黑曲霉发酵生产α-淀粉酶微生物实验报告
黑曲霉耐酸性_淀粉酶的固态发酵条件研究
2． 1． 2
附加碳源的比例、 浓度对黑曲霉 PZ301 产 酸性 α 淀粉酶的影响 在上述试验的基础上， 研究了不同葡萄糖淀
粉复合物的比例及其浓度对产酸性 α 淀粉酶的 2。 影响， 试验结果见表 1 、 由表 1 可知， 随着附加碳源 （ 质量比 1 ∶ 1 ） 浓 度上升， 耐酸性 α 淀粉酶活力在上升， 当复合物 耐酸性 α 淀粉酶达到最大， 酶 浓度为 0． 28g 时， 活力为 11． 2IU / g 干曲。而后随着浓度的上升， 其 酶活力开始下降。 由表 2 可知， 当淀粉与葡萄糖 质量比即 S ∶ G 为 1 ∶ 4 时， 酸性 α 淀粉酶酶活最 高， 为 12． 6 IU / g 干曲， 这是因为淀粉作为诱导物 淀粉酶， 而葡萄糖作为碳源 可诱导菌株产酸性 α 更容易被微生物利用， 有利于菌体的生长， 因此当 有少量葡萄糖存在时， 又有淀粉作为诱导物时， 更 PZ301 。 250mL 有利于 产酸性 α 淀粉酶 故在 三
收稿日期： 2012 － 04 － 11 ； 修稿日期： 2012 － 04 － 20 基金项目： 安徽省教育厅重点项目（ KJ2012A246 ） ； 教育部第三批高等学校特色专业建设点项目 作者简介： 吴茜茜（ 1974 － ） ， 女， 硕士， 副教授， 研究方向为微生物酶学， 通信地址： 230022 安徽合肥市黄山路 373 号 合肥学院生物与环 E － mail： wqq@ hfuu． edu． cn。 境工程系，
在 1mL1． 0% 可溶性淀粉中加入 0． 1mL 酶液 （ 以灭活酶液为对照） ， 在 50℃ 水浴振荡器中反应 10min， 100℃ 加入 3mLDNS 试剂终止反应。摇匀， 水浴煮沸 10min， 在 721 型分光光度计仪器上， 波 ［16 ］ 长为 550nm 处比色， 测定还原糖量 。酶活定义 pH 4． 2 条件下， 1 分钟生成 1 （ mol 的 为： 在 50℃ 、 麦芽糖所需的酶量， 即 1 个酶活单位， 以 IU / g 干 曲表示。 1． 3． 2 菌丝体及固态发酵曲的制备 在 250mL 三角瓶中装入 100mL 液态发酵培 6 养基， 接入黑曲霉 PZ301 孢子悬浮液 3mL（ 1 × 10 孢子 / mL） ， 在 28℃ 下 120rpm 恒温培养 3d 后， 过 收集菌丝体于 60℃ 下烘干至恒 滤并充分洗涤后， 重， 粉磨备用。 在 250mL 三 角 瓶 中 装 入 8g 固 态 发 酵 培 养 ， 基 接入黑曲霉 PZ301 孢子悬浮液 2mL （ 孢子浓 度同上） ， 于 28℃ 下培养， 定时取样并烘干至恒 粉磨备用。 重， 1． 3． 3 菌丝体 DNA 的提取和测定 称取一定量的菌丝体或固体曲倒入平底烧瓶 中， 加入 25mL 5% 三氯乙酸溶液后， 置于 80℃ 水 浴中保温 25min （ 用玻璃棒不断搅拌 ） ， 立即取出 冰浴冷却， 于 10000rpm 离心 15min （ 4℃ ） 后， 留上 清液备用。 用 5% 三氯乙酸稀释 5 倍后， 以 5% 三氯乙酸 260nm 波长下测吸光度。 得到线性回归 为对照， R2 = 0． 9987 ， 方程为 y = 7． 5646x － 0． 0165 ， 其中 x ［17 － 20 ］ y 为波长 260nm 处的吸光度 。 为菌丝体（ g） ， 2 2． 1 试验结果与分析 黑曲霉 PZ301 产酸性 α 淀粉酶发酵培养基
实验二：淀粉酶活性测定实验报告
淀粉酶活性的测定一、实验目的酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。
酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到。
淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。
α-淀粉酶是一种典型的内切型淀粉酶,主要作用于淀粉水解的液化阶段,因此又叫液化酶。
作为一种最重要的工业酶制剂，α-淀粉酶广泛存在于动物,植物和微生物中。
其中，微生物α-淀粉酶以其经济易得成为工业生产主要来源。
目前,关于α-淀粉酶活性的测定方法很多种。
本实验采用杨氏改良法测定α-淀粉酶；掌握测定α-淀粉酶活性大小与温度关系的方法，通过分析得出酶的最适温度范围。
