄色胶冻状物（阴道栓）即定为怀孕0.5天。 (3) 实验时断颈处死孕13.5天的母鼠，置于蜡盘上。 (4) 75％酒精消毒后，用普通剪刀和镊子剪开下腹皮肤，并用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮。 (5) 用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。 (6) 用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。 (7) 将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。 (8) 在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的平皿中，洗涤数次。 (9) 将子宫移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。 (10) 将胎鼠移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和内脏，得鼠胚躯干。 (11) 将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的平皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。 ·3·
2. 小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养（组织块培养法） (1) 将干净的鼠胚躯干移至青霉素小瓶内（每6个鼠胚躯干装1瓶），用眼科直剪充分剪碎，剪成约1mm3以下的碎块（需剪约200下）。 (2) 用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS，混匀后连同鼠胚碎块一起移至一尖底离心管中。 (3) 室温下静置5min，用刻度吸管吸去上清液，留下鼠胚组织碎块。 (4) 向装有鼠胚碎块的离心管内加入1ml0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液，轻轻吹吸30秒（可见组织块变得较为粘稠）。 (5) 再加入1 mlMEF培养液终止消化，室温下静置5min。 (6) 吸去上清液，留下鼠胚组织碎块沉淀。 (7) 每个离心管内加入5mlMEF培养液悬浮鼠胚组织块，并接种到100ml的螺口的培养瓶中（接种时应用滴管将组织块混匀）。 (8) 做好标记（如培养日期，细胞名称，编号），将装有鼠胚组织碎块的培养瓶放入37℃，5％CO2，100％RH的培养箱中培养。 (9) 培养的头两天不要晃动培养瓶，第三天可以观察，可见组织碎块附着于培养瓶底，周围细胞呈放射状生长，此时有多种细胞类型，有的是呈梭形的成纤维细胞，有的是呈圆形的上皮细胞。如果细胞已全部长满则可消化传代，如果未全部长满则可3/4换液或全量换液。 3. 小鼠胚胎成纤维细胞的传代培养： (1) 用滴管吸弃培养瓶中的培养液和未贴壁生长的组织块。 (2) 每瓶用滴管加入约3ml的PBS，轻轻前后晃动培养瓶，洗涤细胞一遍，吸弃PBS。 (3) 每瓶用滴管加入约2ml的0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液，能盖住培养瓶底，室温下静置作用30秒，吸弃消化液。 (4) 在倒置镜下观察，当细胞变圆时即可加入4—5mll MEF培养液终止消化，并用滴管吸培养液用力吹打整个瓶底（约30下）。 (5) 将培养物全部吸置尖底离心管内，静置5min，将上层细胞悬液吸置另一离心管内。 (6) 1000r/min（80-1离心机为80g）离心5min，吸弃上清液。 (7) 每瓶加入3mlMEF培养液悬浮细胞沉淀块，并分装至3个100ml的培养瓶中。 (8) 每个培养瓶再补加4ml的MEF培养液，并吹打混匀细胞（吹打时勿产生气泡）。 (9) 将刚消化传代的细胞在倒置镜下观察，可见细胞呈大小不一的圆形。 (10) 将装有消化后细胞的培养瓶放入37℃，5％CO2，100％RH的培养箱中培养。 (11) 约2天后，细胞可贴壁长满，继续按1:3消化传代（操作同前，省略步骤5中的静置和换管）。 4. 饲养层制备 (1) 明胶预包被培养板：取1个6孔培养板（COSTAR ,每孔直径为3.5cm），先紫外照射30min，每孔用5ml刻度滴管加入3ml的 0.1%明胶水溶液，使其能覆盖孔的底部，室温下静置2h以上，用前吸弃明胶水溶液，并用2ml的PBS洗涤一遍。 (2) 丝裂霉素C作用2小时：将3瓶细胞生长连成一片的第3代MEF的培养液吸弃，每瓶加入3ml10ug/ml的丝裂霉素C工作液，再放入37℃、5%CO2、RH100%的培养箱中培养2h。 (3) 2小时后，吸弃培养瓶中的丝裂霉素C工作液，用预温的PBS洗涤细胞5次，每次3ml（加样时滴管靠在培养瓶的上壁或侧壁，勿直接冲冲击底壁的细胞）。 (4) 消化：每瓶中加入2ml0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA消化液，室温下作用10秒，立即吸弃消化液，加入3mlMEF培养液终止消化，并吹打壁底细胞（应注意逐瓶操作，避免消化时间过长而使细胞丢失过多）。 (5) 离心：将所有细胞悬液分吸至2个10ml尖底离心管内，1000r/min离 心5min，弃上清，得细·4·
胞沉淀块，往一个离心管的沉淀块内加入3ml的MEF培养液混悬细胞，再吸至另一离心管中混悬沉淀块。 (6) 计数并调整密度：吸出混悬后的细胞悬液50ul用血细胞计数板计数混合后细胞悬液的密度，然后将细胞悬液吸至一培养瓶或血清瓶中，补加适量的MEF培养液调整细胞密度为3×105个/ml。 (7) 接种：每孔加3 ml密度为3×105个/ml的细胞悬液（因为培养孔的直径为3.5cm，故其底面积S=πr2=3.14×1.752=9.42 cm2，根据接种的细胞数为1×105个/cm2,所以每孔可加3 ml密度为3×105
个/ml的细胞悬液）。 (8) 培养：将接种好经丝裂霉素C作用过MEF的6孔板放入37℃、5%CO2、RH（相对湿度）100%的培养箱中培养。 5. 饲养层细胞的冻存和复苏实验 (1) 冻存 1) 细胞：镜检，将处于对数生长期的小鼠胚胎成纤维细胞用于冻存实验。弃旧培养液，后以PBS或新鲜培养液漂洗细胞一次。 2) 消化：常规0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA消化制备单细胞悬液。 3) 离心重悬：80g离心10min，弃上清，以冻存液悬浮细胞，分装到冻存管中。 4) 冻存：细胞逐级降温冷冻：40C冰箱40min-200C冰箱40min-800C冰箱保存备用。 (2) 复苏培养 1) 冻融：从低温冰箱中取出冻存细胞，置于370C水浴锅内，不时振摇冻存管，使细胞快速融化。 2) 洗涤：转移冻存管内细胞于离心管中，80g离心5min，弃上清，沉淀用含新鲜DMEM（低糖型）重新悬浮，制备单细胞悬液。 3) 接种：接种细胞于培养瓶中，置370C、CO2培养箱内进行过夜培养，12～24小时后，更换培养基，按照细胞的生长状况进行相应处理。