普通微生物微生物与基因工程
基因工程与微生物的关系
基因工程与微生物的关系
嘿，朋友们！今天咱来聊聊基因工程和微生物这俩神奇的家伙。
有一次啊，我去参观一个生物科技展览。
一进去，就看到好多奇奇怪怪的仪器和展板。
我正瞎逛着呢，突然被一个展示基因工程和微生物关系的展板给吸引住了。
展板上写着，基因工程可以利用微生物来做很多厉害的事情。
我就纳闷了，这微生物不就是那些小不点儿的细菌啥的嘛，能有啥大作用呢？
这时候，旁边来了一个讲解员阿姨。
她看我一脸疑惑，就笑着给我解释起来。
她说，微生物虽然小，但是它们的作用可大了。
比如说，有些微生物可以生产出我们需要的药物呢。
阿姨还给我举了个例子。
她说有一种微生物，可以通过基因工程的方法，被改造得能够生产胰岛素。
哇，我一听就惊呆了。
胰岛素那可是很多糖尿病患者需要的药啊。
原来这些小小的微生物还能这么厉害呢。
阿姨接着说，基因工程还可以让微生物变得更强大。
比如说，可以让它们能够分解那些很难处理的污染物。
我就想象着，那些小小的
微生物像小战士一样，把那些脏东西都给打败了。
我又问阿姨，那基因工程会不会有啥风险啊？阿姨说，当然有啦。
如果不小心把那些改造过的微生物放出来，可能会对环境造成不好的影响呢。
所以啊，科学家们在做基因工程的时候，都特别小心。
从展览出来，我就一直在想基因工程和微生物的关系。
这俩家伙，一个是高科技，一个是小不点儿，但是它们组合在一起，就能做出这么多厉害的事情。
真是太神奇了。
以后啊，说不定基因工程和微生物还能给我们带来更多的惊喜呢。
嘿嘿。
基因工程第三章 微生物基因工程
2、重组异源蛋白包含体表达系统的构建
方法：将外源基因插入到原核表达载体强启动子和有效的SD 序列的下游，表达产物位于胞内，氨基端和羧基端不含有其 他蛋白或多肽序列。
启动子和SD序列可通过一般的重组，PCR扩增甚至化学合成 等方法将两者按照最佳距离及碱基序列连为一体，组成大肠 杆菌表达复合元件。问题是外源基因如何与这类表达复合元 件拼接克隆，才能尽量避免在SD序列与外源基因的起始密码 子之间引入过多的碱基对。（图3-5）
二、大肠杆菌工程菌的构建策略
导致异源重组蛋白在大肠杆菌中不稳定的主要因素有： ①大肠杆菌缺乏针对异源重组蛋白的折叠复性和翻译后加 工系统。 ②大肠杆菌不具备真核细胞完善的亚细胞结构以及众多的 稳定因子。 ③高效表达的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度 的微环境。
基 因 工 程 GENE ENGINEERING
基 因 工 程 GENE ENGINEERING
胰岛素原
19 20
胰岛素
6
7
11 7 基 因 工 程 GENE ENGINEERING
人胰岛素的生产方法
1. 从人的胰中直接提取胰岛素。
2. 由单个氨基酸直接化学合成。 3. 由猪胰岛素化学转型为人胰岛素 4.利用基因工程菌大规模发酵生产重组人胰岛素。
基 因 工 程 GENE ENGINEERING
2、整合型异源蛋白的表达 阻止重组质粒丢失的方法有： ①对于实验规模而言，将克隆菌置于含有筛选试剂的培养基中 生长，这样可以有效地控制丢失质粒的细菌繁殖速度，维持培 养物中克隆菌的绝对优势。 ②将外源基因直接整合在受体细胞染色体DNA的特定位置上， 使之成为染色体DNA的一个组成部分，从而增加其稳定性。
微生物工程
微生物复习资料1.发酵工程：即微生物工程。
是渗透有工程学的微生物学，是传统的发酵技术与基因工程、细胞工程、蛋白质工程等相结合，具体包括菌种选育、菌体生产、代谢产物的发酵以及微生物机能的利用等。
发酵：借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动，来制备微生物菌体本身，或其代谢产物的过程。
2.菌种：用于发酵过程作为活细胞催化剂的微生物，包括细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。
来源于自然界大量的微生物，从中经分离并筛选出有用菌种，再加以改良，贮存待用于生产。
3.培养基：供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。
