实验24-黑曲霉发酵生产柠檬酸
教案实验四 黑曲霉发酵生产柠檬酸
实验四黑曲霉发酵生产柠檬酸【目的要求】1. 掌握实验室菌种种子生产方法。
2. 掌握柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。
3. 熟悉并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况；4. 掌握钙盐法提取柠檬酸的原理与方法。
【基本原理】黑曲霉发酵生产柠檬酸实验中需要大量活化的孢子，其制备是采用麸皮培养基中保藏的黑曲霉孢子，在新的麸皮培养基上于适当的温度下活化并大量繁殖，从而产生大量活化孢子。
黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）转变为丙酮酸；丙酮酸氧化脱羧形成乙酰辅酶A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。
黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环不能充分进行，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。
其理论反应式为：C6H12O6+1.5O2→C6H8O7+2H2O除了含有大量柠檬酸外，还有大量的菌体，少量没有被黑曲霉利用的残糖、蛋白质、脂肪、胶体化合物以及无机盐类等。
柠檬酸提取就是从成分复杂的发酵液中分离提纯获得柠檬酸。
从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸的方法主要有：钙盐-离子交换法、溶剂萃取法、“吸交”法、离子色谱法等。
目前国外生产主要采用钙盐-离子交换法和溶剂萃取法；国内生产主要采用钙盐-离子交换法，“吸交”法和离子色谱法正在推广中。
钙盐法首先采用过滤或超滤除去发酵液中的菌丝体等不溶残渣，然后在澄清过滤液中加入碳酸钙（或氢氧化钙）发生中和反应，生成难溶的柠檬酸钙沉淀，利用在80-90℃下柠檬酸钙的溶解度极低的特性，通过过滤（或离心）将它与可溶性的糖、蛋白、氨基酸、其它有机酸、无机离子等杂质分离开，用80-90℃热水反复洗涤柠檬酸钙，除去残糖和其他可溶性杂质，经过滤（或离心）获得较净的柠檬酸钙，然后在洗净的柠檬酸钙中缓慢地加入稀硫酸进行酸解反应，生成柠檬酸和硫酸钙沉淀，经过滤（或离心）除去硫酸钙沉淀，获得粗制的柠檬酸。
黑曲霉产柠檬酸
柠檬酸发酵工艺条件的优化摘要柠檬酸（2-羟基丙烷三羧酸），是重要的工业原料。
可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。
实验研究了不同硫酸铵浓度分别对黑曲霉摇瓶发酵和实罐发酵生产柠檬酸的影响。
在菌浓度、发酵过程PH、酸度、残糖、温度在发酵过程中的变化几个方面对实罐和摇瓶发酵进行了相关比较。
结果表明：1）摇瓶发酵的最适硫酸铵浓度为0.4%；实罐发酵最适硫酸铵浓度为0.5%，实罐发酵时硫酸铵浓度过高将产生大量泡沫不利发酵；2）实罐发酵与摇瓶发酵在起始含糖量、菌浓度及发酵温度相同的情况下，随发酵进行，摇瓶发酵的温度更稳定，两者的菌浓度、残糖、PH值变化规律高度一致，酸度变化规律基本一致。
另外实验还就温度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响作用进行了探讨，结果表明实罐发酵的最适温度约为35℃，温度过高会导致发酵液水分流失过多而使发酵失败。
1. 课题背景1.1柠檬酸简介柠檬酸（citric acid）是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。
柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸、2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸.分子式：C6H8O7 （相对分子质量：192.13）物理性质：无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。
极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大。
化学性质：从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质。
加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。
柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。
1.2柠檬酸用途柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。
另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。
黑曲霉产柠檬酸最适发酵条件的探讨
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１材料与方法 ．
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【 键词 】 黑 曲霉 关 柠檬酸 发 酵 条件 添 加 剂 ， ５０×１４个 ／ ｌ接 入 菌 种 ， 床 转 速 ３ ０ 按 ． ０ ｍ 摇 ０ ｒ／ｍ ｎ 温 度 ３ ℃ ｉ， ４ 培 养 ４ ｈ后 记 录产 酸情 况 。 ８
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实验4 柠檬酸发酵