二、实验原理酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和pH值称为某种酶作用时的最适温度和pH值。
温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低，其变化趋势呈钟形曲线变化。
不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。
α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。
α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。
本实验通过淀粉遇碘显蓝色，淀粉含量越高，颜色越深。
用分管光度计检测显色效应大小，通过分管光度值计算酶活力注意：实验中为了消除非酶促反应引起的淀粉水解带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。
在实验中要严格控制温度及时间，以减小误差。
并且在酶的作用过程中，三支测定管及空白管不要混淆。
三、材料、试剂与仪器实验材料：α-淀粉酶仪器：分光光度计、电热恒温水浴锅、小台秤、研钵、玻璃仪器若干试剂：①0.4M NaOH/0.4M CH3COOH及0.1M HCl：②0.005%工作碘液：0.5克I2和5.0克KI水中研磨，定容至1000mL；③1%糊化淀粉溶液：称取1.0克淀粉，加入25mL0.4M NaOH，60℃5min，冷却后加25mL0.4M CH3COOH，定容至100mL；④稀释α-淀粉酶溶液：待测样品四、实验步骤①10mL1%淀粉溶液加入试管中，室温25/45/65℃保温10min②于每管中各加酶稀释液1mL，在室温25/45/65℃恒温水浴中（水浴温度的变化不应超过±0.5℃）准确加热10min，冷却。
黑曲霉固体发酵生产生淀粉分解酶的研究
２２ 发酵培 养基优 化 ． 根据 固体 发 酵培 养基 的组 成 ， 设计 Ｌ（４正 交 日 ３） 试 验 。试 验 因素 及 水 平见 表 ２ 试 验 处理 及 结果 见 。
表 ３ 。
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苏 建宇等 ： 曲霉 固体 发酵生 产生 淀粉分 解酶 的研究 黑 表 ２ 试 验 因素及水 平 采用优 化培 养基 ， ． ％接 种 量 ， 同温度 下 发 ０１ 不
分 解酶 ， 并对其 产酶 条件进 行 了初步 研究 。
１ 材 料 和 方法
１１ 培 养基 ．
分离培 养 基 ： 米 淀 粉 ２ ， ａ ０ ． ％ ， Ｃ 玉 ％ ＮＮ ３ ３ Ｋ Ｌ ０
００ ％ ， ＨＰ ４ ，％ ， ５ Ｋ ２０ ２ Ｍ ０ ‘Ｈ ０ ０ ５ ， ，３ ０ ４７ ２ ．ｇ ０ ０ ％链
的酶 法糖 化通 常需 首 先将 淀 粉 蒸 煮 糊 化 ， 源 消耗 能 大 。使用 生淀 粉分 解 酶能 够 直 接 水 解 生 淀 粉 ， 需 不 蒸 煮 ， 节 能 ３ ％－ ％ ， 而 降低 生 产成 本 。生 淀 可 ０ ４ ０ 从 粉分 解酶 的研究 重 点 是筛 选 高 产 菌 株 ， 寻 找其 最 并
佳产 酶条 件 。 本文 报 遭从 土壤 分离 得 到的一 株具 有较高 生淀 粉分 解酶 活力 的黑 曲霉 ， 固体 培 养 法生 产 生 淀 粉 以
１６ 酶活 力定义 和计算 ，
ｐ ３ ６ ４ ℃条 件 下 ， 小 时 水 解 底 物产 生 ｌ ｇ Ｈ ， 、０ 每 ｍ 葡萄糖 的酶 量定义 为一个酶 活力 单位 （ ） ｕ。 发 酵前 称 量 干培 养基 的重 量 ， 酵 后 称量湿 曲 发
的重量 ， 计算 湿 曲水分含 量。测 得湿 曲酶活力 后 ， 除
黑曲霉发酵产酶研究进展
黑曲霉发酵产酶研究进展张熙;韩双艳【摘要】黑曲霉(Aspergillus niger)是曲霉属真菌中的常见种,它生长旺盛、发酵周期短、不产生毒素,是美国FDA认证安全菌种(GRAS)之一,也是重要的酶制剂生产菌种.综述了黑曲霉产纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的研究进展,并展望了其广阔的应用前景.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2016(033)001【总页数】4页(P13-16)【关键词】黑曲霉;酶;发酵产酶【作者】张熙;韩双艳【作者单位】华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】Q939.97黑曲霉(Aspergillus niger)，属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科，是丝状真菌的一个常见种，广泛分布于粮食、植物产品和土壤中。