有的培养基还含有抗菌素和色素，用于单种微生物培养和鉴定。
4.菌种退化：菌种的发酵能力降低、繁殖能力降低、发酵产品的得率降低5.下游技术：发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程称为下游加工过程6.工业微生物育种方法：A、自然选育；B、生产选育；C、诱变育种；D、细胞工程育种E、基于代谢调节的育种；F、代谢工程育种G、基因重组育种；H、蛋白质工程育种；J、组合生物合成育种；K、反向生物工程育种7.菌种选育目的：改善菌种的特性，使产量提高，改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用等8.影响微生物生长的环境因素：温度ph 氧9.好氧发酵罐：机械搅拌式通风发酵罐、自吸式发酵罐、气升式发酵罐和塔式发酵罐10.影响种子质量的主要因素1、培养基：2、种龄与接种量3、斜面冷藏时间4、温度：温度直接影响生长和酶的合成；5、pH值：对微生物有明显的影响。
[调节方法有三种方法：用酸碱溶液中和法；使用缓冲溶液法；使用生理缓冲剂.]6、通气搅拌：[溶解氧的作用：参与菌体呼吸作用]7、泡沫：8、染菌的控制9、种子罐级数11）大规模工业生产的培养方法A、固体培养（曲法培养）：浅盘固体培养，深层固体培养B、液体培养：浅盘液体培养，液体深层培养（目前几乎所有的好气发酵均采用此法）；C、载体培养：用天然（或人工）多孔材料代替麦麸之类固态基质作微生物生长的载体，营养成分可严格控制。
微生物在基因工程中的应用
知识文库 第16期210微生物在基因工程中的应用张子旭微生物与我们的生活息息相关,在我们的生活中占有的非常重要的地位。
微生物在当下生物技术及生物工程中均起到了至关重要的作用。
本文将重点阐述微生物在基因工程中的应用及在当下基因工程对人类发展的影响。
1前言微生物（microorganism）通常是各种的微小生物的统称，其特征为结构简单、肉眼难以观察、繁殖速度极快、分布广泛、数量极多等。
其包括细菌、真菌、放线菌、蓝细菌、古生菌、原生生物在内的一大类细胞生物群体以及病毒和亚病毒等非细胞生物群体。
在基因工程、细胞工程、发酵工程等生物工程中，微生物都充当着重要的角色。
本文将从微生物在基因工程中的作用、微生物在基因工程中的实际应用以及基因工程在生活中应用及影响几个方面进行阐述。
2微生物与基因工程2.1基因工程简介基因工程（genetic engineering）又称遗传工程，是通指重组DNA 技术的产业化设计与应用的流程，强调了按照工程学的方法进行设计和操作外源DNA，构建新的分子组合，并导入到另一受体生物中。
基因工程的出现标志着人类已经能够按照自己意愿进行各种基因操作，并且能迅速的获得人类所需的新生物类型，最终实现目标蛋白质的工程化生产以及物种的遗传改良。
2.2 微生物与基因工程的关系微生物在基因工程中的作用有如下几个方面：基因工程的大部分步骤都需要各种不同的工具酶，如在大肠杆菌中，我们通过分离纯化的方式获得了EcoRI,EcoRII[1]等常用的内切酶，为基因工程提供了便利。
② 基因工程常用克隆载体为质粒载体、酵母表达载体、噬菌体表达载体等。
这些均是从病毒、噬菌体、酵母、细菌获得。
③ 微生物细胞是基因工程的载体及表达系统，即使对于动、植物基因工程来说，也先要利用微生物细胞将目的基因导入其中进行拼接，构建表达载体，再转移到动植物细胞中，完成之后的基因工程步骤。
④ 由于微生物大量存在于土壤、水体和人体表面。
其所处环境决定了它具有哪些特性。
基因工程育种微生物遗传育种
• 基因工程育种与微生物遗传育种概述 • 基因工程育种技术 • 微生物遗传育种技术 • 基因工程育种与微生物遗传育种的应
用 • 基因工程育种与微生物遗传育种的挑
战与前景
01
基因工程育种与微生物遗传育种概述
基因工程育种定义与特点
定义
基因工程育种是通过基因工程技术对 生物体的基因进行改造，以达到改良 生物性状和提高产量等目的的育种方 法。
工业领域的应用
工业酶
利用基因工程技术生产具有特殊功能的工业酶，广泛应用于洗涤 剂、食品、纺织和制药等行业。
生物燃料
通过基因工程技术改良微生物，生产高效、环保的生物燃料，减少 对化石燃料的依赖。
