高效液相色谱的特点与仪器
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高效液相色谱法
2．高效液相色谱法与气相色谱法的比较
（l）气相色谱法：分析对象仅占有机物总数的20％。 高效液相色谱法：分离和分析占有机物总数近80％的那些 高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质。
（2）气相色谱：流动相与组分不产生相互作用力，仅起运 载作用。 高效液相色谱法：流动相对组分可产生一定亲和力，并参与 固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用， 相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数；
高压输液泵应符合下列要求：密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速 更换溶剂及耐腐蚀。
高压输液泵
常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱 柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差。 目前主要使用恒流泵，又称机械泵，它又分机械注射泵和机械 往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
（四）检测系统
两种基本类型的检测器： 溶质型检测器：它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应， 属于这类检测器的有紫外、荧光、安培检测器等。 总体检测器：它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应， 属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 （l）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）示差折光率检测器 （4）电化学检测器
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography，HPLC
§1
概 述
Introduction
一、高效液相色谱法概述
高效液相色谱法（HPLC）吸取了气相色谱与经典液相色谱优 点，并用现代化手段加以改进。
引入了气相色谱的理论;
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器; 具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点;
高效液相色谱的原理和特点
高效液相色谱的原理和特点
原理：高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）指将溶剂内溶物舍位於柱内，实行气相色谱技术，以精细压力流体将溶质从柱出引出的技术。
特点：
（1）大量样品的分离。
高效液相色谱可以一次性从一种较复杂的混合物中分离出极其浓缩的物质；
（2）低噪音，柱有效利用率高，柱更换简单；
（3）可以进行多于其它型色谱仪器的数重分离；
（4）可扩大分离后物质的累积量，分离出稀释品使得分析非常单一；
（5）可以用HPLC巨额的改变参数来提高某些组分的良好分离性，如变换流动相，调节pH 等。
第1节 高效液相色谱的特点与仪器
三、流程及主要部件
高效液相色谱仪的主要部件： 储液罐、高压输液泵、进样装置、色谱柱、检 测器、记录仪和数据处理装置。 工作流程
2013-7-1
一、储液罐及流动相的脱气
1. 储液罐 溶剂在放人储液罐之前必须经过0.45μm滤膜过 滤：除去溶剂中的机械杂质，以防输液管道或进 样阀产生阻塞现象。 储液罐的材料应耐腐蚀 ：常用玻璃、氟塑料或 PEEK塑料 ，容积约为0.5～2.0L。 储液罐放置位置要高于泵体：以保持一定的输液 静压差。 使用过程储液罐应密闭：防溶剂蒸发引起流动相 组成变化，还可防止空气中O2、CO2重新溶于已 脱气的流动相中。
2013-7-1
2013-7-1
2013-7-1
特点：
最大优点是同时获得吸收值是保留时间和波长
函数的三维图。
可利用色谱保留值规律及光谱特征吸收曲线综
合进行定性分析。 可对每个色谱峰的指定位置（峰前沿、顶、尾） 进行光谱比较，以判断色谱峰的纯度及分离情 况。
目前灵敏度不及ＵＶ。
2013-7-1
（2） 光电二极管阵列检测器 二级管阵列检测器是UV检测器的重要进展，
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，
