药物分析化学

白番红花球茎中总黄酮的提取工艺

高红艳，彭琰

（伊犁师范学院化学与生物科学学院，伊宁835000）

摘要：研究白番红花球茎中总黄酮的提取工艺，采用超声波辅助法，考察乙醇体积浓度、料液比、超声时间、温度对提取率的影响，在单因素实验基础上，采用响应面法优化白番红花球茎中总黄酮的提取工艺条件，得最佳提取工艺，即：乙醇体积浓度为66%、料液比为1:41、提取温度为61℃，在

此工艺条件下总黄酮的提取率为4.37mg/g。

关键字：白番红花；总黄酮；超声波；响应面法

Extraction technology of total flavonoids in

the corm of Crocus alatavicus (Yili normal university, chemistry and biology science department ,

Yining 835000)

Abstract: Ultrasonic assisted method was used to extract the total flavonoids from corm of Crocus alatavicus. and the effects of ethonal concentration, solid-liquid ratio, extraction time, extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids were investigated. On the basis of single factor tests, the extraction technology of total flavonoids from corm of Crocus alatavicus was optimized by response surface methodology .The optimum conditions obtained were as follows: ethonal concentration was 66%, solid-liquid ratio was 1:41, extraction temperature was 61℃ .Under this conditions, the extraction yield of total flavonoids was 4.37 mg/g.

白番红花（Crocus alatavicus）与中药番红花[1]（又名西红花[2]或藏红花[3]）属于同纲不同目，同科同属不同种植物。两者同属单子叶植物纲，鸢尾科，番红花属，但白番红花属百合目，番红花属天门冬目。白番红花主要分布在新疆伊犁

地区各县的山坡上（海拔1200米-3000米），资源丰富。白番红花球茎是白番红花的地下球茎，是哈萨克族民间常用药物，在哈萨克族民间主要是捣碎放入马奶子中服用，用于治疗风寒湿痹，跌打肿痛，腰脚无力等疾病[4-6]。从白番红花球茎中提取黄酮类化合物的研究未见报道，天然产物的研究具有众多潜在价值，值得深入研究。

黄酮类化合物的提取方法有：溶剂法[7]，微波法[8]，酶解法[9]，超临界流体萃取法[10]，双水相萃取分离法[11]，超声波提取法[12-13]等。本实验选用超声波提取法，其设备简单，操作简便，环保无污染，利于实验室操作。

响应面分析法[14]不仅能得出最佳实验条件并预测实验结果，还能模拟出实验因素水平对反应结构影响的函数，试验条件优化过程中可以连续地对试验因素的各个水平进行分析,本实验选用响应面分析法优化白番红花球茎中总黄酮的提取工艺条件。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

白番红花球茎（采于新疆伊犁察布查尔锡伯自治县海拔1500米的山坡上，经新疆维吾尔自治区药品检验所主任药师刘勇民鉴定为鸢尾科番红花属多年生植物白番红花的球茎）；芦丁标准品（国药集团化学试剂有限公司）；氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、乙醇（均为国产分析纯）。

KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XH-2008D 型电脑智能温控低温超声波合成萃取仪（北京祥鹄科技发展有限公司）；FA2104N 型分析天平、723PC 型可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；SHZ-111型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准溶液的配置

准确称取充分干燥的芦丁标准试剂0.0103g，置于50mL烧杯中，加入30％乙醇溶解，并完全转入50mL容量瓶中，用30％乙醇定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.206mg/mL的芦丁标准液。

1.2.2 最大吸收波长的选择

准确移取芦丁标准液和样品溶液各3mL于10mL比色管中，用30％的乙醇依次定容至5mL，加入5％的亚硝酸钠0.3mL，摇匀，静置6min；加入10％的硝酸铝0.3mL，摇匀，静置6min；再加入1mol/L的氢氧化钠4mL，用30％乙醇定容至刻度，摇匀，静置15min后，以空白试剂（30%乙醇）做参比，在400~600nm 的波长范围内扫描谱图，如下图所示：