人类运用黑曲霉的历史悠久，早在中国古代，人们就利用黑曲霉制作酱料、酱油、米酒等。
由于黑曲霉生长旺盛、发酵周期短、不产生毒素，被美国FDA认证为安全菌种(GRAS)。
黑曲霉具有很强的外源基因表达能力及高效的蛋白表达、分泌和修饰能力，同时重组子具有很高的遗传稳定性。
随着越来越多的外源蛋白在黑曲霉成功表达，且被证明具有较高的产量和活性，黑曲霉成为了一个重要的酶表达体系，也逐渐成为重要的工业酶制剂生产菌种[1]。
据报道，黑曲霉可生产纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、果胶酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶等多种酶。
作者综述了黑曲霉产纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的研究进展，并展望了其广阔的应用前景。
纤维素是地球上分布最广泛的一类碳水化合物，也是最丰富的可再生资源，但因其结构复杂、降解难度大，还未实现有效的转化利用。
纤维素酶由葡聚糖内切酶(EG)、葡聚糖外切酶(CBH)、β-葡萄糖苷酶(β-BG)构成[2]，主要用于水解纤维素的β-1,4葡萄糖苷键，使纤维素分解成短链糖。
黑曲霉生产糖化酶及酶活测定
第19卷 第7期 牡丹江大学学报 Vol.19 No.7 2010年7月 Journal of Mudanjiang University Jul. 201092 文章编号：1008-8717（2010）07-0092-03黑曲霉生产糖化酶及酶活测定单 海 艳（牡丹江大学，黑龙江 牡丹江 157000）摘 要：本文对黑曲霉突变株Uv11－48生产糖化酶液体深层发酵进行了全程生产工艺的研究，证实了黑曲霉突变株是一种产孢力强、抗污染能力强、易培养的糖化酶生产菌，经液体深层通风发酵可得出：只要充分利用突变株的有利条件，掌握好菌种特性，合理配制营养，控制好发酵条件，便可获得高酶活力的高产糖化酶。
本实验还运用了几种酶活力测定方法，以资进行优劣探讨。
关键词：黑曲霉；液体通风发酵；糖化酶；酶活力 中图分类号：Q-331 文献标识码：B 一、前言（一）黑曲霉菌种特性 1．黑曲霉的分类地位黑曲霉在分类学上处于：真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、曲霉属、黑曲霉群，拉丁学名：Aspergillus niger 。
2．黑曲霉形态、生理、生态特性孢子头呈暗黑色，菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成，菌丝黑褐色，顶囊球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。
一般进行无性生殖，其可育细胞称足细胞。
3．黑曲霉突变株的形态、生理、生态、特征 在查氏培养基上菌落曲型为炭黑色，有辐射沟纹，从菌落边缘向中心，分化为伸长部位，活性部位，成熟部位，老化部位几个区域即孢子萌发最早出现于中心部位是伸展部位，并逐渐形成密生部位，分生孢子部位，最后在中心出现的是成熟部位，菌落背面无色或稍黄。
（二）糖化酶的分类、地位、性质及用途 1．糖化酶在国际酶学委员会，在系统命名法中的地位糖化酶是淀粉酶，在系统命名法中属水解酶类。
2．糖化酶的性质糖化酶（glucamylase ）又名糖化型淀粉酶（glueoamylase ）或淀粉葡萄糖苷酶。
其系统名称为淀粉α1.4-葡萄聚糖水解酶。
黑曲霉固态发酵酸性α-淀粉酶的培养基优化研究
（） ４ 发酵 培养基 的优 化［ ： 单 因素实验 的基 础上 进 一步 考察 各 因素对 黑 曲霉 产 ａ 淀粉 酶 的影 响 ， ５在 ］ 一 采 用 Ｂ ｘ Ｂ ｈ ｋ ｎ实验 设计 （ Ｂ ） 对 黑 曲霉 产淀粉 酶培养 基进 行优化 ， ｏ － ｅｎ ｅ ＢＤ， 实验 因素 水平见 表 １ ．