各检测特定波长，计算机快速处理。
2013-7-1
（2） 光电二极管阵列检测器
光源发出的辐射（氘灯）→吸收池→光栅（全
息）→二级管阵列检测器，并用电子学方法和计算
机技术采集数据→可得三维色谱图－光谱图
第二章 高效液相色谱分析法
high performance liquid chromatograph
第一节 高效液相色谱的 特点与仪器
feature and instrument of HPLC
【大学课程】分析化学第20章 高效液相色谱法
2021/11/1
梯度洗脱装置
外梯度（高压梯度）: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按 一定的比例送入梯度混合 室，混合后进入色谱柱。
内梯度（低压梯度）: 一台高压泵, 通过比
例调节阀,将两种或多种 不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混 合。
2021/11/1
（2）进样装置
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
3 L2
L2
0.75cm
2021/11/1
2021/11/1
液相色谱仪（3）
Agilent 1200 LC Systems
安捷伦1200 液相色谱系统
2021/11/1
液相色谱仪（4）
2021/11/1
二、流程及主要部件
1.流程
2021/11/1
2.主要部件
（1）高压输液泵：
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的 是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的 一元或多元溶剂。
（二）液-液分配色谱：LLC
有正相色谱和反相色谱之分
正相色谱（NPC)
反相色谱(RPC)
固定相极性
大
小
流动相极性
小
大
流动顺序 流动相极性↑，
极性小的组分先
流出 k↓，tR↓
极性大的组分先
2021/11/1
小结
• 掌握Van Deemter 方程在HPLC中的表现形式； • 掌握正相色谱和反相色谱的区别； • 掌握化学键合相色谱，特别是反相键合相色谱
梯度洗脱装置
外梯度（高压梯度）: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按 一定的比例送入梯度混合 室，混合后进入色谱柱。
内梯度（低压梯度）: 一台高压泵, 通过比
例调节阀,将两种或多种 不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混 合。
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（2）进样装置
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
3 L2
L2
0.75cm
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液相色谱仪（3）
Agilent 1200 LC Systems
安捷伦1200 液相色谱系统
2021/11/1
液相色谱仪（4）
2021/11/1
二、流程及主要部件
1.流程
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2.主要部件
（1）高压输液泵：
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的 是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的 一元或多元溶剂。
（二）液-液分配色谱：LLC
有正相色谱和反相色谱之分
正相色谱（NPC)
反相色谱(RPC)
固定相极性
大
小
流动相极性
小
大
流动顺序 流动相极性↑，
极性小的组分先
流出 k↓，tR↓
极性大的组分先
2021/11/1
小结
• 掌握Van Deemter 方程在HPLC中的表现形式； • 掌握正相色谱和反相色谱的区别； • 掌握化学键合相色谱，特别是反相键合相色谱
高效液相色谱检测器的种类及特点
一、概述高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分析化学技术，广泛应用于化学、生物、医药和食品等领域。
在HPLC技术中，检测器是至关重要的一部分，它负责检测样品中化合物的浓度，并将其转化为可读的信号输出。
本文将对HPLC检测器的种类及特点进行详细介绍。