图1 芦丁标准液波长与吸光度的关系图

图2 样品波长与吸光度的关系图

由图1和图2可知，芦丁标准液波长在508nm处有最大吸收峰，而样品溶液在480nm处有最大吸收峰，原因可能是样品中含有杂质干扰黄酮类化合物出峰位置，因此本实验依据芦丁标准液最大波长进行测定。故选择508nm作为检测波长。

1.2.3 芦丁标准曲线的绘制

精密移取0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL芦丁标准液置于10mL比色管中，用30％的乙醇依次定容至5mL，加入5％的亚硝酸钠0.3mL，摇匀，静置6min；加入10％的硝酸铝0.3mL，摇匀，静置6min；再加入1mol/L 的氢氧化钠4mL，用30％乙醇定容至刻度，摇匀，静置15min后，以不加芦丁为空白，在波长508nm下依次测定吸光度，以浓度C为纵坐标，芦丁标准液浓度为横坐标，绘制标准曲线，见图3。实验数据拟合线性方程分别为：

y=11.350x+0.0122,R2 =0.9996。

0.00

0.020.040.060.080.10

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

吸光度

浓度/(mg/mL)

图3 芦丁标准曲线

1.2.4 白番红花球茎中总黄酮含量的测定

采用NaNO 2-Al(NO 3)3比色法 ,精确吸取3mL 样品溶液于10mL 比色管中，用30％的乙醇定容至5mL ，加入5％的亚硝酸钠0.3mL ，摇匀，静置6min ，再加入10％的硝酸铝0.3mL ，摇匀，静置6min 后，再加入1mol/L 的氢氧化钠溶液4mL ，用30％的乙醇定容至10mL ，摇匀，静置15min 后，以空白试剂做参比，在508nm 的波长处测定其吸光度值。 根据芦丁标准曲线，按下式算样品中总黄酮的提取率：

m

ncv

)mg/g 总黄酮提取率( 式中，n 为提取液稀释的倍数；c 为从回归方程得芦丁的浓度（mg/mL ）；m 为白番红花球茎粉末的质量（g ）；v 为原提取液体积（mL ）。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇体积浓度对提取率的影响

准确称取0.5000g 经处理的白番红花球茎粉末5份置于锥形瓶中，依次加入30%、45%、60%、75%、90%体积浓度的乙醇溶液20mL 作为提取剂，放入超声清洗器中，在温度为60℃的条件下超声60min ，反应结束后抽滤，将滤液加乙醇溶液定容至25mL ，摇匀，待用。按1.2.4方法测定其总黄酮提取率，每组实验重复三次，检测提取率。即得不同乙醇体积浓度对总黄酮提取率的影响。

图4 乙醇体积浓度对总黄酮提取率的影响

图4表明，乙醇体积浓度在30%-75%之间时，随着乙醇体积浓度的增加，白番红花球茎中总黄酮的提取率呈上升趋势，最高达到3.98mg/g 。但当乙醇体积浓度达到90%时，总黄酮提取率有所降低，原因可能是乙醇体积浓度过高，使得白番红花球茎中脂溶性物质、糖类等物质逐渐渗出，进而影响了总黄酮的提取率。所以可以认定乙醇体积浓度为75%时，是白番红花球茎中总黄酮提取的最佳体积浓度，可将其选作为响应面实验的中心点 2.1.2 料液比对提取率的影响

准确称取0.5000g 经处理的白番红花球茎粉末5份置于锥形瓶中，依次加入体积浓度为75%的乙醇溶液5mL 、10mL 、15mL 、20mL 、25mL 作为提取剂，放入超声清洗器中，在温度为60℃的条件下超声60min ，反应结束后抽滤，将滤液加乙醇溶液定容至25mL ，摇匀，待用。按1.2.4方法测定其总黄酮提取率，每组实验重复三次，检测提取率。即得不同料液比对总黄酮提取率的影响。