实验4 柠檬酸发酵及提取及精制1.实验目的与要求：了解利用黑曲霉生产柠檬酸的原理与流程，掌握柠檬酸的发酵生产方法。
了解树脂提纯及精制柠檬酸的方法，进一步学习并掌握离子交换法的操作过程。
2.实验主要内容：本实验以糖为发酵原料，黑曲霉为产生菌。
黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强。
ph1.6～1.7时尚能生长。
且酸度大时产生葡萄糖酸、草酸等副产物较少，故进行柠檬酸发酵时，培养液以在pH2-3为宜。
在一般发酵中，均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂肪酸如甲酸、乙酸等称为挥发酸，而乳酸、柠檬酸等称为非挥发酸。
挥发酸和非挥发酸的总和称总酸。
酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法及比色法等。
若待测液色泽很深，可采用外指示剂法。
本试验用中和法测定柠檬酸发酵中的总酸。
柠檬酸的定性检验用Deniges 试剂。
发酵完后，利用树脂对柠檬酸进行提纯及精制。
3.实验所需仪器设备：三角瓶、酸式滴定管、烧杯、吸管、水浴锅、恒流泵、树脂交换柱、收集器、旋转蒸发仪、酒精灯、滤纸、漏斗、碱滴定管、铁台、蝴蝶夹、酚酞指示剂、布氏漏斗、抽滤纸、抽滤水泵、离心机和离心管、滴管、天平、玻璃棒、牛角勺、广泛pH 试纸4.实验所需试剂（每班所需试剂量）：阴离子交换树脂2000g、阳离子交换树脂2000g、碳酸钙500g、硫酸500g1、黑曲霉斜面菌种3支、硝酸铵200g，KH2P04 200g，MgS04 250g，蔗糖2000g， HCl500ml、NaOH500ml 、H2S04ml5.实验步骤：（1）树脂预处理分别称取一定量的树脂(阳离子交换树脂和阴离子交换树脂)，清洗漂去杂质，放在交换柱中，先用1mol／LNaOH，后用水洗，再用1mol／L HCl，最后用水洗至pH≥4。
每次所用溶液体积为树脂体积的3倍，流速的大小为柱截面积，两种树脂的预处理方法相同。
（2）柠檬酸发酵1）接种取柠檬酸发酵培养液3瓶，用接种环向每瓶接入黑曲霉孢子2～3环，25―28℃摇床培养5～7d。
黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程
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黑曲霉产柠檬酸工艺条件的优化解析
生物与化学工程学院专业实验报告题目黑曲霉产柠檬酸发酵工艺条件的优化学生姓名：王一专业班级：生物工程2012010302班学号：1201815076课程名称：发酵生产技术综合实验指导教师：李信义日期：2013.6.2--2013.6.29黑曲霉发酵产柠檬酸工艺条件的优化[摘要]：柠檬酸是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。
柠檬酸又名枸橼酸,分子式为C6H8O7,物理性质：无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，有强烈酸味，稍有涩味；极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大。
化学性质：从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。
柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+ 可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。
同时柠檬酸，是重要的工业原料。
可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。
本实验研究了不同接种量、温度、PH、发酵有效体积、溶解氧对黑曲霉产柠檬酸发酵的效率，已选出最适宜黑曲霉发酵产酸的条件。
[关键词]：黑曲霉柠檬酸发酵条件优化[Abstract]：Citric acid is one of the main metabolites of the organism, is widely distributed in nature, mainly in lemon, orange, pineapple, peach, pear, plum, fig fruit, especially in the most immature content. citric acid or citric acid. Molecular formula is 786O H C ,physical properties: colorless transparent or translucent crystal, or granular, granular powder, although have strong sour, slightly astringent. Easily soluble in water, the solubility increases with the increasing of temperature. Chemical properties: citric acid from the structure is a kind of three carboxylic acid compounds, heated to 175°C it will decompose to produce carbon