二、紫外-可见光（UV-Vis）检测器1. 原理：UV-Vis检测器利用化合物中的紫外或可见光吸收特性来检测化合物。
2. 特点：1）广泛适用：UV-Vis检测器适用于大多数有机化合物和许多无机化合物的分析。
2）灵敏度高：对于绝大多数有机化合物，UV-Vis检测器的灵敏度较高。
3）简单易用：UV-Vis检测器的操作相对简单，适合实验室常规分析。
三、荧光检测器1. 原理：荧光检测器利用化合物在受激光照射下产生荧光的特性来检测化合物。
2. 特点：1）高灵敏度：荧光检测器对于有荧光活性的化合物具有极高的灵敏度。
2）特异性强：由于荧光本身具有较高的特异性，荧光检测器可以用于分析中对混杂物的忽略。
3）应用广泛：在生物学、医学和环境领域，荧光检测器得到了广泛的应用。
四、蒸发光散射检测器1. 原理：蒸发光散射检测器通过样品与蒸发后的溶剂之间的差异来检测化合物。
2. 特点：1）通用性强：蒸发光散射检测器对于大多数非吸收性化合物都具有较好的检测能力。
2）无需色谱柱：相比于其他检测器，蒸发光散射检测器可以不需要色谱柱，适用于高分子化合物的检测。
3）灵敏度较低：蒸发光散射检测器的灵敏度通常较低，需要较高浓度的样品才能进行检测。
五、质谱检测器1. 原理：质谱检测器通过将化合物转化为离子，并对离子进行质量分析来检测化合物。
2. 特点：1）高分辨率：质谱检测器具有极高的分辨率，可以准确确定化合物的质荷比。
2）特异性强：质谱检测器对于复杂混合物的成分分析具有很强的特异性。
3）操作复杂：相比于其他检测器，质谱检测器的操作和维护较为复杂，需要专业的操作人员。
六、综述HPLC检测器种类繁多，每种检测器都有其特定的适用场景和优势。
高效液相色谱分析法(仪器+组成+分离类型+流动相选择)
1、流 程
2、主 要 部 件
(1) 高压输液泵
主要部件之一，压力：30MPa以上。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ <10μm），液体的流动相高速通过时，将产生 很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱 的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、 流量稳定可调、耐腐蚀等特性
(2)梯度淋洗装置
3.离子交换色谱分离固定相
结构类别： （1）薄壳型离子交换树脂
薄壳玻璃珠为担体，表 面涂约1%的离子交换树脂； （2）离子交换键合固定相
薄壳键合型；微粒硅胶 键合型（键合离子交换基团）
树脂类别： （1） 阳离子交换树脂（强酸 性、弱酸性） （2） 阴离子交换树脂（强碱 性、弱碱性）
4. 空间排阻分离固定相
liquid-solid adsorption chromatography 固定相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较
常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：利用溶质分子占据固定相表面吸 附活性中心能力的差异；适用于分离相对分子 质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合 物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
GC：H = A + B / u + C • u （填充柱）
A = 2λ • dp
A ∝ λ • dp
B = 2γ • Dm = 2γ • Dg B ∝ t R ，B ∝ Dg
Dg
∝
T η
或Dg
∝
T M
B = 2γ • Dm
Dm
∝
T η
柱温T ↓低，流动相η ↑大 ⇒B相忽略
在高效液相色谱中, 液体的扩散系数
(4) 高效分离柱
2、主 要 部 件
(1) 高压输液泵
主要部件之一，压力：30MPa以上。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ <10μm），液体的流动相高速通过时，将产生 很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱 的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、 流量稳定可调、耐腐蚀等特性
(2)梯度淋洗装置
3.离子交换色谱分离固定相
结构类别： （1）薄壳型离子交换树脂
薄壳玻璃珠为担体，表 面涂约1%的离子交换树脂； （2）离子交换键合固定相
薄壳键合型；微粒硅胶 键合型（键合离子交换基团）
树脂类别： （1） 阳离子交换树脂（强酸 性、弱酸性） （2） 阴离子交换树脂（强碱 性、弱碱性）
4. 空间排阻分离固定相