图5 料液比对总黄酮提取率的影响

30405060708090

3.2

3.4

3.6

3.8

4.0

4.2

提取率/(m g /g )

乙醇浓度/%

1:10

1:20

1:30

1:40

1:50

3.2

3.4

3.6

3.8

4.0

4.2

提

取率/(m g /g )料液比

图5表明，料液比在1:10-1:40时，白番红花球茎中总黄酮的提取率呈上升趋势，当料液比为1:40时，提取率达到最大，为4.00mg/g 。但当料液比达到1:50时，总黄酮提取率明显降低，原因可能是随着料液比的增加，白番红花球茎中黄酮类化合物已经全部溶出，再增大料液比，由于溶剂使用量过多，溶剂本身对超声波会有一定的吸收损耗。并且可能使其他物质渗出，使溶液黏度增加，进而影响了白番红花球茎中总黄酮的提取。所以可以认定料液比为1:40时，是白番红花球茎中总黄酮提取的最佳料液比，可选作为响应面实验的中心点。 2.1.3 超声时间对提取率的影响

准确称取0.5000g 经处理的白番红花粉末5份置于锥形瓶中，分别加入体积浓度为75%的乙醇溶液20mL 作为提取剂，放入超声清洗器中，在温度为60℃的条件下依次超声10min 、20min 、30min 、40min 、50min 、60min ，反应结束后抽滤，将滤液加乙醇溶液定容至25mL ，摇匀，待用。按1.2.4方法测定其总黄酮提取率，每组实验重复三次，检测提取率。即得不同超声时间对总黄酮提取率的影响。

10

20

30

40

50

3.2

3.4

3.6

3.8

4.0

4.2

提取率/(m g /g )

超声时间/min

图6 超声时间对总黄酮提取率的影响

图6表明，超声时间在10min-40min 之间，随着超声时间的增加，白番红花球茎中总黄酮提取率逐渐增加，当超声时间为40min 时，提取率达到最大值，为4.05mg/g 。但当超声时间超过40min 后，总黄酮提取率有所降低，原因可能是超声时间过长，使得白番红花球茎中黄酮类化合物被破坏，使总黄酮稳定性降低，可能一部分被超声波分解。所以，可以认定超声时间为40min 时，是白番红花球茎中总黄酮提取的最佳时间。 2.1.4 温度对提取率的影响

准确称取0.5000g 经处理的白番红花粉末5份置于锥形瓶中，分别加入体积浓度为75%的乙醇溶液20mL 作为提取剂，放入超声清洗器中，分别在温度为

30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的条件下超声40min ，反应结束后抽滤，将滤液加乙醇溶液定容至25mL ，摇匀，待用。按1.2.4方法测定其总黄酮提取率，每组实验重复三次，检测提取率。即得不同温度对总黄酮提取率的影响。

30

40

50

60

70

3.2

3.4

3.6

3.8

4.0

4.2

提取率/(m g /g )

温度/℃

图7 温度对总黄酮提取率的影响

图7表明，温度在30℃-60℃之间，随着温度的增加，加速了黄酮类化合物的溶解，白番红花球茎中总黄酮的提取率逐渐增加，当温度为60℃时，提取率达到最大值，为4.08mg/g 。但当温度超过60℃后，总黄酮提取率有所降低，原因可能是温度过高，使得黄酮类化合物的稳定性降低，并且加速了溶剂的挥发，进而影响了白番红花球茎中总黄酮的提取效果。所以，可以认定温度为60℃时，是白番红花球茎中总黄酮提取的最佳温度，可选作为响应面实验的中心点。 2.2 响应面实验结果

在单因素实验的基础上，选取3个对提取效果影响较显著的因素：乙醇体积浓度（A ）、料液比（B ）和温度（C ）为考察对象，以白番红花球茎中总黄酮的提取率为响应值，根据Box-Beknhen 中心组合实验设计原理，设计三因素三水平的响应面实验。