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第２ ２卷 第 ３ 期
２０ ０ ７年 ９月
安
徽
工
程
科
技
学
院
学
报
Ｖｏ ． ２ Ｎｏ ３ １２ ． ．
Ｓｅ ｐ．， ０ ２ ０７
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｈ ｉ ｉｅｓｔ ｆＴｅ ｈ ｏｏ ｙａ ｄＳ ｉｎ ｅ ｏ ｒ ａ ｆＡｎ ｕ ｖ ｒｉ ｏ ｃ ｎ ｌｇ ｎ ｃｅ ｃ Ｕｎ ｙ
１ 材 料 与 方 法
（） １ 菌种 ： 曲霉 由安徽工 程科技 学 院生 物化 学工程 系微生 物实验 室保 藏． 黑
（） ２ 固态 发酵基 础培 养基 ：５ 麸 皮 ，０ 玉米 淀粉 ， 豆饼 粉 ， 水 比 １： ． ８ １ ５ 料 １
（） ３ 发酵 培养 条件 ：５ ２ ０ｍＬ三 角瓶装 ２ ０ｇ培养基 （ 料计 ） 接种量 为每瓶 一环 ， 酵温度 ３ 干 ， 发 ０℃ ， 培养
表 １ 实 验 因 素 水 平
因 水 平 — — Ｘ 玉 米 淀 粉 ） ％ （ ／
５ １ Ｏ １ ５
素 Ｘ ＮＨ Ｃ ） ％ （ １／
２ ４
Ｘ 豆饼 ） ％ （ ／ 法 ： 据 中国食 品工业 标准 ＱＢ Ｔ１ ０ － ９ 根 Ｐ ８ ３ ３的测定 方 法 ， ６ 在 ０℃ ， Ｈ ６ ０条 件下 ， ｐ ．
目前酸 性淀粉 酶 主要采 用液态 深层发 酵生 产 ， ］ 在液 态发 酵生产 中 ， 培养 基 中高浓度 葡 萄糖会 对产 酶
α-淀粉酶研究
• 淀粉的液化和糖化作用 工业生产中往往与β-淀粉酶和普鲁兰酶
等脱枝酶配合使用，用以生产超高麦芽糖浆，其麦芽糖含量超过70利用α－淀粉酶，它能有选择性的去除淀粉浆而不伤害 纱线纤维，还能随机的使淀粉降解为易溶于水的糊精，因而容易被洗 掉。
• 造纸中改变粘度 淀粉酶在造纸工业中的用途主要是改良纸张涂层
国内α-淀粉酶应用价值
• 1965年,我国开始应用淀粉芽孢杆菌BF-7658生产α-淀粉 酶,当时只有无锡酶制剂厂独家生产。1967年杭州怡糖厂 实现了应用α-淀粉酶生产饴糖的新工艺,可以节约麦芽 7%～10%,提高出糖率10%左右。1964年我国开始了酶法 水解淀粉生产葡萄糖工艺的研究。l979年9月通过了酶法 注射葡萄糖新工艺的鉴定,并先后在华北制药厂、河北东 风制药厂、郑州嵩山制药厂等单位得到应用,取得了良好 的经济效益。与传统的酸法相比,可以提高收率10%,降低 成本15%以上。另外,我国以酶法进行柠檬酸生产、谷氨 酸发酵、糖化制啤酒、酒精发酵、黄酒酿造、酱油制造、 醋生产等方面也已经研究成功并投入生产。 • 由于我国淀粉资源丰富，淀粉酶应用范围广泛，淀粉酶工 业发展也必将促进我国其他工业的迅速发展。
α -淀粉酶及其应用探讨
学生姓名：高 裕 指导老师：张道雷
论文背景及意义
• α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶,国内外很多研究机 构对它进行了研究。 • α-淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、 食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等，它占 了整个酶制剂市场份额的25％左右。 • α-淀粉酶在各行业中的广泛应用（面包焙烤工业，作为保 鲜剂、 用于淀粉的液化和糖化作用、淀粉脱浆、造纸中 改变粘度、除垢剂中的使用、医药行业中用于制备消化助 剂，将会使医疗效果更为有效）。
淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌实验实验报告
(此文档为word格式，下载后您可任意编辑修改！) 实验报告：淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌（amp+）中的表达目录相关背景目前研究情况简略研究步骤相关实验详细介绍实验结果与讨论参考文献1、相关背景1、1淀粉酶1、1、1 淀粉酶的发现和分类淀粉酶是较早发现的酶类之一，早在1833年Payen和Persoz已首次从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀分离到淀粉酶。