liquid-solid adsorption chromatography 固定相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较
常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：利用溶质分子占据固定相表面吸 附活性中心能力的差异；适用于分离相对分子 质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合 物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
GC：H = A + B / u + C • u （填充柱）
A = 2λ • dp
A ∝ λ • dp
B = 2γ • Dm = 2γ • Dg B ∝ t R ，B ∝ Dg
Dg
∝
T η
或Dg
∝
T M
B = 2γ • Dm
Dm
∝
T η
柱温T ↓低，流动相η ↑大 ⇒B相忽略
在高效液相色谱中, 液体的扩散系数
(4) 高效分离柱
高效液相、气相色谱法及红外色谱仪的简单介绍
高效液相色谱法
二、高效液相色谱法的特点
特点：高压、高效、高速
Feature of HPLC
高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
概述
• 高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经典液相色谱法 为基础，引入了气相色谱的理论与实验方法，流动相用高 压泵输送，采用高效固定相和在线检测等手段发展而成的 分离分析方法 。 • 与气相色谱法相比具有：适用范围广，样品预处理简单， 分离效率高，流动相选择范围广，检测方法多为非破坏性 的，流出组分可回收等优点。
研究范围
• 近红外区：主要研究稀土和过渡金属离子的化合物， 水，含氢原子团化合物的定量分析。 • 中红外光区（又称红外光谱区）：绝大多数有机化 合物和无机离子的基频吸收带都出现在该区，由于 基频振动是最强的吸收，适宜进行定性、定量分析。 • 远红外光谱区：由于低频骨架振动能很灵敏地反应 出结构变化，所以对异构体的研究特别方便，还可 用于金属有机化合物的、氢键、吸附现象的研究， 但由于该光区弱，一般不在此范围内进行分析。
2.主要部件
（1）高压输液泵
主 要 部 件 之 一 ， 压 力 ： 150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒 度很小的固定相（ <10 μm）
，液体的流动相高速通过时， 将产生很高的压力，因此高 压、高速是高效液相色谱的 特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、 流量稳定可调、耐腐蚀等特 性。
三种重要仪器的原理及使用 方法
气相色谱法 高效液相色谱法
红外吸收光谱法
目录
1 2 3
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
气相色谱法
气相色谱仪 气相色谱检测器
4
气相色谱的应用
定义
以惰性气体为流动相、以固定液或固 体吸附剂作为固定相的色谱法称为气 相色谱法（GC）。
高效液相色谱法HPLC
VS
报告结果
整理分析数据，撰写分析报告，提供各组 分的浓度、纯度等相关信息，为科研或生 产提供决策依据。
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实验操作步骤
流动相的准备与平衡
根据实验要求配制流动相，通过泵以适宜的流速 通过色谱柱进行平衡。
洗脱与检测
流动相带着样品经过色谱柱洗脱，各个组分依次 流出并进入检测器进行检测。
ABCD
进样
将样品注入进样器，通过压力将样品送入色谱柱 进行分离。
数据处理与结果分析
对检测器输出的信号进行处理，得到各组分的峰 形和峰面积，进行定性和定量分析。
01
02
03
04
进样
将样品注入色谱柱。
分离
在流动相的带动下，样品中的 组分在色谱柱中进行分离。
检测
检测器对分离后的组分进行检 测，并记录信号。
数据处理
对采集到的数据进行处理、分 析和存储。
高效液相色谱仪的维护和保养
定期清洗色谱柱
使用适当的溶剂清洗色谱柱， 以去除残留物和杂质。
维护和检查检测器
定期检查检测器的性能和准确 性，确保其正常运行。
数据处理系统
用于采集、处理、分析和存储色谱数据，通常采用色谱工 作站。
高效液相色谱仪的操作流程
01
02
03
样品准备
将样品进行适当处理，以 便注入色谱柱。
流动相制备
根据实验要求，选择合适 的流动相，并进行过滤和 脱气处理。
系统平衡
