柠檬酸产生菌黑曲霉的筛选
黑曲霉基因组和柠檬酸生产菌种改造护理课件
发酵工艺优化
讨论如何通过调整培养基成分、 温度、pH等参数，优化黑曲霉 发酵生产柠檬酸的过程。
菌种筛选与改良
阐述如何通过选择性培养基和 基因敲除等技术筛选高产柠檬 酸的菌种，以及如何对菌种进 行遗传改良。
产物提取与纯化
介绍柠檬酸提取和纯化的常用 方法，如离子交换、电渗析、 结晶等。
黑曲霉基因组和柠檬酸生产菌种改造的护理实例
基因表达调控优化发酵
利用CRISPR-Cas9系统对关键酶编码 基因进行调控，优化发酵过程。
03 黑曲霉基因组在柠檬酸 生产菌种改造中的应用
黑曲霉基因组在柠檬酸生产菌种改造中的作用
提高柠檬酸产量
通过基因工程技术对黑曲霉基因组进行改造，可以增强其柠檬酸 合成酶的活性，从而提高柠檬酸的产量。
优化发酵过程
黑曲霉基因组和柠檬酸生 产菌种改造护理课件
目 录
• 黑曲霉基因组概述 • 柠檬酸生产菌种改造 • 黑曲霉基因组在柠檬酸生产菌
• 黑曲霉基因组和柠檬酸生产菌
01 黑曲霉基因组概述
黑曲霉基因组的基本特征
01
02
03
染色体数量
黑曲霉含有多个染色体， 通常为六到八个染色体。
基因组大小
每个染色体的基因组大小 在15-25Mb之间。
黑曲霉基因组的研究进展
全基因组测序
随着测序技术的发展，黑曲霉的 全基因组测序已经完成，为研究 其生物学特性提供了全面的分子 基础。
基因编辑技术
近年来，CRISPR-Cas9等基因编 辑技术被应用于黑曲霉基因组的 编辑，为改良其生产性能和耐受 性提供了有力工具。
02 柠檬酸生产菌种改造
柠檬酸生产菌种改造的必要性
提高柠檬酸产量
利用玉米粉产柠檬酸黑曲霉的筛选_常春
第20卷 第1期郑州轻工业学院学报(自然科学版)Vol.20 No.1 2005年2月JO URNAL O F Z HENGZHOU UNIVERSITY OF LIG HT INDUSTR Y (Natural Science)Feb 2005收稿日期:2004-06-30基金项目:河南省重大科技攻关项目(022*******)作者简介:常春(1973 ),男,河南省郑州市人,郑州大学工程师,浙江大学博士研究生,主要研究方向:生化设备强化.文章编号:1004-1478(2005)01-0047-03利用玉米粉产柠檬酸黑曲霉的筛选常 春, 王 娟, 马晓建, 方书起, 李洪亮(郑州大学化工学院,河南郑州450002)摘要:以从土壤中分离的黑曲霉为出发菌种,经过紫外线和DES 的诱变处理,得到了一株能利用玉米粉为原料的黑曲霉菌株AS 35.经过摇瓶发酵柠檬酸的对照试验,结果表明:该菌株能够较好地利用玉米粉,产酸能力达8 6%,原料转化率达66 2%,较原始菌种大大提高.关键词:黑曲霉;柠檬酸;玉米粉;发酵中图分类号:TQ920 文献标识码:ASelection of Aspergillus niger using corn powder asraw material to product citric acidC HANG Chun, W ANG Juan, MA Xiao_jian, FANG Shu_qi, LI Hong_liang(College o f Chem Eng ,Zhen gzhou Univ ,Zheng z hou 450002,China)Abstract:The initial As pergillus niger separated form soil was mutated by UV and DES,and by this a strain AS 35was obtained which could use corn powder as raw material The result of fermentation in flask showedthat the strain could use corn powder to produce citric acid effectively with 8.6%acid producing