黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程
教案实验四 黑曲霉发酵生产柠檬酸
实验四黑曲霉发酵生产柠檬酸【目的要求】1. 掌握实验室菌种种子生产方法。
2. 掌握柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。
3. 熟悉并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况；4. 掌握钙盐法提取柠檬酸的原理与方法。
【基本原理】黑曲霉发酵生产柠檬酸实验中需要大量活化的孢子，其制备是采用麸皮培养基中保藏的黑曲霉孢子，在新的麸皮培养基上于适当的温度下活化并大量繁殖，从而产生大量活化孢子。
黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）转变为丙酮酸；丙酮酸氧化脱羧形成乙酰辅酶A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。
黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环不能充分进行，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。
其理论反应式为：C6H12O6+1.5O2→C6H8O7+2H2O除了含有大量柠檬酸外，还有大量的菌体，少量没有被黑曲霉利用的残糖、蛋白质、脂肪、胶体化合物以及无机盐类等。
柠檬酸提取就是从成分复杂的发酵液中分离提纯获得柠檬酸。
从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸的方法主要有：钙盐-离子交换法、溶剂萃取法、“吸交”法、离子色谱法等。
目前国外生产主要采用钙盐-离子交换法和溶剂萃取法；国内生产主要采用钙盐-离子交换法，“吸交”法和离子色谱法正在推广中。
钙盐法首先采用过滤或超滤除去发酵液中的菌丝体等不溶残渣，然后在澄清过滤液中加入碳酸钙（或氢氧化钙）发生中和反应，生成难溶的柠檬酸钙沉淀，利用在80-90℃下柠檬酸钙的溶解度极低的特性，通过过滤（或离心）将它与可溶性的糖、蛋白、氨基酸、其它有机酸、无机离子等杂质分离开，用80-90℃热水反复洗涤柠檬酸钙，除去残糖和其他可溶性杂质，经过滤（或离心）获得较净的柠檬酸钙，然后在洗净的柠檬酸钙中缓慢地加入稀硫酸进行酸解反应，生成柠檬酸和硫酸钙沉淀，经过滤（或离心）除去硫酸钙沉淀，获得粗制的柠檬酸。
柠檬酸发酵工艺
6. 浓缩与结晶
将酸解液置于60 ℃以下进行减压蒸发，浓缩至 70％以上，待结晶。 7. 干燥
沸腾干燥箱，去除晶体表面的自由水。温度 控制在35℃以下，否则会失去(shīqù)一部分结晶水， 影响成品光泽。
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钙盐法提取(tíqǔ)工艺流程简图
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柠檬酸提取(tíqǔ)方法
▪ 从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸的方法主要有以下几种：钙盐法、萃取法、
热处理的作用：
（1）杀死微生物终止(zhōngzhǐ)发酵，防止柠檬酸被分解
（2）使蛋白质等胶体物质变性凝固，降低发酵液粘度，有利于过滤； （3）使菌体内柠檬酸释放出来，提高收率。
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2.菌丝过滤(guòlǜ)
3.中和
4.酸解脱(jiětuō)色
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5. 树脂净化
强酸型阳离子交换树脂去除Ca2＋、Fe3＋等金属
▪ 可压缩性滤饼为无定型的颗粒组成，粒与粒之间的孔道随压缩的增加而变 小，因此对滤液的流动产生阻力，柠檬酸发酵液的颗粒形成的滤饼属此类型。
▪ 不可压缩性滤饼为不变形颗粒组成，当它沉淀于介质上时，多颗粒之间相互排
列的孔量和粒与粒之间的孔道均不受压强的增加而改变，中和生成的柠檬酸钙
和酸解过程中生成的硫酸钙形成的滤饼属于此种滤饼。
有机合成(yǒujī héchéng)的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物
根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：
① 非离子型
② 阴离子型（含有羧基） ③ 阳离子型（含有胺基）
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聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点
(yōudiǎn)
用量少，一般以mg/L计量；
絮凝体粗大，分离效果好；
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6. 柠檬酸发酵
2.柠檬酸生物合成途径
柠檬酸位于三 羧酸循环的起 始点，几乎所 有微生物都能 合成柠檬酸。
柠檬酸
3.柠檬酸产生菌
菌 种
假单胞菌 节杆菌 棒杆菌 短杆菌 诺卡氏菌 放线菌
柠檬酸
4.柠檬酸发酵生产菌
我国选育柠檬酸高产菌株
字佐米曲霉N558(产酸6％-7％)； 黑曲霉r144(产酸9％)； D353(产酸9％-10％)； N05016(产酸14％-17％)；
米曲霉 黑曲霉
5. 柠檬酸生物合成途径
l 在正常生长情况下．柠 檬酸在细胞内不会积累。 因为柠檬酸不是代谢途 径的终产物，而且是黑 曲霉的良好碳源.