在进样之前，确保色谱系 统达到平衡状态，以提高 分离效果。
高效液相色谱仪的操作流程
样品的预处理
分离
对于复杂样品，需要进行分离操 作以去除杂质或提取目标成分。 常用的分离方法包括离心、过滤、
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➢ 储液罐的材料应耐腐蚀 ：常用玻璃、氟塑料或 PEEK塑料 ，容积约为0.5~2.0L。
➢ 储液罐放置位置要高于泵体：以保持一定的输液 静压差。
➢ 使用过程储液罐应密闭：防溶剂蒸发引起流动相 组成变化，还可防止空气中O2、CO2重新溶于已 脱气的流动相中。
2020/10/6
2．流动相脱气 流动相在使用前必须进行脱气处理
2020/10/6
5.应用范围广 制 的品，天分适然H析4HP.P于 物仅分LL分 及C需C析析 各法几载速生 种不分液度物高受钟流快大分样到速分子品几可子化沸十达、合点分1~离物、钟10子。挥。m型原发l/m化则度in合上和，物相热完、对稳成不分定一稳子性个定量限样
大于400 的有机物都可用 HPLC 法分析。
3．梯度洗脱装置 梯度洗提：在分离过程中按一定的程序连续改
变载液中溶剂的配比和极性。
通过载液极性改变来改变分离因素，改善分离 效果、缩短分析时间、改善峰形，提高分析精度。
➢ 高压梯度（内梯度） 两台高压泵，将两种
不同极性溶剂按一定比例 送入梯度混合室，混合后 进入色谱柱。
2020/10/20/10/6
二、高压输液泵
1. 高压泵性能
• 有足够的输出压力：压力范围250~400kg/cm2。
• 输出流量恒定：流量精密度应在1%，无脉动。 • 流量范围宽：分析仪器应在0.1 ~10.0ml/min。
制备仪器1~100ml/min。
• 抗溶剂的腐蚀：常用不锈钢和PEEK塑料。
2020/10/6
HPLC的局限性
➢ 分析成本高，宜引起污染。 ➢ 缺少高灵敏度的通用型检测器。 ➢ 不能替代GC完成沸程范围宽的石油产品的分
析。
2020/10/6
➢ 操作较GC复杂。
HPLC与GC比较
气相色谱 只能分析挥发性物质 不能用于热不稳定物质的分析
高效液相色谱 几乎可分析各种物质 可用于热不稳定物质的分析
➢ 除去其中溶解气体，防止流动相由柱流至检测器 时，因压力降低而产生气泡，而增加基线噪声。
➢ 使用荧光检测器，溶解在流动相中的氧气，会造 成荧光猝灭。
➢ 还会导致样品中某些组分被氧化或会使柱中固定 相发生降解而改变柱的分离性能。
2020/10/6
常用的脱气方法
➢ 吹氦脱气法，在0.1MPa下，以约60mL/min流 速通入流动相10~15min。此法适用于所有的溶剂 ，脱气效果较好，但价格较贵。
➢ 加热回流法，此法的脱气效果较好 。 ➢ 抽真空脱气法，用微型真空泵除去溶解气体， 降压至0.05~0.70MPa。 ➢ 超声波脱气法，流动相置放于超声波清洗器中 ，用超声波振荡10~15min。脱气效果最差。 ➢ 在线真空脱气法，真空脱气装置串接到储液系 统中，使流动相进入输液泵前连续真空脱气。此 法脱气效果最好，适于多元溶剂体系 。
➢ 低压梯度（外梯度）: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种
不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。
2020/10/6
2020/10/6
三、进样装置
➢ 流路中为高压力工作状态； ➢ 通常使用耐高压的六通阀进样装置；
特点：耐高压，进样的重现性好，易于自动化， 易造成色谱峰柱前扩宽。
2020/10/6
HPLC的优点
123. 分选检离择测效性灵能 高 敏高 度高
GHCPL分C离广柱效泛效能采高较用，高流，灵动n敏相=度1可0检3以塔测控板器制/米，和，如改HU善PVL分（C离1可0的-9 达 选 g/m到择L性5）×。，10荧3~光3×检1测04器塔（板1/0米-11，g/m可L使）用。较短的柱子。
2020/10/6
(2) 恒压泵：常用气动泵 根据压力传导原理设计的，即 P1.SA=P2.SB P1 低压，推动大面积 SA，则在小面积 SB 活塞
输出大压力P2 。
特点：压力恒定，无脉动，液腔体积较大，更 换流动相不方便。当泵的负荷阻力小时可提供大的 输出流量，适于匀桨法填装柱子。
2020/10/6
general process and main assembly of HPLC
2020/10/6
一、液相色谱仪器（ high performance
liquid chromatograph）
2020/10/6
Waters LC 2695
2020/10/6
IC 4500i
2020/10/6
二、高效液相色谱法的特点
三、进样装置
装入状态
采样环
进色谱柱 泵入溶剂 出口