dioxide and water, the remaining number of white crystal. Citric acid is a strong organic acid, 3 H ionization; heating can be decomposed into a variety of products, reacts with the acid, alkali, glycerin etc..At the same time, citric acid, is an important industrial raw materials. It can be extracted from plant materials, can also be prepared by sugar fermentation. The experimental study of different inoculation quantity, temperature, PH, dissolved oxygen, fermentation volume on the efficiency of citric acid fermentation of Aspergillus niter, has to choose the most suitable fermentation conditions of Aspergillus niter.[Keywords]：Aspergillus niter Citric acid Fermentation Conditions Optimization目录1.综述 (1)2.实验仪器药品材料及分析方法 (1)2.1实验设备 (1)2.2实验试剂及材料 (1)2.3菌株 (1)2.4分析方法 (1)3.实验设计 (2)3.1培养基的制备 (2)3.2斜面种子和液体种子的制备 (2)3.3温度对柠檬酸发酵的影响 (2)3.4溶解氧对柠檬酸发酵的影响 (2)3.5接种量对产柠檬酸发酵的影响 (2)3.6发酵液有效体积对产柠檬酸发酵的影响 (3)3.7初始PH值对产柠檬酸发酵的影响 (3)3.8柠檬酸的测定 (3)4.结果与分析 (3)4.1不同初始PH的柠檬酸产率 (3)4.2不同接种量的柠檬酸产率 (4)4.3不同温度的产柠檬酸率 (5)4.4不同发酵液有效体积的产柠檬酸率 (6)4.5不同溶氧的产柠檬酸率 (7)4.6正交实验及结果 (7)5.结论与展望 (8)5.1结论 (8)5.2展望 (8)6.参考文献 (8)7.感受 (9)1.综述柠檬酸（citric acid）又名枸橼酸。
实验七黑曲霉发酵柠檬酸
需要加强黑曲霉发酵柠檬酸的 应用研究，探索其在不同领域
的应用潜力。
感谢您的观看
THANKS
06
结论与展望
本实验的结论
黑曲霉发酵柠檬酸实验表明，在适宜的条件下， 黑曲霉能够有效地将葡萄糖转化为柠檬酸。
通过优化培养基成分和发酵条件，可以提高柠檬 酸的产量和产率。
本实验为黑曲霉发酵生产柠檬酸提供了理论依据 和技术支持，为工业化生产提供了参考。
黑曲霉发酵柠檬酸的应用前景
01
柠檬酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工等 领域。
柠檬酸的生物合成途径主 要涉及糖酵解、三羧酸循 环和柠檬酸循环三个过程。
丙酮酸在丙酮酸羧化酶的 作用下生成草酸，草酸进 一步被还原成柠檬酸。
ABCD
在糖酵解过程中，葡萄糖 被降解为丙酮酸，产生 ATP和NADH。
柠檬酸在三羧酸循环中被 氧化成二氧化碳和水，同 时释放能量供细胞代谢使 用。
影响柠檬酸发酵的因素
溶氧量控制
通过控制发酵罐内的搅拌速度和通气 量来调节溶氧量，以确保黑曲霉的正
常生长和代谢。
pH值监测与调节
定期监测发酵液的pH值，并适时添 加酸或碱来调节pH值至适宜范围。
泡沫控制
通过添加消泡剂或调节搅拌速度来控 制发酵过程中的泡沫。
柠檬酸的提取与测定
提取
发酵结束后，将柠檬酸菌泥与发酵液 分离，然后用有机溶剂将柠檬酸提取 出来。
01
02
03
营养物质
碳源、氮源、磷源等营养 物质的种类和浓度对柠檬 酸的产量有显著影响。
温度和pH值
适宜的温度和pH值可以提 高黑曲霉的发酵活性和柠 檬酸的产量。
溶氧浓度
溶氧浓度对柠檬酸的产量 也有影响，过高或过低的 溶氧浓度都不利于柠檬酸 的积累。
实验24黑曲霉发酵生产柠檬酸
实验24⿊曲霉发酵⽣产柠檬酸⿊曲霉发酵⽣产柠檬酸柠檬酸（citric acid ）⼜名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid ）、2--羟基丙烷-1，2，3-三羧酸（2-hydroxy propane-1，2，3-tricarboxylic acid ）。
商品柠檬酸有两种形式：⼀种为⽆⾊透明，有光泽的含⼀个结晶⽔的晶体，其分⼦式为C 6H 807·H 2O,相对分⼦质量为210.14。
另⼀种为⽆⾊半透明全对称晶体的⽆⽔柠檬酸，分⼦式为C 6H 8O 7，相对分⼦质量192.13。
柠檬酸因⽆毒、⽔溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被⼴泛应⽤于⾷品、医药、化⼯、化妆品、清洗（洗涤）、建筑等⼯业部门。
1893年前，⼈们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。
1893年后发现微⽣物可产⽣柠檬酸，1951年美国Miles 公司⾸先采⽤深层发酵法⽣产柠檬酸。
我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵⽣产柠檬酸，60年代开始采⽤薯⼲粉直接深层发酵法⽣产柠檬酸。