l 柠檬酸积累是菌体代谢 失调的结果。
柠檬酸
柠檬酸积累
二、柠檬酸发酵工艺
l 柠檬酸发酵工艺的发展分为三个阶段：
1.表面发酵； 2.深层发酵； 3.固体发酵工艺。
课程名称:生物工艺学
1
柠檬酸发酵机理
2
柠檬酸培养工艺方法
一、柠檬酸发酵机理
1.柠檬酸简介
l 早期，柠檬酸主要从柑橘、菠 萝和柠檬等水果中提取。
l 1893年，wehmer发现青霉可以 生成柠檬酸。
l 19l7年Currie使用黑霉菌的浅 盘发酵生产柠檬酸，为柠檬酸 的发酵奠定基础。
黑曲霉
浅盘发酵
1.表面发酵
2.深层发酵
3.固体发酵
1.表面发酵工艺
l 发酵室为不锈钢金属制大型发酵 盘，具有保温、保湿。
l 原料：糖蜜原料。
l 发酵条件：采用间歇培养；孢子 需1-2天发芽，30℃，发酵6-8d， pH降至2。
l 生产力：柠檬酸0.2-0.4kg/m3.h
糖蜜原料 发酵控制室
2.固体发酵法
柠檬酸发酵工艺
（1）凝聚
发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层
的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。
阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：
Al3+ >Fe3+ >H+ >Ca2+ >Mg2+ >K+ >Na+ >Li+
常用的凝聚剂电解质有：
硫酸铝 Al2(SO4)3•18H2O（明矾）； 氯化铝 AlCl3•6H2O; 三氯化铁 FeCl3; 硫酸亚铁 FeSO4· 7H2O ； 石灰；ZnSO4；MgCO3
存在一定的毒性（微毒），特别是阳离子型聚丙 烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。
医药和食品工业：聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（无毒），聚苯乙烯 类衍生物，无机高分子聚合物絮凝剂（聚合铝盐、聚合铁盐等）， 天然有机高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨 胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等）。
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当然，聚丙烯酰胺在食物中的含量远远高于化妆品中的 含量，人体对于丙烯酰胺的摄入也多来自饮食。
（3）混凝
凝聚和絮凝统称为混凝。
对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型 高分子絮凝剂，同时具有降低胶粒双电层电位和产生 吸附桥架的双重机理
4.加入助滤剂
一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量 的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过 滤阻力。 常用的助滤剂有： 硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等， 最常用的是硅藻土（特点：质轻、多孔、高强、耐磨、绝缘、绝热、吸附、 稳定 ）。
絮凝——在胶体或悬浮体内加入极少量的可溶性高分子化合 物，使水或液体中悬浮微粒集聚变大，或形成絮团，从而加快 粒子的聚沉，达到固-液分离的目的。 凝聚——指在电解质作用下，胶体和分散系双电层压缩、ζ电 位破坏、电性中和而脱稳，并聚集为絮状颗粒的过程。 凝聚过程就是胶粒聚集成较大颗粒的过程。 聚沉——胶体的微粒在一定条件下发生聚集的现象。向胶体 中加入盐时，其中的阳离子或阴离子能中和分散质微粒所带的 电荷，从而使分散质聚集成较大的微粒，在重力作用下形成沉 淀析出。这种胶体形成沉淀析出的现象称为胶体的聚沉。
柠檬酸生产工艺
柠檬酸生产工艺介绍摘要：柠檬酸应用广泛，在食品、医药等方面都占有重要位置。
制取所用材料价格低廉，条件要求适中，且采用的深层发酵法具有普遍、经济的特点。
关键词：柠檬酸发酵1.柠檬酸简介柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸。
柠檬酸是无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，无臭，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有后涩味。