capacity and 66.2%transmission percentage of ra w material,which is better than those of initial Aspergillus niger This is helpful to the further optimization of fermentation medium Key words:As pergillus niger ;citric acid;corn powder;fermentation0 引言柠檬酸又名枸橼酸,在食品工业中广泛用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂、除腥脱臭剂、鳌合剂等.医药上广泛用到柠檬酸及其盐类.在化学工业中,柠檬酸及其盐类和衍生物广泛用作缓冲剂、消泡剂等.另外,柠檬酸是多种纤维的媒剂和助染剂,用于棉、麻、羊毛、聚酯纤维(尼龙)、维尼龙等纤维的染色[1].柠檬酸用途广泛,需求日益增长.利用薯干粉原料深层发酵是我国柠檬酸发酵生产的一大特色.但是,由于薯干粉涨价,柠檬酸的生产成本不断增高,所以,寻找价格低廉的替代原料成为柠檬酸生产的一个研究方向.在众多的原料中,资源丰富、价格低廉的玉米粉可作为生产柠檬酸的替代原料,用玉米粉为原料发酵生产柠檬酸已经越来越受到人们的关注[2].本文采用玉米粉作为柠檬酸发酵的原料,以黑曲霉作为出发菌种,对菌种进行选育,以获得能够以玉米粉为原料进行发酵的优良菌种,为以后优化工艺的研究打下坚实的基础.48 郑州轻工业学院学报(自然科学版)2005年 1 材料和方法1 1 出发菌种黑曲霉(Aspergillus niger),由土壤中分离获得.1 2 培养基斜面培养基:察氏琼脂培养基[3];筛选培养基:察氏培养基中加入少许溴甲酚绿指示剂和质量分数2%的玉米粉水解液;摇瓶培养基:玉米粉加入适量水,加热至85 ,加入耐高温的 -淀粉酶5U/g玉米粉,保温30min,碘液不变色后,继续加热至100 煮沸5min,纱布过滤,调整至合适的糖度和蛋白浓度.1 3 诱变方法用15W紫外灯照射孢子悬液,距离30c m,照射一定时间后,稀释分离涂布于筛选培养基中,33培养4d,选取变色圈大的菌落,作为备用菌株.由紫外线照射获得的相对稳定的高产菌株,制成孢子悬液,加入DES溶液,使 (DES)=1%,33恒温振荡30min,取1mL处理液加入0 5mLw(Na2S2O3)=25%的溶液中止反应,处理后的孢子液经稀释后涂布于筛选培养基中.1 4 分析方法酸度测定:取发酵滤液1mL,以酚酞为指示剂,用c(NaOH)=0 1429mol/L标准溶液滴定;柠檬酸纯度测定采用纸层析法[1].2 结果与讨论2 1 紫外线照射时间的确定采用常见的紫外灯照射进行诱变.照射时间对黑曲霉致死率的影响见表1.黑曲霉孢子悬液经过照射,再稀释分离后计数来计算致死率.致死率=起始菌落数-照射后存活菌落数起始菌落数100%致死率与照射时间成正比关系,即随着照射时间的延长,被照射菌种的死亡率也随之升高[3].一般来说,细胞存活率较高时,突变率往往随诱变剂量的增加而增大.通常认为,致死率在70%~80%时,诱变效果较好[4].所以,试验确定诱变照射时间为4min.表1 紫外线照射时间与致死率的关系时间/min012345678致死率/%054269758389921002 2 DES处理时间的确定DES对黑曲霉致死率的影响见表2.表2 DES处理时间与致死率的关系时间/min0102030405060致死率/%04069808691100依据与2 1同样的原理,选定致死率在70%~ 80%范围内为最适突变范围,最终确定DES处理时间为30min.2 3 利用玉米粉产柠檬酸黑曲霉的选育黑曲霉孢子悬液经紫外线处理后,稀释涂布于筛选培养基上,利用透明圈法进行初筛,共筛出120株透明圈与菌落直径比例大的黑曲霉,斜面保藏,利用摇瓶培养基33 培养7d,测总酸和纯度进行复筛,选出3株产酸高的菌株,作为下一步诱变的出发菌株.