白酒窖泥新菌种的筛选新方法共47页文档
基于新老窖泥的微生物菌群结构判定浓香型白酒生产中的主体己酸菌
基于新老窖泥的微生物菌群结构判定浓香型白酒生产中的主体己酸菌任聪;辜杨;杜海;徐岩【摘要】对新、老窖泥的微生物菌群结构和进化关系,及其与酒醅发酵过程中己酸、丁酸产生的相关性进行了分析,发现窖泥中主体己酸菌为梭菌纲下的己酸菌属微生物,该属下的3种己酸菌在窖泥中均有发现,且以乳酸利用型己酸菌为主体;而通常被认为是窖泥中主体己酸菌的梭菌纲梭菌属微生物克氏梭菌在新老窖泥中的丰度均较低.该研究对浓香型白酒酿造窖泥中的己酸菌类型进行了初步的解析,相关分析方法与结果将为研究窖泥中己酸菌的酿造功能及应用价值奠定基础.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2018(044)012【总页数】7页(P8-14)【关键词】己酸菌;窖泥;浓香型白酒【作者】任聪;辜杨;杜海;徐岩【作者单位】江南大学生物工程学院,酿酒科学与酶技术研究中心,江苏无锡,214112;江南大学,教育部工业生物技术重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,酿酒科学与酶技术研究中心,江苏无锡,214112;江南大学生物工程学院,酿酒科学与酶技术研究中心,江苏无锡,214112;江南大学,教育部工业生物技术重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,酿酒科学与酶技术研究中心,江苏无锡,214112;江南大学,食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡,214112;江南大学,教育部工业生物技术重点实验室,江苏无锡,214122【正文语种】中文浓香型白酒是中国三大基本香型白酒(浓香型、清香型和酱香型)之一，其酿造特征被总结为“千年老窖万年糟”“以窖养糟,以糟养泥”等俗语，这些经验总结是古人酿造智慧的集中体现。
生产上历来对窖泥品质给予了高度的关注，尤其重视以己酸菌(产己酸细菌的统称)为代表的挥发性风味物质产生的细菌。
近年来，随着微生物生态学与微生物组学的发展，相关技术手段的发展使窖泥中蕴含的厌氧微生物科学奥秘能逐步得以剖析。
窖泥检测原理和方法
.窖泥是浓香型大曲酒生产过程中的重要条件之一,它对酒中微量香味成份的形成与其量比关系起着重要的作用.窖泥质量的好坏直接影响浓香型大曲酒产品的质量.取回的泥样〔包括人工培窖的黄泥、发酵泥、复壮泥〕因水分大,不宜长期贮存,应即将平摊在瓷盘、木板,或者光洁地面上,层厚约2cm,风干3~5 昼夜, 间隔翻拌,使之均匀风干.在半干时,将大块土捣碎, 以免彻底干后成硬块,不易粉碎.泥样风干后,用四分法分取约250g,研磨成粉,并通过60 目筛,保存在磨口瓶中.氨态氮在风干过程中易变化,需用新鲜的泥样测定, 同时测定水分, 以换算为绝干样的含.窖泥中水分普通可分为三类, 即化合结合水,吸湿水,和自由水.本法在105- 110℃烘干法, 在此温度下自由水和吸湿水都能烘干,实际上在此温度下所失去的是挥发性物质的总量.电热鼓风干燥箱〔烘箱〕；称量皿〔可用滤纸包代替〕；电子天平.〔1〕风干土样水分测定：取风干土样4－5g,平铺于已烘干至恒重的称量皿中.在105 －110℃烘箱内烘6h 后,取出、加盖,在干燥器中冷却30min 后称重,再于100－105℃烘1h,冷却、称重,直至恒重〔两次质量差小于0.002g〕.〔2〕新鲜土样水分测定称取土样10－15g.测定方法同〔1〕.w 一水分和挥发物含量,％；m——烘干前空皿与试样质量之和, g.m l——烘干后空皿与试样质量之和, g.原理因酿酒微生物生长繁殖过程中的生化变化和代谢产物受害泥pH 的影响较大,故在人工培容过程中,必须测定土壤的pH.窖泥经水提取后,用pH 计测定.仪器和试剂〔1〕酸度计：测定X 围pH 0—14,最小分度为0.02pH量〔2〕pH 标准缓冲溶液.测定步骤按仪器说明书校正PH 计,并注意校正和测量时温度一致.将电极和小烧杯用蒸馏水冲洗干净,再塌样品冲洗6－8 次,将电极插入盛有样品的小烧杯中,测量样品的PH.称取风干、粉碎后的土样5.0g,于100mL 烧杯中加水50mL,间歇搅拌30min,放置30min, 用pH 计测定试样pH.