PMA对4-HPR抑制HepG2细胞体外迁移的影响

网络出版时间:2019－1－1114:05网络出版地址:http://kns．cnki．net/kcms/detail/34．1065．r．20190109．1117．001．html◇基础医学研究◇

PMA对4-HPＲ抑制HepG2细胞体外迁移的影响

张玲1，2，魏翔2，张素梅2，周青2，汪渊2

2018－08－10接收

基金项目：国家自然科学基金项目（编号：81272399）；安徽省自然科

学基金青年项目（编号：1508085QH185）；皖南医学院中青

年科研基金自然科学类项目（编号：WK201403）作者单位：1皖南医学院生物化学教研室，芜湖2410022安徽医科大学分子生物学实验室、生物化学教研室，合肥

230032作者简介：张玲，女，讲师；汪渊，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：wan-gyuan@ahmu．edu．cn

摘要目的观察乙酸肉豆蔻佛波醇（PMA）对N-（4-羟基苯基）维生素甲酰胺（4-HPＲ）抑制肝癌细胞HepG2体外迁

移的影响，并探讨相关机制。方法PMA单独或联合4-HPＲ处理HepG2细胞，倒置显微镜下观察HepG2细胞形态

学变化和药物对生长的影响；细胞划痕实验检测HepG2细

胞体外迁移能力的变化；Westernblot法检测迁移相关蛋白

神经钙黏蛋白（N-cadherin）、肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的

表达和肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化程度。结果PMA联合

4-HPＲ处理组细胞密度小，形态更为细长；二者联合处理细

胞迁移距离明显减少，而PMA单独处理细胞迁移距离增加

（P＜0.05）；抑制细胞迁移过程中，N-cadherin、MLCK表达减

少，MLC磷酸化亦降低（P＜0.05）。结论PMA联合4-HPＲ可抑制HepG2细胞的迁移，相比4-HPＲ组能更显著减少MLCK的表达和MLC的磷酸化，为进一步探讨4-HPＲ联合

PMA治疗肝癌提供实验基础。关键词乙酸肉豆蔻佛波醇；N-（4-羟基苯基）维生素甲酰胺；肌球蛋白轻链激酶；神经钙黏蛋白；肌球蛋白轻链磷酸

化；肝癌HepG2；迁移

中图分类号Ｒ735．7；Ｒ329．24；Ｒ73-37；Ｒ979．1文献标志码A文章编号1000－1492（2019）02－0169－05doi：10．19405/j．cnki．issn1000－1492．2019．02．001

肝癌是常见肿瘤，在我国发病率较高，早期难发现，诊断时多已中晚期。侵袭转移往往是导致治疗欠

佳的主因。乙酸肉豆蔻佛波醇（phorbol12-myristate13-acetate，PMA）是一种从巴豆油中提取的化合物，初期研究具有较高的促癌活性［1］。研究［2］显示PMA可诱导白血病细胞分化。N-（4-羟基苯基）维生素甲酰胺［N-（4-hydroxyphenyl）retinoide，4-HPＲ］是全反

式维甲酸（all-trans-retinoicacid，ATＲA）的一种人工

合成衍生物，前期研究［3－4］显示可显著抑制肝癌细胞

HepG2、肺癌细胞A549的迁移。该研究观察PMA对

4-HPＲ抑制人肝癌细胞株HepG2体外迁移的影响，并对其作用机制进行初步探讨。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1药物和试剂PMA购自美国cayman公司；4-HPＲ购自美国MCE公司；ATＲA购自上海东苍生

物科技公司。均用二甲基亚砜（DMSO）配制成10mmol/L母液，－20℃避光保存。DMEM培养基购

自美国Hyclone公司；0.25%胰酶、BCA蛋白定量试

剂盒购自北京碧云天公司；肌球蛋白轻链激酶（my-osinlightchainkinase，MLCK）、神经钙黏蛋白（N-cadherin）购自美国Abcam公司；肌球蛋白轻链（my-

osinlightchain，MLC）购自美国Proteintech公司；磷

酸化的肌球蛋白轻链（phosphorylatedmyosinlightchain，p-MLC）购自美国CellSignalingTechnology公

司；ECL试剂盒购自美国ThermoFisher公司。1．1．2主要实验仪器倒置显微镜（DMI3000B，德

国Leica公司）；电泳仪（DYY-11型，北京六一仪器

厂）；化学发光成像仪（上海勤翔仪器公司）；低温离

心机（Legendmicro21Ｒ，美国ThermoFisher公司）。1．2方法

1．2．1细胞培养将肝癌细胞HepG2培养在含

10%小牛血清（杭州四季青生物公司）的DMEM培

养基中，放置在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中。当细胞长至80%～90%密度，用0.25%胰酶消化传代。HepG2细胞株由安徽医科大学分子生物学实