生物材料
利用基因工程技术生产具有特殊性能的生物材料，如可降解塑料、 生物纤维等，替代传统石化材料。
05
基因工程育种与微生物遗传育种的挑
战与前景
技术挑战与伦理问题
技术挑战
基因工程育种和微生物遗传育种技术需要高 水平的科学知识和技术能力，同时面临着技 术难度大、成本高、周期长等问题。
伦理问题
基因工程育种和微生物遗传育种涉及到人类 基因和生命形式的改变，可能引发伦理和道 德方面的争议，需要慎重考虑和规范。
未来发展方向与前景
精准育种
随着基因组学和生物信息学的发展，基因工程育种和微生物遗传育种将更加精准和高效， 能够更好地满足农业生产和生物医药等领域的需求。
VS
细胞工厂构建
通过代谢工程手段改造微生物细胞，使其 具备生产特定化学品、燃料或材料的能力 。
04
基因工程育种与微生物遗传育种的应
用
医药领域的应用
基因治疗
利用基因工程技术修复或替换缺陷基因，以达到治疗 遗传性疾病和恶性肿瘤等疾病的目。
基因工程在微生物学中的应用
基因工程在微生物学中的应用随着科技的发展，基因工程技术的应用越来越广泛。
在微生物学领域，基因工程技术也得到了广泛应用。
本文将详细介绍基因工程在微生物学中的应用。
1. 基因克隆技术的应用基因克隆技术是基因工程技术中的重要一环。
通过基因克隆技术，可以将某一种微生物的基因克隆到另一种微生物中，从而改变其性状。
例如，科学家们通过基因克隆技术，将可以产生抗生素的基因克隆到无法产生抗生素的微生物中，使其也能够产生抗生素。
这一技术不仅可以应用于微生物的改良和优化，也可以应用于多种人类疾病的基因治疗中。
2. 基因编辑技术的应用基因编辑技术是基因工程技术中的一种新兴技术。
它可以直接对微生物细胞的基因进行编辑和修正，从而实现微生物的定向进化。
例如，科学家们使用基因编辑技术，将可降解塑料的基因克隆到大肠杆菌中，使其能够分解塑料，为环境保护作出贡献。
3. 基因组学的应用基因组学是现代微生物学研究的重要手段。
基因组学技术可以快速地对微生物的基因进行测序和分析，从而发现微生物中新的基因和特征。
例如，应用基因组学技术可以发现某种微生物具有降解能力。
对于环境污染物的处理，这是一项重要的技术。
4. 基因工程杀虫剂的应用基因工程杀虫剂是一种新型的绿色化杀虫剂。
它采用基因工程技术，将受体细胞和毒素基因结合后进行克隆转移到微生物中，可以实现靶向滴灌、目标杀虫等方式，降低化学农药对环境和人体的危害。
5. 基因工程菌肥的应用基因工程技术可以将大肠杆菌和芽孢杆菌等微生物进行改造，使其能够产生有机肥料。
这种基因工程菌肥具备了多种生物活性成分，能够显著提高作物的抗性和生产效率，是一种新型的生物肥料。
综上所述，基因工程技术在微生物学中的应用非常广泛。
基因克隆技术、基因编辑技术、基因组学技术、基因工程杀虫剂和基因工程菌肥等都是基因工程技术在微生物学领域中的重要应用。
这些技术的应用不仅为微生物研究提供了新契机，也为人类的生活和环境保护作出了贡献。
微生物与基因工程
微生物与基因工程微生物与基因工程是当今科学领域中备受瞩目的研究方向。
微生物作为一类微小生物体，具有广泛的分布和多样的功能，对人类的生活和自然界的生态系统起着重要的作用。
而基因工程则是通过改变生物体的遗传信息，以实现对其性状和功能的精确控制和改良。
本文将对微生物与基因工程之间的紧密联系以及它们在生物科技领域的应用进行探讨。
第一部分：微生物的概述微生物是一类非常广泛的生物体，主要包括细菌、真菌、病毒等，其特点是体积小、繁殖能力强、生活环境广泛。
微生物在自然界中广泛存在，在空气、水、土壤、外界物体等各个环境中都可以找到微生物的身影。
微生物对人类的生活产生了巨大的影响，比如某些细菌可以分解有机物质，参与土壤肥力的维持；真菌在食品工业中被广泛应用，用于食品的发酵和保鲜等。
第二部分：微生物与基因工程的联系微生物是基因工程研究的重要对象之一，它们具有以下几个方面的优势：1. 繁殖能力强：微生物的繁殖速度非常快，可以在短时间内获得大量的微生物种群，为基因工程实验提供了便利条件；2. 遗传信息简单：相对于高等生物，微生物的基因组结构相对简单，研究人员可以更容易地对其基因进行操作和改变；3. 可操作性好：微生物的生长条件可以比较容易地进行控制，通过改变培养基中的成分或温度、pH等环境因素，可以实现对微生物生长的精确控制；4. 改良潜力大：由于微生物的基因信息相对简单，研究人员可以利用基因工程技术，对微生物的性状和功能进行精确改良，以实现人类的特定需求。