1894年高峰让吉从米曲霉(Aspergillus oryzae)中提取出作为消化剂的酶，即高峰淀粉酶。
1919年法国Boidin和Effront首次用枯草杆菌生产淀粉酶。
淀粉酶(amylase，AMY,AMS)是作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶类的总称。
现在淀粉酶大致可分为四大类。
第一类α-淀粉酶，广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。
微生物的酶几乎都是分泌性的。
此酶以钙离子为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α－1，4-链。
因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。
另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精。
一般分解限度以葡萄糖为准是35-50％，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70％分解限度的（最终游离出葡萄糖）。
按照使用条件α-淀粉酶可以分为中温型，高温型，耐酸耐碱型。
按产生菌不同又可分为细菌、真菌、植物和动物淀粉酶。
第二类β-淀粉酶(EC3.2.1.2)从底物非还原性末端顺次水解每隔一个α-1,4糖苷键，切下的是麦芽糖单位。
β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α－1，4-葡聚糖链。
主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。
对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。
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黑曲霉发酵生产α-淀粉酶前言：α-淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为α构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶。
耐酸性α-淀粉酶是在酸性条件下水解淀粉的酶类，其最适pH在4.0左右。
自从日本研究者YasujiMinoda等人用黑曲霉生产耐酸性α-淀粉酶以来，各国都对耐酸性α-淀粉酶进行了研究。
通过黑曲霉发酵生产α-淀粉酶的实验过程，熟悉发酵罐的构造和使用方法。
初步了解发酵生产的原理和常规发酵参数的检测方法。
整个实验按照“菌种的培养空消实消接种发酵放罐”的发酵过程进行。
在整个发酵的过程中，每隔6h取一次发酵液样品检测其pH值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。
最后将所测数据进行整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。
正文：一、实验目的1．了解发酵罐的几大系统组成，即空气系统、蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。
2．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤3．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤4．掌握发酵罐各系统的控制操作方法二、实验原理1.蒸汽系统：蒸汽发生器：主要用于灭菌，分为自动加水和手动加水两种方式。
2.温度系统：(1) 夹套升温：蒸汽通入夹套。
(2) 夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。
(3) 发酵过程自动控温系统3.空气系统：空气除菌设备：空压机贮气罐油水分离器空气流量计空气过滤器发酵罐4.补料系统：补加培养基、消泡剂、酸碱等。
5.在线控制系统6.进出料系统：进料口（接种口）、出料口（取样口）7.管道：包括水流通管道和气流通管道水流通：冷却用水：水经过进水管道发酵罐夹套出水口保温用水：关闭进出水管道阀门（水注满后）进入夹套气流通：蒸汽发生器蒸汽管道空气过滤器/发酵罐进入罐内空气：空压机贮气罐油水分离器空气流量计空气过滤器发酵罐三、方法与注意事项㈠原则1.通蒸汽前先关闭所有阀门2．粗过滤器不空消也不实消，要定期处理，所以必须关闭通向粗过滤器的阀门。