原理奈氏试剂与氨反映生成浅黄色至红棕色的络合物.氨态氮浓度低时,溶液成黄色,可在400-425nm 测定吸光度.氨态氮浓度高时,溶液成红色,可在450-500nm 测定吸光度.测得的吸光度与标准比较即可求得氨态氮的浓度.当氨态氮高于1mg/L 时,产生红褐色沉淀,则不能比色.本法测得的氨态氮是游离氨和铵离子含氮的总量,因为铵盐在碱性溶液中将转变为能与奈氏试剂反应的氨.溶液中氨越多,则生成黄色越深.溶液中某些杂质〔Ca、Mg 等离子〕的存在, 能与奈氏试剂形成沉淀,使溶液浑浊干扰氨的测定.为避免此有害作用,故在待测液中加入酒石酸钾钠,可与Ca 、Mg 作用生成不解离的化合物,就可避免与奈氏试剂的相互作用.试剂〔1〕奈氏试剂：称取10g 碘化汞、7g 碘化钾,溶解后加到50mL360g／LNaoH 溶液中,摇匀, 稀释至100mL,摇匀,静置,取上层清液使用.贮存于棕色具胶塞瓶中,可保存1 年.〔2〕酒石酸钠钾溶液：50g 酒石酸钠钾溶于100mL 水中,为驱除酒石酸钠钾中可能存在的铵盐,煮沸蒸发约1／3 体积,冷却后再稀释至100mL.〔3〕氯化铵标准液：准确称取0.3819gNH4Cl,溶于水并定容至100mL.其浓度以N 计为1mg/mL〔4〕氯化铵标准使用液：吸取氯化铵标准液10mL 用水稀释定容至1L.浓度以N 计为10ug／mL,以NH3 计为12.2ug／mL.其余：100g/L 的氯化钠溶液；比色管；纳氏试剂；分光光度计.测定步骤〔1〕试样制备称取新鲜泥样1 —5g<准确至0.01g>,加入100g／L 的氯化钠溶液,使体积为25mL,搅匀,浸出10min<必要时把硬块捣碎>,用于滤纸过滤后备用.吸取1mL 滤液<必要时用水稀释后再吸取>于50mL 比色管中,用水稀释至刻度.加人1—2 滴酒石酸钠钾溶液和1mL 纳氏试剂,充分混匀.放置10min 后以标准系列中"0〞管为空白,于波长425nm 处测吸光度.〔2〕标准系列配制吸取标准使用液<10ug／mL 的氮> 0mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL 分别置入50mL 比色管中,用水稀释至刻度后,按试样相同显色、测吸光度. 以吸光度对氨态氮〔N〕微克数绘制标准曲线.或者用目测法进行比较.计算氨态氮<绝干计,mg／100g> ＝c*25*n*<1/m>*<1/1000>*100*[1/<1-w>]式中c ―― 试样溶液中氨态氮质量,ug；25——泥样稀释体积,mL；n——试样再稀释倍数,若再也不稀释,则n=1；m——新鲜泥样质量,g1000——把ug 换算成mg 的系数,w——新鲜泥样水分, ％.原理测定窖泥中有效磷时,采用酸性氟化铵浸提,提出的磷酸或者磷酸盐,在酸性溶液中加入酸性钼酸铵,生成黄色磷钼酸盐,再和还原剂氯化亚锡作用生成蓝色的络合物, 比色测定.试剂〔1〕氟化铵—盐酸溶液：称取0.56g 氟化铵溶于400mL 水中,加人12.5mL 1mol/L HCl 溶液,用水稀释至500mL,贮于塑料瓶中.〔2〕酸性钼酸铵溶液：称取5g 钼酸铵溶于42mL 水中；在另一烧杯中注人8mL 水和82mL 浓盐酸.然后在搅拌下把钥酸铵溶液倒入烧杯中,贮于棕色瓶中.〔3〕氯化亚锡溶液：称取1g 氯化亚锡<SnCl2 ·2H20>溶于40mL 1mol／L HCl 溶液中, 贮于棕色瓶中.〔4〕无磷滤纸：将直径为9cm 的定性滤纸浸于0 ．2mol/LHcl 溶液中4—5h,使磷、砷等化合物溶出,取出后用水冲洗数次,再用0.2mol/L HCl 淋洗数次.最后用水洗至无酸件,在60℃烘箱中干燥.〔5〕磷标谁液：准确称取于110℃干燥2h 后冷却的磷酸二氢钾<KH2PO4> 0.2195g,溶于水,并定容至1L.此溶液含磷为50ug/mL.〔6〕磷标准使用液：准确吸取磷标准溶液25mL 于250mL 容量瓶中,用水稀释至刻度, 其浓度为5ug/mL.测定步骤〔1〕试样处理称取2.00g 风干土样于50mL 烧杯中,加入氯化铵-盐酸溶液至20mL 浸泡30min,每隔5min 搅拌1 次.然后用烘干的无磷滤纸过滤,加入约0. 1g 硼酸,摇匀,使之溶解后备用.〔2〕磷的测定吸取1mL 试样浸出液,注入25mL 容量瓶中,用水稀释至刻度.