柠檬酸是生物体主要代谢产物之一，它在植物体内常与酒石酸、苹果酸、草酸等有机酸共存，在动物组织中柠檬酸以游离状态或以金属盐的形式存在。
商品柠檬酸主要有一水化合物和无水物。
柠檬酸用途极其广泛，在食品工业广泛用于酸味剂、增溶剂、抗氧化剂、缓冲剂、除腥脱臭剂等。
在其他工业中，可作金属净化剂、去垢剂、分散剂、电镀缓冲剂和配位剂、胶粘剂，并可用于治理工业废气、废水、回收金属等。
在药物中可产生泡腾，使药物中活性配料迅速溶解并提高味觉能力。
制取柠檬酸可以从水果中提取、化学合成法和生物发酵。
其中发酵是最常用和最有经济价值的方法。
2.柠檬酸发酵菌种及原材料。
2.1菌种及原材料柠檬酸发酵工艺中，具有工业生产价值的微生物有黑曲霉、棒曲霉、文氏曲霉、芬曲霉、丁烯二酸曲霉、橘青霉、解脂假丝酵母等，其中黑曲霉和文氏曲霉在深层液态发酵生产柠檬酸最具有商品竞争优势。
凡能通过微生物代谢而产生柠檬酸的物质，都可以作为柠檬酸的发酵原料。
如乙醇、木质素、纤维素、淀粉、蔗糖、乳糖、正烷烃和脂肪等。
黑曲霉生产菌可以在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、糖蜜等多种培养基中生长、产酸，而且产量在微生物中最高。
2.2黑曲霉在米曲汁或麦芽汁培养基上菌丝白色，不是绒球状，凸起。
边缘整齐，菌落较小，带皱折。
在麦芽汁培养基上生长4d成熟的孢子呈黑褐色。
在察氏培养基上生长较慢，菌落边缘整齐，分生孢子梗短，分生孢子着生较密。
菌丝顶端着生稀疏的大型的黑褐色孢子德，成熟后呈开花状而崩裂。
分生孢子是串珠状着生，黑褐色，表面粗糙且有明显的刺状突起，4.7-5.2µm，成熟后遇振动易散落。
柠檬酸发酵原理
谢 谢！
JUST DO IT！
人手洗手消毒前后手部卫生状况对比
• 洗手前：1300个/cm2 • 清水洗手后：1000个/cm2 • 肥皂洗手后：80个/ cm2 • 消毒后：0个/ cm2
未洗的手
未打皂液洗过的手
洗净的手（用洗剂）
洁净的手（消毒后）
进 入 工 作 岗 位 以 后 环境卫生是实验室、发酵工 人、消毒人员及厂区工作人 员必须时刻铭记的基本常识。
黑曲霉如何积累柠檬酸
黑曲霉耐酸，耐低PH。 黑曲霉发酵柠檬过程中，在发酵初期， 发酵液中萄葡糖含量较高，而高浓度的萄 葡糖正是黑曲霉α-酮戊二酸脱氢酶合成的 抑制物，这样一来TCA循环就中断了，酸 度得到积累（注意此时积累的是酸度而不 仅是柠檬酸），但是当酸度积累到PH≤2.0 时，催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠檬酸正 逆反应的顺乌头酸水合酶，不表现出活力 ，这样TCA循环在合成柠檬酸之后就不会 向后继续反应，从而达到柠檬的积累。
传播污染的四大媒介－人
第四个帮凶可能是大家都不会想 到的，它就是我们自己，人体是一个 永不休止的污染媒介。当您每天来工 厂上班时，您也许随身将几百万细菌
带入工厂。
人员污染的途径和方式
人的头发和皮肤：每分钟从人类皮肤中要散发出约10,000个微
生物
嘴巴和鼻子——水滴：呼吸、咳嗽和喷嚏将产生出大量水滴，
黑 曲 霉 生 长 周 期
发酵常见染菌及区别
一、酵母菌是一些单细胞真菌，体积较细 菌较大 ，1~5微米*5~30微米，而细菌直 径或宽度不超过1微米，长不超过5微米， 有氧无氧均可生存，低PH也可生存。
二、细菌主要由细胞膜、 细胞质、核质体等部分构 成 ，球菌、杆菌和螺形 菌 ，低PH难以存活，易 自溶。
黑曲霉发酵提取柠檬酸
黑曲霉发酵提取柠檬酸实验一黑曲霉保藏菌的复苏实验目的：了解黑曲霉保藏菌的生长状况和保藏菌的活化处理过程。
实验原理：能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉中的一些菌株都能够利用淀粉质原料大量积累柠檬酸。
目前国内主要利用黑曲霉（Aspergillus niger）通过固体发酵或液体深层发酵生产柠檬酸。
发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是微生物产生糖化霉首先将淀粉转变为葡萄糖，葡萄糖经过糖酵解途径（EMP）转变为丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶的作用下乙酰辅酶A和草酰乙酸合成为柠檬酸。
产生的柠檬酸经碳酸钙作用形成柠檬酸钙沉淀，再经稀硫酸作用释放出柠檬酸。
实验步骤：1、观察保藏菌的生长状况，记录PH2、黑曲霉复苏培养基的配制（1）、分别称取蔗糖30g，KNO3 1g, K2HPO4 1g, 麸皮10%，MgSO4.7H2O 0.5g, KCL 0.5g, FeSO4.7H2O 0.01g, 于500ml搪瓷缸中。