第三部分：基因工程在微生物中的应用基因工程技术在微生物研究和应用中具有广泛的应用场景，具体包括以下几个方面：1. 转基因微生物的应用：通过导入外源基因，可以让微生物具备特定的生物合成或代谢功能，比如利用大肠杆菌表达外源蛋白，用于生产重组蛋白；2. 微生物基因组学研究：通过对微生物基因组进行测序和分析，可以揭示微生物种类、功能和进化等方面的信息，为微生物学研究提供基础数据；3. 微生物制药和生物工程：利用微生物进行药物、酶和化学品的生产，比如利用酵母菌进行乳酸和酒精的发酵；4. 环境修复和生态恢复：微生物在环境修复和生态恢复中发挥重要作用，比如利用微生物降解污染物，净化水体和土壤。
微生物与基因工程的关系
微生物与基因工程的关系说起来微生物与基因工程，这俩玩意儿吧，表面上看八竿子打不着，但实际上，它们之间的关系，那可比咱俩现在坐这儿聊天还紧密。
先说说微生物吧，你知道微生物是啥不？就是那种小得你看不见，得拿显微镜才能瞅见的玩意儿。
它们无处不在，空气里、水里、土壤里，甚至你的肚子里都有。
别看它们小，本事可大了去了，有的能治病救人，有的能让人得病，还有的，嘿，能在基因工程里头唱大戏呢！基因工程，听起来挺高大上的，其实说白了，就是人类对基因动手动脚的一门技术。
咱可以把一个生物的基因，拿到另一个生物里头去，让它长出本不属于它的东西，或者让它干点本不该干的事。
比如说，让西红柿长得跟苹果一样大，或者让猪长出人的耳朵来（当然，这个有点夸张了，但理论上是可行的）。
那微生物和基因工程是怎么扯上关系的呢？这事儿还得从基因工程的“原材料”说起。
你想啊，基因工程得拿基因当材料吧，那这些基因从哪儿来呢？答案就是：微生物！有些微生物里头，藏着好多对人类有用的基因，比如说能产生抗生素的基因，或者能分解石油的基因。
科学家们就把这些微生物抓起来，好好研究一番，然后把它们里头的好基因给提取出来，用到别的地方去。
我就亲眼见过一回，我们实验室里头有个小伙子，天天跟那些微生物打交道。
他得把那些微生物养在一个个小瓶子里，天天盯着看，生怕它们死了或者跑了。
有一天，他兴奋地跑过来跟我说：“刘老师，我找到一个好东西！”我一看，原来他从一种微生物里头提取到了一个能产生新型抗生素的基因。
那玩意儿，说不定以后能救好多人的命呢！当然啦，微生物在基因工程里头的作用，可不止提供基因这么简单。
它们还能当“小工人”，帮我们在实验室里头干点活儿。
比如说，有些微生物能大量复制基因，这样我们就能得到很多很多的基因，用来做各种实验。
不过啊，微生物也不是那么好对付的。
它们有时候也会捣蛋，比如说在基因工程里头产生一些我们不想要的变异，或者污染我们的实验材料。
所以呀，跟微生物打交道，那也得有点本事才行。
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基因工程过程示意图
①从细胞中分 离出DNA
① ②
③ ④
②限制酶截取 DNA片断
③分离大肠杆 菌中的质粒
⑤ ⑥
④ DNA重组
⑤用重组质粒 转化大肠杆菌
载体（Vector）：
能容忍外源DNA片段插入，可在细胞间转 移。并在宿主细胞内自主复制的DNA分子。
DNA重组 （recombination)：
不同来源的DNA片段共价连接、通过
重新组合构成了具有两个DNA分子遗传
信息的新重组体DNA分子的过程。
转化(transformation)：
以质粒为载体构建的载体DNA，在一 定条件下引入受体细胞的过程。或指DNA 分子进入宿主细胞的过程。
载体的种类
一、质粒克隆载体 二、λ噬菌体克隆载体 三、柯斯质粒载体(cosmid vector—黏粒载体) 四、M13噬菌体载体 五、噬菌质粒载体(phagemid/phasmid)
一、质粒克隆载体
1.质粒克隆载体的特性：
➢ 具有独立的复制起点 ➢ 含有多种限制酶的单一识别位点 ➢ 具有较小的相对分子质量 1~200kbp ➢ 具有较高拷贝数 ➢ 具有便于选择的标记 ➢ 易于导入细胞 ➢ 具有安全性