吸取此稀释液1—2 ．5mL<视磷含量多少而异,普通黄泥含磷少,可直接取浸出滤液测定.窖皮泥磷含量较高,吸取稀释液2 ．5mL 测定.老窖泥含磷量多,吸取1mL 稀释液即可>,于25mL 比色管中, 加入2mL 酸性铜酸铰溶液和3 滴氯化亚锡溶液,用水稀释至刻度.放置15min 后,用2cm 比色皿在680nm 波长处, 以标准系列中"0〞管为空白测定吸光度.〔3〕标准系列制备吸取磷标准使用液0mL 0.5mL、1.0mL 2.0mL、3.0mL、5.0mL, 分别注入25mL 比色管中.加入2mL 酸性相酸铰溶液和3 滴氯化亚锡溶液显色,用水稀释至刻度. 同上条件测定吸光度, 以吸光度为纵坐标,标准液的磷微克数为横坐标,绘制标难曲线.计算有效磷含量<mg／100mg>＝m1*<1/v>*25*20*<1/m>*<1/1000>*100*[1/<1-w>]式中m1 一—试样溶液中有效磷质量,ugv——吸取稀释试样的体积,mL25——稀释试样总体积,mL20——试样浸取液体积,mLm 一风干泥试样质量,gw 一风干试样水分, ％.原理测定有效钾时用碳酸铵将试样中的钙镁沉淀,然后用灼烧法除去铵盐.再在微酸性溶液中用亚硝酸钴钠沉淀钾.生成的亚硝酸钴钾钠的黄色沉淀在酸性溶液中,用过量的高锰酸钾分解, 剩余的高锰酸钾加过量草酸钠除去.多余的草酸钠在用高锰酸钾回滴. 由高锰酸钾与亚硝酸钴钾钠反应的实际消耗量计算试样中的钾含量.试剂①碳酸铵溶液：称取28.5g 碳酸铵溶于水,稀释至1L.②0.01mol／L 硝酸溶液：取6.7mL 浓硝酸用水稀释至1L.再稀释10 倍为0.01mol/L.③200g／L 亚硝酸钴钠溶液：称取10g 亚硝酸钴钠,溶于50mL 水中,临用时配制.④0.01mol／L 硼酸溶液：称取0.6g 硼酸溶于水,稀释至1L.测定步骤①试样处理：准确称取2 ．500g 风干土样于250mL 具塞三角瓶中,加入100mL 碳酸铵溶液, 浸出1h,此间每15min 摇动1 次.然后用1 号烧结玻璃滤器上铺滤纸片抽气过滤,用100mL 钼酸铵溶液分3—4 次洗涤.过滤速度不宜太快, 以使土壤胶体吸附的钾全部置换出来,将浸出液定量移人蒸发皿内,在水浴上蒸于.残渣加3—5mL 硝酸再蒸干,并反复操作3 次,至有机物去净. 蒸干后,在低于500℃的条件下灼烧去除氨,冷却至室温.②钾的沉淀：在灼烧去除氨的试样蒸发皿中,准确加入25mL 0. 1mol/L 硝酸溶液,用带橡皮头的玻璃棒洗皿壁,使残留物溶解并混合均匀.迅速用干滤纸过滤于50mL 三角瓶中,吸取10mL滤液于200mL 烧杯中,边搅拌边徐徐加入10mL 亚硝酸钻钠溶液,盖好表面皿,在20℃放置过夜,使沉淀彻底.用2 号烧结玻璃滤器上铺定量滤纸片<事先烘干至恒重>,抽气过滤,将0.01mol／L 硼酸将杯中沉淀全部移人滤器.再用0.01mol/L 硝酸洗沉淀10 次．每次1mL.接着用95％的乙醇洗5 次,每次2mL.擦干滤器外避,在110℃烘1h,置干燥器中冷却后称重.计算沉淀组成为K2NaCo<Na3>6 ·H2O,其中K2O＝17.216％*0. 17216*<1/10>*25*<1/m>*1000*100*[1/<1-w>]X=m1式中x —绝干试样中有效钾含量<以K20 计〕,mg/100g;一亚硝酸钴钠钾沉淀质量,g;mlm 一风干试样质量,g;10 一一测定时吸取浸出液体积25 一—浸出液总体积,mL；1000－一换算成mg 的系数；w——试样水分, ％.原理样品经灰化后,在酸性溶液中,钙与草酸生成草酸钙,经硫酸溶解后,用高锰酸钾标准溶液滴定,从而计算出钙的含量.反应如下：试剂〔1〕1 ：1 盐酸溶液；〔2〕0. 1%甲基红指示剂；〔3〕1 ：4 乙酸溶液；〔4〕1 ：4 氢氧化铵溶液；〔5〕2N 硫酸溶液；〔6〕4%草酸铵溶液；〔7〕1N 高锰酸钾标准溶液.测定方法〔1〕样品处理：准确称取均匀样品2.00~4.00g,置于坩埚中,在电炉上小火炭化无烟,移入550~600.C 高温炉中灰化,直至灰分呈白色为止〔必要时,可在加入浓硝酸润湿后再灰化,有促进样品灰化至白色的作用〕.取出出,待冷却后加入6N 盐酸溶液20ml,加热溶解灰分,然后用水称入100ml 容量瓶中,辊入至刻度,摇匀.