（2）、加蒸馏水100ml，调节pH至7.0-7.2（3）、牛皮纸包扎，灭菌3、保藏菌的活化扩增（1）配制5ºBe’麦芽琼脂培养基（2）20℃麦芽汁，糖度为5（3）加0.7%的琼脂（4）加热，使其沸腾（5）分装与试管中，每管约3ml（6）包扎灭菌，制成斜面培养基（7）在超净工作台上划菌，包扎（8）置于28~30℃培养箱中培养实验要求：分析复苏和保藏培养基的区别，原因，营养成分的差异和操作的目的和意义。
并加注参考文献。
实验二黑曲霉一级种子的制备实验目的：了解种子扩大培养的程序，比较复苏均至一级种子的生境变化。
实验原理：黑曲霉在生长过程中不仅需要有充足的营养成分，而且还需要一定的氧气环境等。
通过拌菌等增加菌种与培养基营养成分的充分接触，获得良好的生长。
实验步骤：1、观察活化的保藏菌生长状况，并记录。
2、在超净工作台上，将2-4管/组，活化的保藏菌分别加入约3mL双蒸水。
2-1柠檬酸发酵工艺-zy
A、置于γ射线下照射处理，照射后孢子悬浮液稀释， 取0.1mL涂平板。
B、DES诱变处理，孢子悬浮液4.5mL，加入 2%DES0.5mL，于30℃振荡5min，再加入 75%Na2S2O310mL，解毒10min或稀释10倍后涂平 板。
C、复合诱变，Co60 γ射线---高温处理---亚硝基胍处 理等，低剂量多次复合处理。
柠檬酸在制药方面的应用
❖ 1、作为泡腾片：柠檬酸与NaCO3或NaHCO3水溶液反应， 生成大量CO2（泡腾）和柠檬酸钠，可使药物中活性配料迅 速溶解并增强味觉能力。
❖ 2、柠檬酸糖浆是发热病人的清凉饮料，具有清凉、解毒功 效。
❖ 柠檬酸普遍用于营养口服液中，维持活性配料的稳定性，加 强防腐剂效果。
❖ 柠檬酸钙盐在水中的溶解度较小；并且随温度 升高进一步降低。
❖ 柠檬酸钙的溶解度也与酸度有关，pH 值降低 时溶解度增大
❖ 如果温度升高至95～100℃， Ca3(C6H5O7)·4H2O的溶解度可进一步降低为 0.578g/L水。
❖ 将溶液加热至沸，使柠檬酸钙盐比较完全沉淀 析出，而其它有机酸钙（葡萄糖酸钙、草酸钙） 等物质溶解。
采用不同原料所用菌种不同
淀粉原料:
TD-01,初糖浓度20.8%，96h,产酸率20.24%，转化 率97.28%.
薯干原料: 糖蜜原料:
上海工微所 东酒2号 N-558 Co827 T419
初糖浓度18-19%，60-90h,产酸率20.24%，转化 率97%.
川柠-17-66（四川食品研究所），8668（黑龙江轻工 所），产酸14%，性能粗放，抗金属离子能力强，以甘 蔗糖蜜不需要黄血盐预处理。
烷基磺酸盐和烷基硫酸盐：EMS甲基磺酸乙酯、DES硫酸二乙酯 亚硝基烷基化合物：亚硝基乙基脲（NEH）、N-亚硝基-N-乙基脲烷 （NEU） 亚硝酸（改变核酸结构和性质） 叠氮化钠（可获得较高的突变频率）、环氧乙烷、吖啶橙等
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黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程1.首先，选择适当的黑曲霉菌种作为发酵的起始种。
First, choose the appropriate Aspergillus Niger strain as the starting culture for fermentation.2.将黑曲霉菌种接种到含有适量碳源和氮源的发酵基质中。
Inoculate the Aspergillus Niger strain into a fermentation medium containing suitable amounts of carbon and nitrogen sources.3.确保发酵基质的pH值在合适的范围内，通常为3.0至6.0。
Ensure that the pH of the fermentation medium is within the appropriate range, typically between 3.0 and 6.0.4.控制发酵温度在25°C至35°C之间，提供适宜的温度条件。
Control the fermentation temperature between 25°C and 35°C to provide suitable conditions for growth.5.确保发酵过程中的通气充足，以促进微生物的生长和代谢活动。