3．活蒸汽，灭过头，即尾汽不能关死，要保证有活蒸汽放出，但不能太大，以免分压。
4．罐体排汽口排汽，并保持罐内正压。
5．空气过滤系统只空消，不实消，以免罐中物料冲入过滤器内。
但空消一结束，即要通入无菌空气吹干管路并保压，避免染菌。
6．进蒸汽时顺着蒸汽管路开阀门，结束时逆着进路关阀门，先开尾阀后开主阀，结束时先关主阀后关尾阀。
8．蒸汽一停，即由无菌空气充入保持罐内正压。
㈡空消先开启蒸汽发生器，自有蒸汽产生并排掉管路中冷凝水后，按以下步骤进行：1．先关闭所有阀门，检查处是否关紧密封，打开罐上方排气口。
2．蒸汽先进空气系统，蒸汽→蒸汽过滤器→分过滤器，无论蒸汽走到哪一路得先放尾阀，放出冷凝水，排掉冷空气，待有蒸汽冲出后调小，打开主阀。
3．再进罐体：由主路进罐，然后通入取料管路，再入补料系统（两边）。
4．罐压升至所需温度（121℃）时开始计时，保温保压30min。
保压方式：（1）调节主汽路进汽阀门控制进汽量；（2）调节排气口排气量大小或尾阀放汽量。
5．结束空消：（1）逆着蒸汽进路关，先关近罐阀。
（2）同时准备好压缩空气确保蒸汽一停即充入无菌压缩空气以维持空气系统及罐内的正压。
近罐空气阀的尾阀要一直微开启。
注意：空消前应检查夹套中是否残留了冷水，若有，影响罐体升温，须自夹套出水口将水放出。
㈢种子制备：接种黑曲霉于PDA液体培养基中，液体摇瓶培养。
㈣培养基配制、实消发酵培养基配方：可溶性淀粉200 g，柠檬酸氢二铵100 g，KH2PO4 15 g，CaCl2 0.5 g，FeSO4.7H2O 0.05 g，MgSO4.7H2O 0.5 g，加水定容至5 L，pH5.0，消泡剂（植物油）5 mL。
关闭气路入罐阀，主汽路进汽→补料口进汽（方法同空消）→罐压升至0.12Mpa（121℃），保压、保温30分钟→实消结束。
㈤冷却接种与发酵待培养基冷却至28℃左右时，在加料口周围放一圈酒精棉球，点燃，在无菌条件下打开进料口，迅速接种。
将温度、搅拌转速、通气量等参数设定好后，进行发酵。
㈥参数监测每隔6 h取一次样，检测其pH、生物量、酶活及残糖含量等指标。
Ⅰ. pH的测定：标准液校准pH计后，测定样品pH值。
Ⅱ. 生物量的测定：每次取20-30mL的发酵液，先用大离心机(5000 rpm, 3-5 min)离心，收集上清液，用小离心机（10000rpm，1min）用来测酶活，沉淀用水清洗几次后再离心，然后将所得沉淀放入100℃烘箱中，烘干（2 h左右），然后测其干重，取平均值。
Ⅲ. 酶活：试剂：（1）碘液：称取0.5g I2 和5.0gKI 研磨溶解于少量蒸馏水，定容至100ml，于褐色试剂瓶内保存，避免阳光直射。
（2）稀碘液：取原碘液1ml稀释100倍。
此溶液现配现用（3）0.5%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉0.5克，加5ml缓冲液，搅拌混和，再徐徐倾入70毫升煮沸的缓冲液中。
继续煮沸2分钟，冷却至室温，定容至100mL。
此溶液需要当天配制(4) 磷酸缓冲液（pH 6.0）：0.2 mol/L K2HPO4 (12.3mL)+0.2 mol/L KH2PO4(87.7mL)方法：取5ml 0.5% 的可溶性淀粉溶液，在40℃水浴中预热10 min，然后加入适当稀释(6.0的磷酸盐稀释缓冲液)的酶液0.5ml，反应5min后，用5ml 0.1mol/L H2SO4终止反应。
取0.5 ml 反应液与5 ml 碘液显色，在620 nm处测光密度。
以0.5 ml水代替0.5 ml反应液为空白，以不加酶液（加同样体积的缓冲液）的管为对照（即取5ml 0.5% 的可溶性淀粉溶液，在40℃水浴中预热10 min，然后加入6.0的磷酸盐稀释缓冲液0.5ml，反应5min后，用5ml 0.1mol/L H2SO4终止反应。
取0.5 ml 反应液与5 ml 碘液显色）。
酶活力根据下式计算：酶活力（u/ml）＝(R0-R)/R0×50×D，式中R0，R分别表示对照和反应液的光密度，D为酶的稀释倍数。
调整D使(R0-R)/R0在0.2-0.7之间。
确定在40℃、5 min 内水解1 mg淀粉的酶量为一个活力单位。