再利用DES进行进一步诱变,经初筛、复筛后,选育出1株产酸稳定、产率较高的菌株AS35.经多次传代后,它的产酸能力稳定.2 3 1 变色圈与菌落直径比例大小对产酸的影响 由于筛选培养基中加有溴甲酚绿指示剂,黑曲霉产酸会与之反应,在菌落周围形成一个透明的变色圈.变色圆与菌落直径比例大小对产酸的影响见表3.表3 变色圈与菌落直径比例大小对产酸的影响菌落序号变色圈直径 菌落直径产酸/% AS21 12 0AS31 55 0AS202 16 0AS353 58 6AS502 57 6AS673 08 2AS852 88 0一般认为,变色圈与菌落直径比例越大,菌株的产酸能力越强[5].结果表明该方法简单直观,而且有效.比例小的菌落,其产酸很低,当变色圈与菌落直径比例小于2 0时,产酸小于6 0%,当比例大于2 5时,产酸可达到8 0%以上.2 3 2 诱变前后菌种产酸能力的比较 初始菌种诱变前,利用玉米粉能力很弱,菌落透明圈很小,大多数几乎没有,这在加有玉米粉的筛选培养基中可明显看到.经紫外线、DES诱变后,利用玉米粉产酸的能力大大增强,可在筛选培养基中明显观察到较大的透明圈.分别将筛选前后的菌种接入摇瓶培养基中,进行摇瓶发酵试验进行产酸对照,结果见表4.第1期常 春等:利用玉米粉产柠檬酸黑曲霉的筛选 49表4 诱变前后菌种产酸能力的比较%菌种w(总糖)w(产酸)转化率原始菌种13 02 116 2AS3513 08 666 2诱变后黑曲霉可以较好地利用玉米粉为原料进行柠檬酸发酵,菌种对原料的利用率从16 2%升高到66 2%,表明经诱变后的菌种对玉米粉的转化有明显的提高.3 结论通过对从土壤分离的黑曲霉进行紫外线和DES 交替诱变,得到了一株能利用玉米粉为原料的产柠檬酸AS35菌种,经过摇瓶对照,该诱变菌种产酸能力从2 1%提高到8 6%,原料转化率从16 2%提高到66 2%.该菌株能很好地利用玉米粉,这为进一步优化发酵培养基及后继的试验研究奠定了基础.参考文献:[1] 金其荣,张继民,徐勤.有机酸发酵工艺学[M].北京:中国轻工业出版社,1994[2] 石忆湘,刘祖同.黑曲霉发酵玉米淀粉生产柠檬酸[J].清华大学学报(自然科学版),1998,28(6):52 55 [3] 陈代杰,朱宝泉.工业微生物菌种选育与发酵控制技术[M].上海:上海科学技术文献出版社,1995[4] 杜连祥.工业微生物学实验技术[M].天津:天津科学技术出版社,1992[5] 王风琴.提高柠檬酸生产菌产酸的措施[J].中国调味食品,1998,1(1):19 20(上接第42页)量,二是温度高会加快天然分子的降解,不利于提高产品质量.实验得出反应温度为50 是最佳反应温度.2)理论上,n(ClCH2COOH) n(F691)=1时可实现完全取代.但反应过程中存在大量副反应,使得ClC H2C OOH利用率下降,但过量的ClC H2C OOH参与释酸副反应,将使得醚化条件变差.实验得出n(ClCH2C OOH) n(F691)=1时效果最好.3)PCl3投放量越多,有机磷含量越高.但从实验结果看来, n(PCl3) n(F691)为0 5,1 0,1 5时有机磷的平均收率分别为81 3%,58 7%,50 8%,即PCl3的量增加,有机磷收率降低.4)氢氧化钠也有两方面作用,一是活化F691粉中纤维素和多聚糖的羟基,二是维持反应体系的pH值.因此,维持一定浓度的氢氧化钠对保证产品质量至关重要,实验得出n(NaOH) n(F691)=4为最佳投加量.4 结论1)通过醚化脱水反应,在F691上成功地接枝上了有机磷基团,制备了天然高分子接枝改性水处理剂LXL-A.2)制备LXL-A的最佳工艺条件为:反应温度50 ,n(ClC H2C OOH) n(F691)=1,n(PCl3) n(F691)=1 5,n(Na OH) n(F691)=4,此时制得的LXL-A具有最高的膦酸基团取代度.参考文献:[1] 肖锦,龙世明.几种水溶性天然高分子物及其改性絮凝剂的研制和应用[J].环境科学丛刊,1981,2(Z1):1619[2] 潘碌亭,肖锦,赵建夫,等.