2020/10/6
进样状态
四、柱高材：效一分般离采柱用不锈钢管和 PEEK 塑料。
柱型及尺寸：一般采用管内径1～6 mm，柱长 5～40 cm直型柱，标准柱型φ3.9 或 4.6mm ，L 15、
• 泵死体积要小；以便迅速更换溶剂和梯度洗提。
2020/10/6
2. 高压泵分类： 恒流泵：输出流量恒定，与柱引起阻力无关。 恒压泵：输出压力恒定，与柱引起阻力无关。
(1) 恒流泵：常用往复式柱塞泵和注射泵。
特点：流量恒定，液腔体积小（0.1ml），更换 溶剂和梯度洗提方便，但有脉动，应用广泛。
2020/10/6
第二章 高效液相色谱法
high performance liquid chromatograph
第一节 高效液相色谱的
特点与仪器
feature and instrument of HPLC
一、高效液相色谱仪
instrument of HPLC
二、高效液相色谱法的 特点
feature of HPLC
三、流程及主要部件
毛细管色谱可得到很高的柱效
色谱柱不能很长、柱效不会 很高
有很灵敏检测器和较灵敏的通用检测器 没有较灵敏的通用检测器
流动相为气体，无毒、易于处理
流动相有毒、费用较高
运行和操作容易 仪器制造难度较小
运行和操作较气相难 仪器制造难度较大
实际应用中，凡是能用GC分析的样品一般不
用HPLC，因为GC更快，更灵敏，更方便，且耗费
较低 。
2020/10/6
三、流程及主要部件
高效液相色谱仪的主要部件： 储液罐、高压输液泵、进样装置、色谱柱、检 测器、记录仪和数据处理装置。 工作流程
2020/10/6
一、储液罐及流动相的脱气
1. 储液罐 ➢ 溶剂在放人储液罐之前必须经过0.45μm滤膜过
滤：除去溶剂中的机械杂质，以防输液管道或进 样阀产生阻塞现象。
➢ 储液罐放置位置要高于泵体：以保持一定的输液 静压差。
➢ 使用过程储液罐应密闭：防溶剂蒸发引起流动相 组成变化，还可防止空气中O2、CO2重新溶于已 脱气的流动相中。
2020/10/6
2．流动相脱气 流动相在使用前必须进行脱气处理
2020/10/6
5.应用范围广 制 的品，天分适然H析4HP.P于 物仅分LL分 及C需C析析 各法几载速生 种不分液度物高受钟流快大分样到速分子品几可子化沸十达、合点分1~离物、钟10子。挥。m型原发l/m化则度in合上和，物相热完、对稳成不分定一稳子性个定量限样
大于400 的有机物都可用 HPLC 法分析。
3．梯度洗脱装置 梯度洗提：在分离过程中按一定的程序连续改
变载液中溶剂的配比和极性。
通过载液极性改变来改变分离因素，改善分离 效果、缩短分析时间、改善峰形，提高分析精度。
➢ 高压梯度（内梯度） 两台高压泵，将两种
不同极性溶剂按一定比例 送入梯度混合室，混合后 进入色谱柱。
2020/10/20/10/6
二、高压输液泵
1. 高压泵性能
• 有足够的输出压力：压力范围250~400kg/cm2。
• 输出流量恒定：流量精密度应在1%，无脉动。 • 流量范围宽：分析仪器应在0.1 ~10.0ml/min。
制备仪器1~100ml/min。
• 抗溶剂的腐蚀：常用不锈钢和PEEK塑料。
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HPLC的局限性
➢ 分析成本高，宜引起污染。 ➢ 缺少高灵敏度的通用型检测器。 ➢ 不能替代GC完成沸程范围宽的石油产品的分
析。
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➢ 操作较GC复杂。
HPLC与GC比较
气相色谱 只能分析挥发性物质 不能用于热不稳定物质的分析
高效液相色谱 几乎可分析各种物质 可用于热不稳定物质的分析
➢ 除去其中溶解气体，防止流动相由柱流至检测器 时，因压力降低而产生气泡，而增加基线噪声。
➢ 使用荧光检测器，溶解在流动相中的氧气，会造 成荧光猝灭。
➢ 还会导致样品中某些组分被氧化或会使柱中固定 相发生降解而改变柱的分离性能。
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常用的脱气方法
➢ 吹氦脱气法，在0.1MPa下，以约60mL/min流 速通入流动相10~15min。此法适用于所有的溶剂 ，脱气效果较好，但价格较贵。
➢ 加热回流法，此法的脱气效果较好 。 ➢ 抽真空脱气法，用微型真空泵除去溶解气体， 降压至0.05~0.70MPa。 ➢ 超声波脱气法，流动相置放于超声波清洗器中 ，用超声波振荡10~15min。脱气效果最差。 ➢ 在线真空脱气法，真空脱气装置串接到储液系 统中，使流动相进入输液泵前连续真空脱气。此 法脱气效果最好，适于多元溶剂体系 。