功
能 从Thermococcus litoralis分离到Vent DNA 聚合酶 从Thermus thermophilus中分离Tth DNA 聚合酶
PCR注意事项： 1. 引物的设计 2. 退火温度 3. 实验操作
PCR应用
1、基因扩增和制备DNA探针 2、临床医学上传染病的检测等 3、法医上判定亲缘关系 4、定性、定量检测基因表达水平
• 指DNA分子由稳定的双螺旋 结构松解为无规则线性结构的 现象。
• 变性时维持双螺旋稳定性的氢 键断裂， 但不涉及到其一级结 构的改变。
• 凡能破坏双螺旋稳定性的因素， 均可引起核酸分子变性。
• 解链温度:Tm Tm=69.3＋0.41(%G+C)
DNA复性 ( DNA Renature )
• 是DNA变性的一种逆转过程。热变性后的DNA一般 经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为退火(annealing)。
• 双螺旋结构
.两条脱氧核苷酸链成反向平行排列， (A)腺嘌呤
.一条呈5 ‘
3’方向
.另一条呈3 ‘ 5’方向。
.以碱基配对形成氢键而形成双螺旋结构
.遵循互补配对原则即：
A＝T G≡C
(G)鸟嘌呤
(C)胞嘧啶 (U) 尿嘧啶 (T) 胸腺嘧啶
DNA的三种构型：
-超螺旋：共价闭环（CCC）
-开环：单链缺口（OC） -线型：双链断裂（L）
oc
LC
ccc
DNA的性能
• 吸收光谱高峰为260nm
溴化乙啶（EB）嵌入DNA双链配对碱基之间，紫外线照射，可显示DNA位 置
• 在电场中的迁移率与分子量大小、构象有关
• DNA变性：在物理或化学因素作用下，氢键断裂成单链的过程 • DNA复性：变性因素去除后在适当条件下恢复
成双链的过程。
DNA变性(DNA D二、酶法或化学方法人工合成基因 • 三、PCR扩增基因 • 四、基因的定位诱变一、从基因或cDNA分离目的基因 基因
基DNA片段化 3、选择合适载体 4、DNA与载体连接 5、重组体转化或者转染
四、M13噬菌体载体
E.coli丝状噬菌体 环状ssDNA 6,407bp 感染雄性菌后变 成复制型dsDNA,以滚环方式复制出ssDNA
特点： 1. 间隔区插入β-半乳糖苷酶N端一小段编码序列，编 码β-半乳糖苷酶的α肽，可与E.coli lacZ突变基因产 物ΔM15进行α互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶。 在含有异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和显色物5溴-4-氯-3-吲哚β- D-半乳糖苷(X-gal)的平板上 时出现蓝色噬菌斑 2. 在α肽的编码区插入多克隆位点， 外源基因插入这一 区段，破坏 α互补作用，使β-半乳糖苷酶失活， 重组体产生白色噬菌斑
⑥培养大肠杆菌 克隆大量基因/
使其表达
三、微生物学与基因工程的关系
1.提供丰富而独特的基因资源 2.工具酶 3.克隆载体 4.基因克隆的宿主 5.基因表达的反应器 6.有关基因结构、性质和表达调控的理论主要来自对微生
物的研究 一切基因工程操作都离不开微生物—操作技术和理论指导
§2 基因的分离、合成和定位诱变
是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法
高温变性
92～96℃
中温延伸 70～72℃
低温复性 （退火）
40～60℃
P C R 基 本 原 理
所用DNA聚合酶： Klenow聚合酶 1988年Saiki等从水生栖热菌(Thermus aquaticus)
分离到TaqDNA 聚合酶 校 火球菌(Pyrococcus furiosus)分离到Pfu克隆总体 1. mRNA的提取 2条链 3. 利用DNA聚合酶Ⅰ，以cDNA的第一条链为模板，
用适当引物合成cDNA的第二条链，常用RNA酶H在 杂交分子的mRNA链上造成缺口和切口，产生一系 列引物，或是除去杂交分子的mRNA后，加入基因
➢ 适于遗传背景清楚的细菌染色体
➢ 酶切电泳分离DNA
➢ 化学方法人工合成基因
应用：
1、合成基因 2、合成核酸探针