天然高分子改性阳离子絮凝剂的合成及对工业废水的处理[J].环境污染与防治,2002,24(3):159 161[3] 黄少斌,肖锦,叶振华.氮杂环季铵盐絮凝-缓释剂的研究[J].华南理工大学学报(自然科学版),1996,24(2):107 112[4] 尹华,彭辉,肖锦.喹啉季铵盐絮凝-缓蚀剂FNG-C的制备及其性能研究[J].环境化学,1999,18(1):7076[5] 潘碌亭,肖锦.天然高分子改性多功能水处理剂FIQ-C的制备及应用[J].工业水处理,2001,21(1):13 17 [6] 李琼,肖锦,肖晶.接枝共聚型天然高分子絮凝剂的性能及应用研究[J].工业水处理,1997,17(4):27 31 [7] 尹华,彭辉,肖锦.天然高分子改性阳离子絮凝剂的合成及其性能与机理的研究[J].重庆环境科学,1999,21(6):30 33[8] 王杰,肖锦,詹怀宇.两性高分子絮凝剂的制备及其应用研究[J].环境化学,2001,20(2):185 190[9] 祝静贞.磷酸淀粉酯取代度的测定[J].淀粉与淀粉糖,1989,(3):33 44。
产柠檬酸黑曲霉的筛选
产柠檬酸黑曲霉的筛选组长：高鸿飞组员：刘光明，何笑军，董慧，王志昆，胡明慧（西南大学药学院，重庆 400716）【摘要】：以从西南大学各处土壤中分离得到的黑曲霉作为出发菌株，并对其进行了初步分离。
利用酸分离法和变色圈法进行初步筛选，以产酸能力的强弱作为复筛指标，筛选到了一株稳定，高产柠檬酸的优势菌株。
并利用正交实验法优选柠檬酸产生菌的最佳发酵培养基，紫外诱变育种法探究高产菌诱变的较佳时间。
【关键词】：黑曲霉；酸分离法；变色圈法；筛选；正交试验；诱变柠檬酸又名枸橼酸，是目前以微生物发酵生产的重要有机酸之一。
产柠檬酸的微生物包括真菌、细菌和酵母，黑曲霉是迄今为止产柠檬酸最佳的微生物之一。
本次实验的目的是从土壤中筛选柠檬酸的黑曲霉高产菌株，并对其培养基的配置及最佳产酸条件进行探索，为今后进一步完善和优化其筛选工艺提供一定理论依据。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 出发菌种从西南大学食堂周围，山顶，试验田土壤中分离获得。
1.1.2 培养基察氏培养基成分硝酸钠3g磷酸氢二钾1g硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g氯化钾0.5g硫酸亚铁0.01g蔗糖30g琼脂20g蒸馏水1000mL制法：加热溶解，分装后121℃灭菌20min。
1.1.3其他柠檬酸，可溶性淀，Deniges试剂，蔗糖 NH4NO3，KH2PO4，MgSO4·7H2O ，溴甲酚绿指示剂，氢氧化钠溶液，KMn044溶液1.2 实验方法1.2.1黑曲霉筛选的流程土壤→稀释分离→变色圈平板→挑菌→纯化→摇瓶初筛→产物鉴定→复筛→正交实验→最优组合→诱变育种1.2.2 黑曲霉的分离与鉴定采集表层以下 5-10cm 处土壤，称 1.0g 土壤迅速倒入装有玻璃珠的无菌水三角瓶中，配成 10-2的土壤菌悬液，然后用移液管将其稀释到10-3、10-4、10-5倍。
分别吸取10-3、10-4、10-5倍稀释液注入到酸分离培养基上以及涂布到察氏琼脂培养基上，静置 5min 后倒置于恒温培养箱内 35℃培养 3-4d，观察菌落形态特征，挑选出黑曲霉疑似菌株。
黑曲霉产柠檬酸最适发酵条件的探讨
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１材料与方法 ．
１ １ 验 材 料 ．实 １ １ １ 验 菌 种 ．． 实
黑 曲霉 （ｓ ｅ ｇ １ｕ ｎ ｇ ｔ ２ ６ Ａ ｐ ｒ ｉ ｌ ｓ ｉｅ ） ０ ０
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Ｍｕ ２ ＣＩ
ｐ Ｈ值调整 为 ６ ７ 发酵温度 为 ３ ℃左右 ， ．， ４ 最佳碳源 为蔗糖 ， 最佳氮源为 （Ｈ ） Ｓ ４ 大多数 金属离子在低浓度和高浓度具有不 同的影响作用。以上各条件的 Ｎ４２０ ， 确 定 对柠 檬 酸 的大 规 模 工业 生产 有 重 要 意 义 。