Ensure adequate aeration during the fermentation processto promote microbial growth and metabolic activity.6.在发酵过程中定期监测黑曲霉的生长情况和产酸量。
Regularly monitor the growth of Aspergillus Niger and the production of citric acid during the fermentation process.7.当黑曲霉的生长达到高峰并且产酸量稳定时，进行收获。
Harvest when the growth of Aspergillus Niger reaches its peak and the citric acid production stabilizes.8.进行发酵液的分离和精制，以获取高纯度的柠檬酸。
Separate and refine the fermentation broth to obtainhigh-purity citric acid.9.对精制后的柠檬酸进行结晶和干燥处理，制备成品柠檬酸产品。
Crystallize and dry the refined citric acid to producethe final citric acid product.10.对发酵工艺中的各个环节进行严格的质量控制和分析，确保产品质量和安全性。
Conduct rigorous quality control and analysis at each stage of the fermentation process to ensure product quality and safety.11.发酵过程中产生的废弃物应进行合理的处理和利用，减少对环境的影响。
The waste generated during the fermentation process should be properly treated and utilized to minimize environmental impact.12.黑曲霉发酵生产柠檬酸的工艺流程经过多次优化和改进，以提高产量和降低成本。
The fermentation process for citric acid production using Aspergillus Niger has been optimized and improved to increase yield and reduce costs.13.发酵过程中需注意微生物的纯度和活力，确保黑曲霉菌种的良好状态。
Attention should be paid to the purity and vitality of the microorganisms during the fermentation process to ensure the good condition of the Aspergillus Niger strain.14.在发酵条件下，黑曲霉通过代谢途径将碳源转化为柠檬酸，并产生气体和热量。
Under fermentation conditions, Aspergillus Niger converts carbon sources into citric acid through metabolic pathways, producing gas and heat.15.发酵过程需要持续维持适宜的pH值和温度，以保证黑曲霉的正常生长和柠檬酸的产生。
The fermentation process requires continuous maintenance of appropriate pH and temperature to ensure the normal growth of Aspergillus Niger and the production of citric acid.16.可采用蔗糖、玉米糖浆、葡萄糖等作为黑曲霉的碳源，促进柠檬酸的合成。
Sucrose, corn syrup, glucose, etc. can be used as carbon sources for Aspergillus Niger to promote citric acid synthesis.17.发酵过程中需要加入适量的氮源，如尿素、氨水等，以维持微生物的生长和代谢活动。
An appropriate amount of nitrogen source, such as urea, ammonium hydroxide, etc., needs to be added during fermentation to maintain microbial growth and metabolic activity.18.发酵结束后，可以对发酵液进行过滤和离心，以分离固体颗粒和细菌残渣。