〔2〕样品分析：准确吸取样品溶液5ml,移入15ml 离心管中,加入甲基红指示剂1 滴、4%草酸铵溶液 2ml 、1：4 乙酸溶液 0.5ml,振荡均匀.用 1：4 氢氧化铵溶液将溶液调至微黄色, 再用 1：4 乙酸溶液调至微红色,放置 1 小时,使沉淀彻底析出.离心 15 分钟,小心倾去上层清液, 在沉淀中加入 2ml 2N 硫酸摇匀,置于 70~80.C 热水浴中,用 1 N 高锰酸钾标准溶液进行滴定至 淡红色不退色为止.计算式中 N ——高锰酸钾标准溶液的当量浓度；V ——滴定所消耗高锰酸钾标准溶液的量；20—— 1N 高锰酸钾标准溶液 1ml 相当于钙的量；说明用高锰酸钾滴定时要不断振荡使溶液均匀.这方法比较精确,但需要离心沉淀.原理在硫酸存在下,用已知过量的重铬酸钾溶液与窖泥共热,使其中的活性有机质的碳被氧化. 而剩余的重铬酸钾, 以邻菲罗林亚铁为指示剂 ,用硫酸亚铁铵溶液滴定 ,从所消耗的重铬酸钾 量来计算有机碳的含量.仪器与试剂〔1〕油浴：加热用油为固体石蜡或者植物油. 〔2〕插试管用的铁丝笼.〔3〕0.2mol/L 硫酸亚铁铵标准溶液 〔即莫氏盐溶液〕：称取 80g<NH 4>2So4•FeSO4•6H20,溶于水中,加入 30mL 6mol/L 的硫酸,用水稀释至 1000mL.标定： 吸取硫酸亚铁铵溶液 10 mL,于 250mL 三角瓶中,加 50mL 水和 10mL6mol/L 硫酸. 用 0. 1mol ／L 高锰酸钾〔1/5 KMn04 〕标准溶液滴定至粉红色.c —— 硫酸亚铁铵标堆溶液浓度,mol/L ；c 1——高锰酸钾<1/5 KMno 4>标准溶液浓度,mol/L;v 1—— 消耗高锰酸钾标准溶液体积,mL.〔4〕重铬酸钾-硫酸溶液：取 200g 研细的重铬酸钾,溶于 250mL 水中,必要时加热使彻底溶 解.冷后稀释至500mL,全部移人 1L 烧杯中.徐徐加入浓硫酸500ML,冷后加水稀释至 1000mL.〔5〕5g/L 邻菲咯啉指示剂：称取 0.5g 硫酸亚铁<FeSO 4 •7H 2O>溶于 100mL 水中,加 2 滴浓硫酸和 0.5g 邻菲咯啉,摇匀,该溶液现配现用. 测定步骤称取风干土样 0.1－0.3g 〔准确至 0.001g 〕,放入 18mm ×160mm 硬质试管中,准确加入重 铬酸钾—硫酸溶液 10mL,将试管插人预先加热至 185－190℃的油浴中<用铁丝笼固定试管>. 此时温度下降到 170－180℃,调节热源,保持此温度.当试管内容物被面开始滚动或者有较大气泡发生时,开始计时,沸腾5min.取出冷却后把试管内容物全部转移人250mL 三角瓶,用水洗净.试管,洗液并入三角瓶内,总体积为50 一60mL.摘入2—3 滴邻菲咯啉指示剂,用0.2mol/L 硫酸亚铁铵标准溶液滴定,颜色由橙红变绿,最后呈从紫色为终点. 同时做空白试验.计算x －－干土中腐殖质含量,％；V0—－空白试验消耗硫酸亚铁铵标准溶液体积,mL;v —－测定试样消耗硫酸亚铁铵标准溶液体积,mL;c —－硫酸亚铁铵标准溶液浓度,mol/L;0.003 －一消耗1mL1mol/L 硫酸亚铁铁标;准溶液相当于碳的克数；1.1—－氧化校正系数；1.724—－土壤中有机质含;碳58％,将有机碳换算成有机质的系数<100/58＝1．724>;m 一－风干土试样质量;w 一－风干土水分, ％.仪器显微镜血球计数板.震荡器.其它稀释取量仪器和盛装仪器[方法和步骤]总菌计数法<1>计数样品：称窖泥1g 于盛有99mL 无菌水或者无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中. <2>摇匀；振荡10~20min,使土样中的菌体、芽孢或者孢子均匀分散.<3>稀释：将待测茵液作一定比例的稀释. 〔通常为1 ：100 或者1 ：1000 严格按无菌操作〕<4>检查计数板：在正式计数前先用显微镜检查计数板的计数室,看其是否沾有杂质或者干涸着的曲体,若有污物则需作以下几步清洗：1>擦洗：用药棉蘸取95%酒精轻轻擦洗计数扳的计数室.2>冲洗：用蒸馏水冲洗计数板,并用毛边纸吸干其上的水分<注意：切勿用火焰来烤干>；最后用擦镜纸揩干净.3>镜检：镜检清洗后的计数板,直至计数室无污物时才可用于样品的计数.<5>加样：先将盖玻片安放在计数室上面,然后用接种环取一环均匀的菌体悬液,使它沿着盖玻片和计数板间的缝隙渗入计数室.