【 键词 】 黑 曲霉 关 柠檬酸 发 酵 条件 添 加 剂 ， ５０×１４个 ／ ｌ接 入 菌 种 ， 床 转 速 ３ ０ 按 ． ０ ｍ 摇 ０ ｒ／ｍ ｎ 温 度 ３ ℃ ｉ， ４ 培 养 ４ ｈ后 记 录产 酸情 况 。 ８
ＦｅＳ ２ Ｏ４
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９３ １
９１ ４
８３ ３
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１ １２培 养 基 ．． 斜 面 种 子 培 养 基 （ 糖 ３ ｇＮ Ｎ 。ｇ Ｍ Ｓ ７ ２ ０ ５ ，Ｃ ０ ５ ， 蔗 ０ ， ａＯ３ ，ｇ Ｏ Ｈ０ ． ｇ Ｋ １ ． ｇ Ｆ Ｓ ７ ２ ００ ｇ ，２Ｐ４ｇ 琼 脂 １ｇ 蒸 馏 水 ｌ０ ｍ ， Ｈ ．） Ｐ Ａ液 ｅＯ．Ｈ０ ． ｌ ４ ＫＨ Ｏｌ ， ３， Ｏ ０ ｌ ｐ ７ ２ ，Ｄ 体 培养 基 （ 铃 薯 ２０克 ， 萄 糖 ２ 马 ０ 葡 ０克 ， 脂 ２ 琼 Ｏ克 ， 水 至 １０ 加 ０ ０毫 升 ） 发 ，
柠檬酸1
要充足氧的供应，保证更多的NADH2通过侧性呼吸链将H2交
给O2生成CO2和H2O，使呼吸产生的ATP减少，解除ATP对PFK酶 的反馈抑制，使EMP途径代谢流增大，丙酮酸和草酰乙酸生
成水平提高，柠檬酸产率提高。
G
G-6-P
(磷酸果糖激酶)
柠檬酸
I ,NH4 A
+
1.6－二磷酸果糖
丙酮酸
(丙酮酸羧化酶)
白、核酸和脂肪含量明显减少，而氨基酸和铵离子水
平升高（解除柠檬酸和ATP对PFK酶的抑制），丙酮酸 和草酰乙酸水平升高，柠檬酸大量积累。
4、氧对柠檬酸积累的调节
黑曲霉中除具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链
。标准呼吸链氧化时产生ATP，反馈抑制PFK酶，侧系呼吸链 不产生ATP。缺氧时，侧系呼吸链失活，导致柠檬酸产量急 剧下降。因此，在柠檬酸发酵过程中，特别是产酸期，一定
4
2014-6-5
二、国人的节奏—后来居上
1968年：上海酵母厂以淀粉为原料深层发酵工业化产生柠檬酸；同时，适用于 多种不同培养基质（淀粉、木薯、糖蜜等）的菌株不断的被选育出来； 1995年：开发了利用玉米渣发酵柠檬酸的新工艺； 我国柠檬酸发酵技术处于世界领先水平。如安徽丰原生化公司，柠檬酸生产能 力达18万吨，居世界第一位，占世界柠檬酸生产额的17%。另外，山东柠檬酸生 化有限公司的生产规模也是相当的大。目前，中国有柠檬酸生产厂近百家，总年 产能力约100万吨，是全球最大的柠檬酸生产国和出口国，近两年，出口量更是 超过国内总产量的90%，出口依赖严重。出口量在全球柠檬酸贸易总量中的比重 超过60%。2006年柠檬产量达到66万吨，出口60万吨；2007年，国内柠檬酸及 柠檬酸产量76万吨，共出口70.83万吨，2006年和2007年两年国内柠檬酸出口超 过总产量的90%，出口依赖严重。全球柠檬酸的年需求量约为130万吨左右，且 以年5%-7%的速度递增。2007年，全球柠檬酸需求继续以3%的幅度增长。随着 中国人民生活水平的提高，也带动了柠檬酸国内需求的大幅度增加。
钙盐沉淀法提取柠檬酸[整理]
![钙盐沉淀法提取柠檬酸[整理]](https://img.taocdn.com/s3/m/1943096e1611cc7931b765ce050876323112743d.png)
钙盐沉淀法提取柠檬酸摘要：利用黑曲霉进行分离复壮，然后利用改良的马丁培养基进行发酵，再通过离心发酵液，利用两种不同的方法钙盐沉淀法和离子交换法进行分离柠檬酸，比较两种方法分离柠檬酸的产量，及两种方法的优缺点，同时还要注意发酵过程中，菌种的产量。
关键字；黑曲霉钙盐沉淀离子树脂交换引言：生产史;1784年C.W.舍勒首先从柑橘中提取柠檬酸。