能够产⽣柠檬酸的微⽣物很多，青霉、⽑霉、⽊霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的⼀些菌株都能够利⽤淀粉质原料或烃类⼤量积累柠檬酸。
⾄今世界上消费的柠檬酸主要采⽤发酵法，⽽最具商业竞争优势的是采⽤⿊曲霉（Asp.niger ）、⽂⽒曲霉(Asp.Wentii )和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。
⽬前国内外普遍采⽤⿊曲霉的糖质原料发酵⽣产柠檬酸。
本实验以薯⼲粉或⽟⽶粉为原料，采⽤⿊曲霉，通过深层液体（摇瓶）发酵产⽣柠檬酸。
柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加⼊碳酸钙中和，⽣成柠檬酸钙沉淀。
将获得柠檬酸钙再⽤稀硫酸酸解⽣成柠檬酸和硫酸钙沉淀⽽制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性碳脱⾊、离⼦交换脱盐制得精制柠檬酸液。
精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP-98版标准的⽆⽔或⼀⽔柠檬酸。
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黑曲霉发酵生产柠檬酸
柠檬酸（citric acid ）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid ）、2--羟基丙烷-1，2，3-三羧酸（2-hydroxy propane-1，2，3-tricarboxylic acid ）。
商品柠檬酸有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为C 6H 807·H 2O,相对分子质量为210.14。
另一种为无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为C 6H 8O 7，相对分子质量192.13。
柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、清洗（洗涤）、建筑等工业部门。
1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。
1893年后发现微生物可产生柠檬酸，1951年美国Miles 公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。
我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法生产柠檬酸。
能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。
至今世界上消费的柠檬酸主要采用发酵法，而最具商业竞争优势的是采用黑曲霉（Asp.niger ）、文氏曲霉(Asp.Wentii )和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。
目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸。
本实验以薯干粉或玉米粉为原料，采用黑曲霉，通过深层液体（摇瓶）发酵产生柠檬酸。
柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加入碳酸钙中和，生成柠檬酸钙沉淀。
将获得柠檬酸钙再用稀硫酸酸解生成柠檬酸和硫酸钙沉淀而制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性碳脱色、离子交换脱盐制得精制柠檬酸液。
精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP-98版标准的无水或一水柠檬酸。
5.3.1 柠檬酸发酵 1、 实验目的
了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及发酵过程中生化指标的分析方法。
2、实验原理
黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP ）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO 2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A ，然后在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶）的作用下生成柠檬酸。
黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的ɑ-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄型”,代谢流汇集于柠檬酸处,使柠檬酸大量积累并排出菌体外。
其理论反应式为:
O H O H C O O H C 27862612625.1+→+
柠檬酸理论得率为106.7%，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。
3、实验装置材料与流程 （1） 实验装置与材料
① 实验装置 旋转式摇床、恒温培养箱、高速离心机（4000-6500r/min ）。
② 菌种 黑曲霉（Asp.niger ）柠檬酸生产菌株Co8-27。