连续二至三次,直至充满计数室平台为止：<6>计数：持加好样品的计数板只于显微镜,然后按下列步骤寻觅计数室并计数之1>找计数室：先在低倍镜下寻觅计数极上的慷慨格然后顺慷慨格挪移计数板,使计数室位于视野中间.2>转换高倍镜：转高倍镜后,适当调令光壳度,使菌休和计数室线条均清晰为止,然后将计数室一角的中格移至视野中.3>计数通常以计五个中格<做5 个板求平均减少误差〕的数值来代表计数室中的含菌量.将凡要计数的中格中的菌休逐一计数.计数时为了避重复或者遗漏常将分布在方格线上的菌体一律.以接触方格底线和右侧线上的茵作为计入本格内的茵数. 同时对于出芽的菌体常以芽体和母体同等大小时才按两个茵体计数, 以减少人为计数误差.将计得的菌体数一一记录.<7>清洗：计数完毕后,计数板先用95％酒精轻轻擦洗,再用蒸馏水淋洗,然后吸干.[计算]按所用计数板规格16*25 型或者25*16 型有所不同.菌数/mL=X*16 〔或者25〕*10000*稀释倍数<X 为5 个中室的平均数〕再按制得的样品总量而求得总菌数总数=菌数/mL*样品量〔mL>原理根据芽孢可在广泛的温度〔即热抗性〕、pH、渗透压下生长特点,对窖泥中芽孢进行分离和检测的.首先通过升温〔80－100℃〕热处理〔10~30min〕来除去非检测菌.这种处理几乎破坏了所有的细菌和营养体而芽孢得以存活,而芽孢可以在适宜的培养基中萌芽并生长.仪器与试剂〔1〕传统的微生物检测方法需在培养基中把单个菌培养成可见菌落,然后经长期培养和鉴定.目前乳品厂对芽孢杆菌的检测是根据芽孢可在广泛的温度<即热抗性> 、pH、渗透压下生长特点,对乳和乳制品中芽孢进行分离和检测的.首先通过升温<80- 100~C>热处理<10~ 30Inin>来除去非检测菌.这种处理几乎破坏了所有的细菌和营养体而芽孢得以存活.通过这种方式激活的芽孢再在适宜的培养基中萌芽并生长.传统上这种培养基加淀粉以吸收抑制物<乳中大多芽孢杆菌<86％>能水解淀粉,从而促进激活的芽孢萌芽.培养基再在30℃培养3d 或者37℃2d 计嗜温菌数,55℃ 2-3d 计嗜热菌数.这种传统方法操做繁琐, 时间长72h,并需对操作人员进行严格的训练.检测结果存在滞后性, 已难适应工化生产.。
泸州老窖不同窖龄窖泥产酸细菌的分离鉴定与产酸产酯能力分析
泸州老窖不同窖龄窖泥产酸细菌的分离鉴定与产酸产酯能力分析泸州老窖,久享盛名,有“浓香鼻祖,酒中泰斗”之称,是我国十大名酒之一。
在传统固态白酒产酯生香历程中,窖泥是孕育酿酒微生物的巨大宝库,是白酒风味酝酿的根蒂。
不同种类、数量的窖泥微生物,其种间相互作用及代谢产物不同,这直接影响着浓香型白酒特征风味物质形成的丰富性。
浓香型白酒的主体酸成分中,乙酸、内酸、丁酸及已酸均由窖泥主要产酸细菌产生,其中已酸可与大曲发酵产生的酒精生成已酸乙酯——是浓香型白酒的主体香成分。
在一定程度上,已酸菌和窖泥共同决定着浓香型白酒的质量与风格。
因此,研究泸州老窖不同窖龄窖泥产酸细菌的多样性具有重要意义。
本研究中,从泸州老窖不同窖龄的不同位置采集窖泥样品共8份,分离纯化获得产已酸细菌,测定其形态学特征及产酸能力,并利用BOXAIR-PCR、16S rDNA PCR-RFLP和16SrDNA序列分析研究其遗传多样性和系统发育特征;进而采用形态学方法与GC-MS方法对高产菌株LZ104、LZ802的生理生化特性和代谢产物进行了初步研究。
主要取得了以下结果:(1)从窖泥样品中共分离筛选获得43株供试细菌。
其菌落形态特征:圆形,白色或黄色,不透明,湿润,中心凸起,后期菌落四周褶皱。
镜检结果以鼓槌状、梭状短杆和细长杆菌为主,排列整齐;大多数菌株革兰氏染色阳性。
(2)采用硫酸铜法定性测定了供试菌株的产已酸能力,结果表明,供试菌株发酵液加入硫酸铜溶液后,呈现分层现象并产生絮状沉淀,且醚层变蓝,供试的43株细菌均具有产已酸能力,但产已酸能力存在差异。
菌株LZ104产酸能力最强,菌株LZ602产酸能力最弱。
(3)BOXAIR-PCR聚类结果表明,供试菌株间存在着明显的遗传多样性,所有菌株在64%相似性水平处聚为一群;在82.2%相似水平处,供试菌株被分为8个BOX遗传群。
菌株LZ710单独成群;最大的遗传菌为群Ⅰ,由17株供试菌株组成;其次为遗传菌群Ⅲ和Ⅳ,分别由7个和6个菌株组成。