他是通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的。
天然柠檬酸最初产于美国加利福尼亚州、意大利和西印度群岛。
意大利的产量居首位。
到1922年，世界柠檬酸的总销售额的90％由美国、英国、法国等垄断。
发酵法制取柠檬酸始于19世纪末。
1893年C.韦默尔发现青霉（属）菌能积累柠檬酸。
1913年B.扎霍斯基报道黑曲霉能生成柠檬酸。
1916年汤姆和柯里以曲霉属菌进行试验，证实大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强。
如柯里以黑曲霉为供试菌株，在15％蔗糖培养液中发酵，对糖的吸收率达55％。
1923年美国菲泽公司建造了世界上第一家以黑曲霉浅盘发酵法生产柠檬酸的工厂。
随后比利时、英国、德国、苏联等相继研究成功发酵法生产柠檬酸。
这样，依靠从柑橘中提取天然柠檬酸的方法逐渐为发酵柠檬酸所取代。
1950年前，柠檬酸采用浅盘发酵法生产。
1952年美国迈尔斯试验室采用深层发酵法大规模生产柠檬酸。
此后，深层发酵法逐渐建立起来。
深层发酵周期短，产率高，节省劳动力，占地面积小，便于实现仪表控制和连续化，现已成为柠檬酸生产的主要方法。
中国用发酵法制取柠檬酸以1942年汤腾汉等报告为最早。
1952年陈声等开始用黑曲霉浅盘发酵制取柠檬酸。
轻工业部发酵工业科学研究所于1959年完成了200l规模深层发酵制柠檬酸试验，1965年进行了生产100t甜菜糖蜜原料浅盘发酵制取柠檬酸的中间试验，并于1968年投入生产。
1966年后，天津市工业微生物研究所、上海市工业微生物研究所相继开展用黑曲霉进行薯干粉原料深层发酵柠檬酸的试验研究，并获得成功，从而确定了中国柠檬酸生产的这一主要工艺路线。
黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程
黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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实验七黑曲霉发酵柠檬酸
需要加强黑曲霉发酵柠檬酸的 应用研究，探索其在不同领域
的应用潜力。
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06
结论与展望
本实验的结论
黑曲霉发酵柠檬酸实验表明，在适宜的条件下， 黑曲霉能够有效地将葡萄糖转化为柠檬酸。
通过优化培养基成分和发酵条件，可以提高柠檬 酸的产量和产率。
本实验为黑曲霉发酵生产柠檬酸提供了理论依据 和技术支持，为工业化生产提供了参考。
黑曲霉发酵柠檬酸的应用前景
01
柠檬酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工等 领域。
柠檬酸的生物合成途径主 要涉及糖酵解、三羧酸循 环和柠檬酸循环三个过程。
丙酮酸在丙酮酸羧化酶的 作用下生成草酸，草酸进 一步被还原成柠檬酸。
ABCD
在糖酵解过程中，葡萄糖 被降解为丙酮酸，产生 ATP和NADH。
柠檬酸在三羧酸循环中被 氧化成二氧化碳和水，同 时释放能量供细胞代谢使 用。
影响柠檬酸发酵的因素
溶氧量控制
通过控制发酵罐内的搅拌速度和通气 量来调节溶氧量，以确保黑曲霉的正
常生长和代谢。
pH值监测与调节
定期监测发酵液的pH值，并适时添 加酸或碱来调节pH值至适宜范围。
泡沫控制
通过添加消泡剂或调节搅拌速度来控 制发酵过程中的泡沫。
柠檬酸的提取与测定
提取
发酵结束后，将柠檬酸菌泥与发酵液 分离，然后用有机溶剂将柠檬酸提取 出来。
01
02
03
营养物质
碳源、氮源、磷源等营养 物质的种类和浓度对柠檬 酸的产量有显著影响。
温度和pH值
适宜的温度和pH值可以提 高黑曲霉的发酵活性和柠 檬酸的产量。
溶氧浓度
溶氧浓度对柠檬酸的产量 也有影响，过高或过低的 溶氧浓度都不利于柠檬酸 的积累。