探针(probe)：用同位素或其它非放射物质标 记的一段特定的DNA或RNA片段
3、合成DNA引物
三、PCR扩增基因
聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction, PCR
2 原核生物基因与表达特点 ——细菌基因表达
1） 基因组较小 2） 基因是连续的 3） 没有转录后加工过程和翻译后加工过程。 4） 转录和翻译偶联，可同时进行。
• 细菌染色质
2. 原核生物基因组
• 质粒（plasmid）：
细菌染色体以外的遗传物质，是环状闭合的双链DNA。
• 可自主复制
• 编码生物学形状
• 最佳复性条件一般认为是比Tm低25℃左右的温度
• 复性时温度下降必须缓慢 ，若在超过Tm的温度下迅速冷却 至低温(如4℃以下)，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常 以此方式保持DNA的变性(单链)状态。
DNA的复制与表达
• 半保留复制
（semi-conservative replication）
qRT-PCR (quantitative real-time PCR)
四、基因的定位诱变
在基因精确限定的位点引入突变 1、寡核苷酸指导的定位诱变 2、盒式诱变 3、PCR定位诱变
1.寡核苷酸指导的定位诱变
2.盒式诱变(cassette mutagenesis)
较大片段的诱变
3.PCR诱变 1）变异部位位于基因的 末端 引物5‘端限制位点的引入
基因的功能分类
• 结构基因（structure gene)： 决定蛋白质/多肽链或酶分子结构的基
因 • 调控基因 (regulatory gene)：
调节控制结构基因表达功能
基因的一般特性
• 半保留自我复制
• 决定生物表型或性状
• 基因突变
新的生物性状
DNA的结构
• 基本单位：核苷酸（碱基、五碳糖、磷酸）
基因工程核心是构建重组体DNA的技术，因
此，基因工程和重组DNA技术(recombinant DNA technology)有时为同义词
基因工程的出现使得生物科学迅猛发展，并带 动了生物技术产业的兴起！
基因工程的特点
可设计性 稳定性 远缘性 风险性
§1 基因工程概述
一、基因工程发展历史
➢ 基因工程三大理论基础 ➢ 基因工程三大技术发现
外源DNA<15kbp
2.质粒pBR322的结构特点
1977年Bolivar构建 ➢ 环状双链DNA 4,361bp 外源DNA 5kbp左右 ➢ 松弛型质粒，一个复制起点
➢ 两个抗性基因 Tetr Ampr
➢ 多克隆位点（multiple cloning site; polylinker;24） 插入失活(insertional inactivation):
第十章
微生物与基因工程
基因工程(genetic engineering)
在基因水平上，根据人们的需要以人工的方法 取得特定基因，在体外重组于载体DNA分子上， 然后将重组DNA转入受体细胞进行无性繁殖（称 为“克隆” ）和行使正常功能（称为“表达 ” ）， 从而制备人类需要的基因、基因产物或创造出新的 生物类型的分子生物学技术。
插入型载体(insert vector) 取代型载体(replacement vector) 78%~105%
三、柯斯质粒载体(cosmid vector—黏粒载体)
由λ噬菌体的粘性末端(cos位点)和质粒构建而成 黏粒的优点 ➢ 具有噬菌体的高效感染率， 以质粒形式存在 ➢ 具有质粒的复制方式 ➢ 具有克隆大片段外源DNA的能力(45kbp)
• 基因工程常用载体
真核生物基因组
• 基因组庞大3×106bp、染色质、染色体.
• 基因不连续性 断裂基因、内含子、外显子（大部分基 因含有内含子）
• 含有大量重复序列 非编码区域多于编码区域 • 非编码区较多 多于编码序列(9:1） • 转录和翻译不偶联
二、基因工程的基本过程
一、目的基因的制备( donor DNA ) 二、体外DNA重组(DNA recombination ) 三、重组DNA导入宿主细胞
2）变异部位位于基因的 中间
重组 PCR(recombinant PCR)—Higuchi,1988年