(完整word版)菌种筛选方法
菌种筛选方法在实际工作中,为了提高筛选效率,往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。
初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网.因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。
初筛的手段应尽可能快速、简单。
复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主,应精确测定每个菌株的生产指标，测得的数据要能够反映将来的生产水平。
1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。
尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化.当然，这种鉴别方法只能用于初筛。
有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母（Eremothecium ashbyii）的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株;色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。
又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉（Penicillium urticae）的育种中,曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。
2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应,将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的"形态"变化.具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图5.6。
1。
这些方法较粗放,一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。
它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养,尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别,有时会造成两者的结果不一致。
图5。
6.1 平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散,形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。
泥坑浓香型白酒窖泥中微生物群落结构与多样性分析
摘要本文采用Illumina PE250测序法对浓香型新窖泥、老窖泥和品质较好的老窖泥中微生物群落结构与多样性进行研究。
结果表明:从门水平结构分析,厚壁菌门与子囊菌门分别为浓香型白酒窖泥的优势细菌与优势真菌;从属水平结构上分析,新窖泥的优势菌属是乳酸菌属,优势真菌属是单端孢属;老窖泥与品质较好的老窖泥优势菌属是乳酸菌属,优势真菌属是青霉属。
不同窖龄、不同质量的窖泥微生物结构多样性具有显著差异。
关键词浓香型白酒;窖泥;微生物多样性;结构组成中图分类号TS201.3文献标识码A 文章编号1007-5739(2021)03-0203-04DOI :10.3969/j.issn.1007-5739.2021.03.078开放科学(资源服务)标识码(OSID ):Microbial Community Structure and Diversity in Luzhou-flavor Liquor Cellar MudLIANG Huan 1XU Changfeng 2*TANG Weibin 2REN Yueming 2ZHU Lining 3(1School of Biological Science and Engineering,Hebei