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微生物上游技术综合实验报告书
（2013‐2014学年）
实验题目：柠檬酸产生菌黑曲霉的筛选
学院名称：生物与化学工程学院
柠檬酸产生菌黑曲霉的筛选
前言：柠檬酸(也称构椽酸)是重要的有机酸,是柠檬、袖子、柑橘、葡萄等水果天然酸味的主要成分。
天然柠檬酸在自然界中分布很广，天然的柠檬酸存在于植物如柠檬、柑橘、菠萝等果实和动物的骨骼、肌肉、血液中。
柠檬酸行业是我国生物农业中的一个重要行业，广泛用于食品、医药、生物工程、精细化工等行业，具有极其广阔的发展前景，而黑曲霉是生产柠檬酸最为重要的菌种，它的产酸能力将直接影响柠檬酸的产量，因此黑曲霉的选育将会产生极大的经济效益。
柠檬酸发酵生产目前所采用的菌种主要是黑曲霉菌种和酵母菌菌种，而淀粉质原料发酵主要以黑曲霉菌种为主。
对于柠檬酸发酵行业来说，菌种产酸水平的高低是决定柠檬酸发酵生产的关键因素之一，因此，柠檬酸菌种黑曲霉的选育研究一直成为科研人员关注的焦点，国内外有很多关于柠檬酸发酵菌种黑曲霉选育的研究报道。
我国柠檬酸生产菌种的发酵水平经过几十年的努力，工业产酸水平平均达到13%以上，尽管我国柠檬酸发酵技术在世界上暂时处于领先地位，但菌种选育方面的竞争依然形势严峻。
因此，应当加快产柠檬酸产生菌的研究，继续筛选高产柠檬酸的优良菌株，扩大产柠檬酸菌种的来源。
本实验主要进行了土壤中柠檬酸高产菌株黑曲霉的筛选、形态、产酶条件及酶学性质的研究。
黑曲霉（Aspergillus niger）的形态特征和生理特征。
在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。
孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐。
菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有
色，有足细胞，顶囊生成一层或两层小梗，小梗顶端生成串分生孢子。
黑曲霉生产菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麦芽糖、糊精、乳糖等培养基上生长、产酸。
黑曲霉生长最适pH 值因菌种而异，一般pH 值为3～7；产酸最适pH 值为1.8～2.5。
生长最适（optimum ）温度为33～36℃，产酸最适温度在28～36℃，温度过高易形成杂酸，斜面培养要求在35°Be 左右的麦芽汁培养基上。
黑曲霉以无性生殖的形式繁殖，具有多种活力较强的酶系，能力用淀粉类物质，并且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等具有一定的分解能力。
黑曲霉可以边长菌、边糖化、边发酵产酸的方式生产柠檬酸。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1土样
肥沃花坛土、草坪土、菜园土、果园土各一份
1.1.2培养基
1.1.3仪器 平板培养基（察式培养基） 蔗糖 30g NaNO3 2g MgSO4·7H2O 0.5g KH2PO4 1g KCl 0.5g FeSO4·7H2O 0.01g
溴甲酚绿0.4g 琼脂20g 蒸馏水1000ml PH 自然
分离培养基（PDA 培养基） 马铃薯 300g 葡萄糖 20g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 自然PH
发酵培养基（玉米粉发酵与糖蜜发酵） 玉米粉 300g ɑ－淀粉酶 10g
蒸馏水 1000ml
蔗糖 150g 甲醇 30ml
名称型号备注
生化恒温培养箱SPX－250B－Z型上海博讯实业有限公司医疗设备厂
高压灭菌锅YXQ.SG41.280 上海医用核子仪器厂
振荡摇床ZHWY －2102C 上海跃进医疗器械
台式离心机TGL －16 上海医疗器械三场
1.2 试验方法
1.2.1土样采集
选取采集地点地表植被根系周围的土壤，先除去地表浮土及植被