➢ 低压梯度（外梯度）: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种
不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。
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三、进样装置
➢ 流路中为高压力工作状态； ➢ 通常使用耐高压的六通阀进样装置；
特点：耐高压，进样的重现性好，易于自动化， 易造成色谱峰柱前扩宽。
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HPLC的优点
123. 分选检离择测效性灵能 高 敏高 度高
GHCPL分C离广柱效泛效能采高较用，高流，灵动n敏相=度1可0检3以塔测控板器制/米，和，如改HU善PVL分（C离1可0的-9 达 选 g/m到择L性5）×。，10荧3~光3×检1测04器塔（板1/0米-11，g/m可L使）用。较短的柱子。
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(2) 恒压泵：常用气动泵 根据压力传导原理设计的，即 P1.SA=P2.SB P1 低压，推动大面积 SA，则在小面积 SB 活塞
输出大压力P2 。
特点：压力恒定，无脉动，液腔体积较大，更 换流动相不方便。当泵的负荷阻力小时可提供大的 输出流量，适于匀桨法填装柱子。
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general process and main assembly of HPLC
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一、液相色谱仪器（ high performance
liquid chromatograph）
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Waters LC 2695
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IC 4500i
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二、高效液相色谱法的特点
三、进样装置
装入状态
采样环
进色谱柱 泵入溶剂 出口
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进样状态
四、柱高材：效一分般离采柱用不锈钢管和 PEEK 塑料。
柱型及尺寸：一般采用管内径1～6 mm，柱长 5～40 cm直型柱，标准柱型φ3.9 或 4.6mm ，L 15、
• 泵死体积要小；以便迅速更换溶剂和梯度洗提。
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2. 高压泵分类： 恒流泵：输出流量恒定，与柱引起阻力无关。 恒压泵：输出压力恒定，与柱引起阻力无关。
(1) 恒流泵：常用往复式柱塞泵和注射泵。
特点：流量恒定，液腔体积小（0.1ml），更换 溶剂和梯度洗提方便，但有脉动，应用广泛。
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第二章 高效液相色谱法
high performance liquid chromatograph
第一节 高效液相色谱的
特点与仪器
feature and instrument of HPLC
一、高效液相色谱仪
instrument of HPLC
二、高效液相色谱法的 特点
feature of HPLC
三、流程及主要部件
毛细管色谱可得到很高的柱效
色谱柱不能很长、柱效不会 很高
有很灵敏检测器和较灵敏的通用检测器 没有较灵敏的通用检测器
流动相为气体，无毒、易于处理
流动相有毒、费用较高
运行和操作容易 仪器制造难度较小
运行和操作较气相难 仪器制造难度较大
实际应用中，凡是能用GC分析的样品一般不
用HPLC，因为GC更快，更灵敏，更方便，且耗费
较低 。
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三、流程及主要部件
高效液相色谱仪的主要部件： 储液罐、高压输液泵、进样装置、色谱柱、检 测器、记录仪和数据处理装置。 工作流程
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一、储液罐及流动相的脱气
1. 储液罐 ➢ 溶剂在放人储液罐之前必须经过0.45μm滤膜过
滤：除去溶剂中的机械杂质，以防输液管道或进 样阀产生阻塞现象。