表1 响应面分析法实验因素水平及编码

编码

A ：乙醇体积浓度/%

B ：温度/℃

C ：料液比

-1 0 1

60 75 90

50 60 70 1:30 1:40 1:50

表2 响应面实验设计及结果

利用Design Expert 8.0软件对表2中的实验数据进行多元回归拟合，得到白番红花球茎中总黄酮提取的回归方程为

Y=4.03-0.54A+7.500E-003B+0.017C-0.020AB-0.020AC+0.095BC-0.47A 2-0.23B 2-0.16C 2

对响应面多元二次模型进行方差分析，分析结果见表3：

实验序号

A 乙醇体积浓度

B 温度

C 料液比

提取率（mg/g ）

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

-1 -1 -1 -1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 1 -1 -1 0 0 1 1 1 -1 -1 0 0 0 0 0

1 -1 0 0 0 -1 1 0 -1 1 1 -1 0 0 0 0 0

3.90 3.93 3.96 3.86 2.75 2.95 2.84 2.77 3.47 3.80 3.64 3.69 3.94 3.98

4.11 4.05 4.08

表3 回归方程方差分析

变异来源平方和自由度均方F值P值显著性

模型

A乙醇体积浓度B温度

C料液比

AB

AC

BC

A2

B2

C2

残差

失拟性

纯误差

总变异

3.76

2.35

4.500E-004

2.450E-003

1.600E-003

1.600E-003

0.036

0.93

0.22

0.10

0.054

0.035

0.020

3.81

9

1

1

1

1

1

1

1

1

1

7

3

4

16

0.42

2.35

4.500E-004

2.450E-003

1.600E-003

1.600E-003

0.036

0.93

0.22

0.10

7.776E-003

0.012

4.970E-003

53.68

302.8

0.058

0.32

0.21

0.21

4.64

120.13

27.66

13.18

2.32

＜0.0001

＜0.0001

0.8168

0.5921

0.6638

0.6638

0.0681

＜0.0001

0.0012

0.0084

0.2172

显著

不显著

从表3数据可知，本实验所选用的二次多项模型P=0.0001＜0.01，说明该模型二次方程极显著，表明本实验方法是可靠的，该方程对模拟真实的三因素三水平的分析是可行的。且A乙醇体积浓度影响显著，B温度、C料液比影响小。交互项AB、AC、BC的P值都大于0.05，在水平内不显著，说明他们的交互作用不是单纯的线性关系。模型失拟项F=2.32、P=0.2172＞0.05，模型失拟项不显著，说明该模型的拟合度好，模型的选择合适，用此模型可以对白番红花总黄酮提取工艺进行优化[15]。

图8 乙醇体积浓度与温度的交互作用对总黄酮提取率的响应面分析

图9 乙醇体积浓度与料液比的交互作用对总黄酮提取率的响应面分析

图10 温度与料液比的交互作用对总黄酮提取率的响应面分析

由Design-Expert.8.05软件分析计算，得到白番红花球茎中总黄酮含量预测值最大时的条件为：乙醇体积浓度66.30%≈66%、温度60.67℃≈61℃、料液比1:41.13≈1:41，预测提取率为4.19mg/g 。对此优化提取条件进行验证实验，按

1.4.6方法重复进行三次。结果表明：白番红花总黄酮提取率达到4.37mg/g。

3 结论

以乙醇为溶剂，采用超声波提取法，通过单因素实验考察了乙醇体积浓度、料液比、提取时间、温度4个因素对黄酮类化合物提取率的影响，其中75%为最佳乙醇体积浓度，1:40为最佳料液比，40min为最佳提取时间，60℃为最佳提取温度。

在单因素实验基础上，选取3个因素进行响应面实验优化，得到最佳提取工艺条件为：乙醇体积浓度为66%、料液比为1:41、提取温度为61℃，在此工艺下进行模拟验证实验，总黄酮的提取率平均值为4.37mg/g。

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