根系，然后挖取深约5cm 的土壤样品，装入灭菌牛皮纸袋中，4℃冰箱中保存。
将土样混合均匀，4℃冰箱保存。
1.2.3 菌株分离( 平板分离法)
土样稀释：取混合土样10g 装入90ml 无菌水的三角烧瓶中。
按常规稀释法稀释土样。
保留10 －2，10 －3，10 － 4 的土壤稀释液待用。
涂布与培养: 取10-1，10-2，10-3稀释液分别涂布于平板培养基上，每个浓度涂布3 个培养皿。
33℃恒温箱倒置培养3－4d。
观察与保存: 培养3－4d后，挑选菌落形态、颜色不一致的菌落保存待用。
1.2.4 筛选
采用平板划线法将保存的单菌落划线于分离培养基上。
33℃恒温培养箱中培养3－4d.。
通过观察变色圈的大小初步判断菌株产酶能力
的高低。
然后用直尺测出菌落与变色圈直径，根据平板上变色圈直径和菌落直径的比值( C/H) ，选出比值较大的菌株。
1.2.5复筛
将初筛得到的3 种菌株( R1，R2，R3) 分别接于发酵培养基中，30℃摇床培养4－6d。
取发酵液离心后即得粗酶液，用细针头注射器取1ml 发酵液用NaoH溶液滴定，然后测定产酸量与计算产酸率。
2、实验设计方案
以生化学院周围土壤为原材料进行柠檬酸产生菌黑曲霉的筛选与分离。
分离得到的黑曲霉作为出发菌株，并初步对其进行形态鉴定。
利用变色圈法进行初步筛选，以产酸能力的强弱作为复筛指标。
以了解和掌握柠檬酸发酵菌种黑曲霉的菌种特性和分离方法及初步掌握菌种筛选方法设计为目的筛选出一株产酸能力较强的黑曲霉菌株。
3、结果与分析
3.1黑曲霉的初步筛选与形态鉴定
在初筛培养基上用肉眼观察菌落特征：平扳培养基上初为自色、平坦，后中心微隆变黄色，再变棕黑色，菌落正反颜色一致，生长速度很快，培养4d后菌落直径达4cm以上，菌落边缘平整有同心环出现。
然后挑处50个单菌落的菌株到显徼镜上观察，有20株孢子褐色至黑色，菌丝特点为：初丝为自色，菌丝较长，呈绒毛状；基内菌丝透明，有横隔；部分菌丝特化的壁厚、膨大的足细胞，顶囊明显膨大，多成球形。
表面生辐射壮小梗，顶端分生孢子串生，如图。
根据曲霉属分群检索表或参照相关文献可初步判断所筛选到的菌为黑曲霉。
图 黑曲霉菌落形态与孢子茵丝结构特点
3.2 黑曲霉的初筛
由于初筛培养基中加有溴甲酚绿指示剂，黑曲霉产柠檬酸与之反应，在菌落周围形成一个透明的变色圈。
一般认为，变色圈与菌落直径比例越大，菌株的产酸能力越强。
这是因为透明的变色圈是柠檬酸与溴甲酚绿反应的结果，故透明变色圈与菌落直径比例大的菌株相对而言代谢旺盛、产酸能力强.
3.3黑曲霉的复筛
通过发酵培养测定所选菌株的产酸量如下表：
这次实验验证了土壤中黑曲霉菌株产柠檬酸的能力。
通过对整个实验的把握、计划以及实验步骤的实施，可以看出，在实验当中我们还是缺少对整体实验的细致计划和了解，缺少对时间的合理安排。
测量菌落序号 变色圈与菌落直径之比 耗NaOH 体积V （ml) 空白耗NaOH 体积V （ml)
产酸量（g)
1
2.1 0.5 0.7 0.037 2 2.5
0.8 1.2 0.047 3 3.0
1.2
2.0 0.065 4
2.8 1.1 1.5 0.059
对实验出现的可能结果缺少提前的预测和分析，导致当出现结果差异的时候不知道如何在进行接下来的实验，缺少对问题的深入分析和理解。
导致实验误差大，菌种培养率低，污染严重。
最终经过查询资料得知透明圈的大小不能完全代表酶活力的强弱，其原因可能是：在倒平板的过程中，平板的厚度不均一，单位面积所含的菌种也不尽相同，另外平板培养和液体发酵的条件不同，得到的菌种产酸量大小也不会完全一致。
参考文献：
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【2】减晋，刘凤霞，李永祥等．高产醋酸菌的分离选育【J】．中国酿造．1999，(5)：20-22．
【3】邓建珍．韦红群等．黑曲霉菌株产菊粉酶菌株的筛选及培养条俘的研究【J】．生物学杂志．2007．24(6)：26-28．
【9】黄秀梨．微生物学实验【M】．北京：高等教育出版社．2000．。