③ 材料 麸皮、马铃薯 、薯干粉、蔗糖、玉米粉、大麦芽、大米、琼脂、淀粉酶（中温酶与高温酶）。
④ 器皿 15mL 试管、100mL 三角瓶、2000mL 烧杯、500mL 三角瓶、离心管若干。
⑤ 试剂 0.1429mol/L NaOH 、1%酚酞试剂、斐林甲、乙溶液、0.01%标准葡萄糖溶液。
（2） 试剂
0.1429mol/L NaOH、1%酚酞试剂、斐林甲和乙溶液、0,01%标准葡萄糖溶液、淀粉酶（中
温酶和高温酶）
（3）实验流程
保藏菌株→活化菌株（斜面培养）→200mL三角瓶麸曲培养→500~1000mL三角瓶液体发酵。
（4）斜面培养基:
①马铃薯琼脂培养基去皮马铃薯200g切成小块，加水约500mL，煮沸30min，然后用纱布过滤，滤液加蔗糖20g，琼脂20g，溶化后自来水定容至1000mL，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内，121℃灭菌20min，取出摆成斜面备用。
②麦芽汁琼脂培养基2/3大麦芽加1/3大米磨碎成粉，按麦芽粉:水＝1:4比例加水，置60℃下糖化4h至碘液显示无色，然后离心15min，获得麦芽汁（或取啤酒厂未加酒花的麦芽汁）调整浓度50Brix，添加25g/L琼脂，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内。
于121℃灭菌15~20min，取出摆成斜面备用。
③一级种子（麸曲种子）培养基
含麸皮的查氏培养基（g/L）：蔗糖30；KNO31.0；K2HPO41.0；MgSO4·7H2O 0.5；KCI 0.5；FeSO4·7H2O 0.01；调节pH7.0~7.2，加水定容至1000mL，添加800g麸皮，拌匀至无干粉又无结团，分装入8~10个500mL三角瓶中,塞入8层纱布并包扎好。
于121℃下灭菌30min，趁热摇散，冷却至35℃备用。
麸曲培养基：取新鲜麸皮，用60目筛子筛去细粉，按麸皮:水＝1:1.0～1.3比例加水,拌匀至无干粉又无结团，或用水洗麸皮表面，挤去水分至有水感而水不下滴为宜。
上述麸皮装入500mL三角瓶中，每瓶装80～100g湿料，塞入8层纱布并包扎好。
于121℃下灭菌30min，趁热摇散，冷却至35℃备用。
④摇瓶发酵培养基
取细度为40目以上的薯干粉6～8g，装入500mL三角瓶中，再加入40mL水和5个单位α-淀粉酶（中温）/g薯干粉，于75~80℃下液化15min，瓶口塞入8层纱布包扎好，于110℃灭菌15~20min，冷却备用。
（5）玉米粉液化
取细度为60目以上的玉米粉300g装入2000mL烧杯中，加入1000mL水和7~8个单位α-淀粉酶（高温）/g玉米粉，于80℃液化10min后，继续加热至90℃保温30min，碘检不变色后，再加热到100℃煮沸（5~10min），趁热经过二层纱布过滤，滤液加水冷却并调整糖度至15~20%和蛋白质含量不超过4g/L，取过滤清夜40mL分别装入500mL三角瓶中，瓶口塞入8层纱布包扎好，于121℃灭菌15~20min，冷却备用。
4、实验步骤及方法
（１）种子制备
①斜面种子制备用接种环挑取冰箱保存的斜面菌种一环于斜面培养基上，于35℃恒温箱中培养3~5d，待长满大量黑色孢子后，即为活化的斜面种子。
②孢子悬浮液的制备用无菌移液管吸取5mL无菌水至黑曲霉斜面上，用接种环轻轻刮下孢子，装入含有玻璃球的三角瓶中，盖好塞子振荡数分钟。
每支斜面的孢子悬浮液可接2~3瓶麸曲三角瓶。
③吸取孢子悬浮液2mL接入上述麸曲种子培养基中，然后摊开纱布、扎好，并在掌心轻轻陪拍三角瓶，使孢子与培养基充分混合，于30~32℃下恒温培养1d后，再次拍匀，于35℃下培养，每隔12~24h摇瓶一次，孢子长出后停止摇瓶，这样继续培养3~4d，即成种曲。
（２）摇瓶发酵培养
将麸曲孢子（或直接将斜面种子）接种于上述薯干粉或玉米粉的摇瓶发酵培养基中。
接
种量：一支斜面接4~5瓶，一瓶麸曲孢子接20~35瓶。
500mL三角瓶装液量为40mL，于转速为200r/min（24h前为100r/min，24h后为200r/min）、300r/min（24h前为100r/min，24h 后为300r/min）旋转摇床上，35℃下培养3~4d。
（３）发酵过程检测
①发酵0h、24h、48h、72h、96h分别各取下两瓶检测残糖、柠檬酸含量，以观察发酵过程中黑曲霉的耗糖与柠檬酸生成速率。
②柠檬酸含量检测：一般检测发酵过程中的总酸，采用0.1429mol/LNaOH溶液滴定
发酵过滤清夜
③总糖及残糖(还原糖)测定: 采用斐林试剂法。
5、实验结果与记录
表5-3 黑曲霉柠檬酸摇瓶液体发酵（24h前为100r/min，24h后为200r/min）
6、实验数据处理
（1）平均耗糖速率（g/h）：单位时间内黑曲霉消耗糖（还原糖）的克数。
（2）平均柠檬酸生成速率（g/h）：单位时间内黑曲霉生成柠檬酸的克数。
（3）糖酸转化率（％）：黑曲霉生成柠檬酸的克数与消耗糖（还原糖）的克数之比的百分数。
7、实验结果与讨论
（1）试以发酵时间为横座标，以糖消耗量、柠檬酸生成量、糖酸转化率为纵座标作图，
说明三者随发酵时间的变化，并加以分析。
（2）试比较表1与表2的结果，阐述通风量对柠檬酸发酵产酸的影响。
8．参考文献
（1）王博彦、金其荣.《发酵有机酸生产与应用手册》北京.中国轻工业出版社.2000.
（2）罗大珍、林稚兰.《现代微生物发酵及技术教程》北京.北京大学出版社.2006.
9．预习与思考题
请预习《发酵有机酸生产与应用手册》和《现代微生物发酵及技术教程》中柠檬酸发酵部分并思考：
（1）柠檬酸发酵关键技术是哪些？
（2）若要提高柠檬酸发酵产量和发酵的糖酸转化率，应再考虑设计哪些实验？。