After fermentation, the fermentation broth can befiltered and centrifuged to separate solid particles and bacterial residues.19.通过对经过离心分离的发酵液进行洗涤和干燥处理，得到干净的柠檬酸晶体。
By washing and drying the centrifugally separated fermentation broth, clean citric acid crystals can be obtained.20.柠檬酸的生产需要遵循严格的卫生标准和生产流程，以确保产品的质量和卫生安全。
The production of citric acid requires strict adherence to hygiene standards and production processes to ensure the quality and safety of the product.21.发酵工艺流程中，需要定期对发酵液进行抽样，并进行化学成分分析和微生物检测。
Sampling of the fermentation broth needs to be carried out regularly in the fermentation process, and chemical composition analysis and microbial testing need to be performed.22.柠檬酸的发酵生产是一个持续、稳定的工艺过程，需要对生产设备和工艺流程进行合理的优化和改进。
The fermentation production of citric acid is a continuous and stable process that requires rational optimization and improvement of production equipment and processes.23.发酵液中产生的柠檬酸可以通过结晶、离心、干燥等工艺步骤得到精制的柠檬酸产品。
The citric acid produced in the fermentation broth can be refined through processes such as crystallization, centrifugation, and drying to obtain purified citric acid products.24.对发酵液、柠檬酸晶体等产品进行质量检验和分析是确保产品质量的重要步骤。
Quality inspection and analysis of the fermentation broth, citric acid crystals, and other products are important stepsto ensure product quality.25.监控和调节发酵过程中的各项参数是保证黑曲霉发酵生产柠檬酸的关键。
Monitoring and adjusting various parameters during the fermentation process is crucial to ensure the production of citric acid by Aspergillus Niger.26.发酵工艺流程的稳定性和可控性对生产高品质柠檬酸具有重要影响。
The stability and controllability of the fermentation process have a significant impact on the production of high-quality citric acid.27.生产柠檬酸的发酵工艺需要遵循相关的生产标准和规定，确保产品符合卫生安全和质量要求。
The fermentation process for producing citric acid needs to adhere to relevant production standards and regulations to ensure that the product meets hygiene and quality requirements.28.发酵基质中的碳源和氮源的合理选择和投放对黑曲霉的生长和柠檬酸的产生至关重要。