Ⅳ. 残糖量的测定：硫酸-蒽酮法测残糖含量（1）原理糖类与浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于620 nm处有最大吸收，显色与多糖含量有线性关系。
（2）试剂①蒽酮试剂。
溶解0.2 g蒽酮于浓硫酸（A. R. 95.5 %）100 ml中，当日配制试用。
具体实验过程中，应视样品分数多少来准备蒽酮试剂的配置量。
比如实测样品有50份，为了保证结果的可靠性，安排个份样品试验重复数为3。
因为每个试验点实测需要4 ml蒽酮试剂，所以至少应配置的体积为4×3×50＝600 ml。
此时还应考虑预实验和实验差错所消耗蒽酮试剂量。
②标准糖试剂。
葡萄糖溶液（可加数滴甲苯防腐）（3）操作及其注意事项分别取0.1 g/l的葡萄糖溶液0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.60，0.80 ml，用蒸馏水补到1.00 ml，分别加入4.00 ml蒽酮试剂，迅速进入冰水浴中冷却，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。
自水浴重新煮沸开始计时，准确煮沸10 min，冷却后进行比色。
以光密度为纵坐标，糖的含量微克数为横坐标，制作标准曲线。
或使用计算器进行一元回归得出计算式，以便于计算使用。
（4）样品含量测定取糖浓度为50μg/ml左右的样品溶液1.00ml，一式3份分别置于不同试管中，对照加入1.0ml蒸馏水，然后给各管加入蒽酮试剂，以标准曲线方法进行比色测定。
根据标准曲线和样品浓度计算含量。
色氨酸含量较高的蛋白质对显色反应有一定的干扰。
此外，试管在加入蒽酮试剂过程中，移液管尖端在试管中所停留的高度对于加入蒽酮试剂的速度影响较大，而且对反应产生颜色的深浅都会产生一定的影响。
因此，实验操作应该注意。
㈦后续工作：罐体清洗，药品整理归类，物品放好㈧数据处理(1)葡萄糖标准曲线0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.80.001 0.052 0.159 0.274 0.435 0.671 0.882 （2）发酵液pH值的变化发酵液ph随时间变化曲线图生物量(g)的变化00.050.10.150.2010203040506070时间（h）生物量（g ）生物量(g)残糖含量变化00.511.522.5010203040506070时间（h）残糖含量（g /L )残糖含量（3）生物量的变化生物量随时间变化曲线图（4）残糖量变化残糖含量随时间变化曲线图酶活变化02000400060008000100001200014000010203040506070时间（h）酶活酶活 （5）酶活变化酶活随时间变化趋势四、实验结果分析1、pH 值得变化：0-6h 变化幅度不大，此时菌处于潜伏期内种代谢不旺盛，故pH 的变化不大。
12-18小时有所波动，可能是取样时出现误差，理论上应该是在0=18小时变化不大。
18小时过后，随后随着菌种的活化，菌种新陈代谢的旺盛CO2的释放增加，pH 值逐渐下降，且下降速度逐渐加快。
2、生物量变化：理论上生物量整体上是呈上升趋势。
但是在18小时时，出现生物量很明显的增大，显然数据出现误差。
可能是烘干时没有干的彻底，杂质掺入，或是统计数据时出现错误。
在这之后，生物量出现缓慢上升趋势，这是因为在发酵期间培养基的营养成分是够黑曲霉生长所需的,它的增殖受到环境的影响不是很大,故其一直在增殖.第60小时数据偏低，可能是离心不彻底使部分产物损失。
此外生物量曲线出现较大的波动可能是操作的人员不同，实验手法也不一样，导致最终结果有所偏差。
3、残糖的变化：理论上应该是越来越小，但是实验中残糖的波动比较大，归结原因可能如下： 1、试验中所使用的蒽酮和淀粉溶液不是现配现用，尤其是淀粉溶液时间稍长就会出现沉淀，这是结果波动性变化大的最主要的原因；2、操作不规范，稀释倍数不合理，也可能导致数据波动性较大3、发酵罐中的温度没有控制好，对此也有较大影响。
4、由于本实验是分批次进行的，因此实验操作者也不是唯一一个人，不同的操作者都有不同的操作习惯，步骤也不一定相同，可能也会导致数据波动4、a-淀粉酶的活力：总体上是呈上升趋势，0-36h内酶活测定数值比较小，因为在发酵初期，有一段时间的延滞期，由于菌种的代谢慢，总量少。
36小时候，由于菌种达到对数期和稳定期黑曲霉的产酶能力加强，酶活不断升高，且上升幅度也大大提高，数量增加以后产生的酶量便不断增加。