验室馈赠。1．2．2实验分组、倒置显微镜下观察实验分溶剂

对照组（0.1%DMSO）、100nmol/LPMA组、10μmol/LATＲA组、10μmol/L4-HPＲ组、PMA+AT-ＲA组、PMA+4-HPＲ组，共6组。待细胞长至40%

～50%密度加药处理，48h后倒置显微镜下观察，

并拍照记录。

·961·

安徽医科大学学报ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2019Feb;54(2)1．2．3细胞划痕实验取处于对数生长期的HepG2细胞，胰酶消化吹打重悬为单细胞悬液，均匀种入24孔细胞培养板中。待细胞长成单层即弃去培养液，用200μl枪头在24孔板每孔中央划出一痕，洗去死细胞后显微镜下拍照作为0h。药物处理24h和48h，在同一观察点处拍照记录这两个时间点细胞划痕愈合情况，实验重复3次。利用ImageProPlus软件测量各孔多点划痕距离，取均值，并用处理前的距离减去处理后的距离即为24h、48h的细胞迁移距离，数据用统计软件分析。1．2．4Westernblot检测细胞N-cadherin、MLCK的表达和MLC的磷酸化收集药物处理48h的细胞，分组同前，加入ＲIPA缓冲液（pH7.4的Tris-HCl，150mmol/LNaCl，1mmol/LEDTA，1%TＲIton，0.1%SDS，磷酸酶抑制剂）提取蛋白，BCA法蛋白定量。取40μg每孔蛋白上样，进行SDS-PAGE电泳。电转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭2h，加入兔源单克隆抗体MLCK、兔源多克隆抗体MLC、鼠源单克隆抗体p-MLC、N-cadherin4℃孵育过夜，经TBST洗涤后再加入相应浓度的二抗室温孵育2h，洗涤后用ECL试剂盒反应，在化学发光成像仪上显影拍照记录。以ImageProPlus软件进行灰度扫描，分析各条带的灰度值，分别以p-MLC/MLC、MLCK/β-actin、N-cadherin/β-actin进行比值计算作半定量分析。实验重复3次，取其均值。1．3统计学处理采用SPSS10.0软件进行分析，数据以珋x±s表示，组间计量资料比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。2结果2．1不同处理组HepG2细胞生长和形态变化药物处理48h，显微镜下可见溶剂对照组和PMA组、PMA+ATＲA组细胞密度大，光泽度好（图1A、1B、1D）。ATＲA组细胞密度略有减少（图1C）。4-HPＲ组细胞数明显减少，失去正常生长，PMA+4-HPＲ组表现更为明显，形态更为细长，多核细胞减少（图1E、1F）。2．2不同处理组对HepG2细胞迁移的影响药物

处理24h的细胞，与溶剂对照组（迁移距离178±26.5μm）相比，PMA组（迁移距离237±32.6μm）

细胞的迁移距离增加（F=4.469，P＜0.05），4-HPＲ组（迁移距离93±22.0μm）和PMA+4-HPＲ组（迁移距离99±6.4μm）细胞的迁移距离减少（F=8.653，P＜0.05）。药物处理48h的细胞，与溶剂对

照组（迁移距离346±19.3μm）比较，PMA组（迁移

距离429±20.1μm）细胞的迁移距离仍增加（F=6.386，P＜0.05），4-HPＲ组（迁移距离140±26.6μm）和PMA+4-HPＲ组（迁移距离128±14.2μm）细胞的迁移距离仍减少（F=47.34，P＜0.05）。以上数据说明PMA单独处理可以增加肿瘤细胞的迁

移距离，而和4-HPＲ联用后，促迁移能力消失，转为

抑制效应（图2～3）。图2中同时观察到PMA+4-HPＲ组划痕边界的细胞形态更为细长，排列较稀

疏。提示二者联用作用时间若延长，对细胞迁移的

抑制可能更显著。2．3不同处理组对HepG2细胞迁移相关蛋白表达

的影响Westernblot结果分析表明PMA+4-HPＲ组、4-HPＲ组可明显降低MLCK、N-cadherin的表达和MLC的磷酸化（FMLCK/β-actin=128.385、FN-cadherin/β-actin=39.871、Fp-MLC/MLC=35.378，P＜0.05）。PMA+4-HPＲ处理组相比4-HPＲ组，ML-CK、MLC的磷酸化降低更显著（P＜0.05）。见图4。

图1倒置显微镜观察PMA、4-HPＲ处理后HepG2细胞的生长×100A：溶剂对照组；B：PMA组；C：ATＲA组；D：ATＲA+PMA组；E：4-HPＲ组；F：4-HPＲ+PMA

组

·071·安徽医科大学学报ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2019Feb;54(2)