University of Economics and Business,Shijiazhuang Hebei 050200;2School of Biological Science and Engineering,Xingtai University,Xingtai Hebei 054001;3Hebei Fenglaiyi Wine Co.,Ltd.,Ningjin Hebei 055550)Abstract In this paper,Illumina PE250sequencing method was used to study the microbial community structure and diversity in Luzhou-flavor new cellar mud,old cellar mud and good quality old cellar mud.The results showed that,from the perspective of phyla level,Firmicutes and Ascomycetes were the dominant bacteria and fungi in luzhou-flavor liquor cellar mud respectively;the dominant bacteria were Lactobacillus and the dominant fungi were Trichothecene in the new cellar mud from the analysis of the genus level.The dominant bacteria was Lactobacillus and the dominant fungi was Penicillium in the old cellar mud and good quality old cellar mud.There were significant differences in microbial structure diversity of pit mud with different ages and qualities.Keywords Luzhou-flavor liquor;cellar mud;microbial diversity;structural composition泥坑浓香型白酒窖泥中微生物群落结构与多样性分析梁欢1许长峰2*唐伟斌2任月明2朱立宁3(1河北经贸大学生物科学与工程学院,河北石家庄050200;2邢台学院生物科学与工程学院,河北邢台054001;3河北凤来仪酒业有限公司,河北宁晋055550)浓香型白酒具有独特的酿造工艺,混有特殊的窖香风味,深受人们喜爱[1]。
浓香型白酒窖泥的培养
浓香型白酒窖泥的培养费立发;李萌;杨杰;庄建成;苗西印;董晓龙【摘要】对浓香型白酒窖泥的具体培养过程、指标测定结果及注意事项进行了论述.浓香型白酒窖泥的培养从己酸菌选育开始,经过逐级扩大培养后进行窖泥制备,入池发酵后对其各项指标进行检测.结果表明,此工艺条件下制备的窖泥,各项指标均符合标准要求,且活菌数能够达到7.15×106个/g.【期刊名称】《食品工程》【年(卷),期】2017(000)001【总页数】3页(P28-30)【关键词】浓香型白酒;窖泥;己酸菌;培养【作者】费立发;李萌;杨杰;庄建成;苗西印;董晓龙【作者单位】河北沧州东塑集团御河酒业,河北沧州061000;河北沧州东塑集团御河酒业,河北沧州061000;河北沧州东塑集团御河酒业,河北沧州061000;河北沧州东塑集团御河酒业,河北沧州061000;河北沧州东塑集团御河酒业,河北沧州061000;河北沧州东塑集团御河酒业,河北沧州061000【正文语种】中文【中图分类】TS262.3生产浓香型白酒，窖泥是基础，大曲是动力，工艺是关键。
做浓香型优质酒，首先要抓好窖泥的质量，窖泥的好坏直接决定着酒质的优劣。
因为窖泥是己酸菌、甲烷菌、丁酸菌等各种有益微生物的载体和栖息场所，也是它们繁殖的温床，这些有益微生物的种类和数量的多少是衡量窖泥的一个标准。
浓香型大曲酒的主体香味物质是己酸乙酯，而己酸乙酯是由窖泥中梭状芽孢杆菌（己酸菌）等各种生香产酯微生物的代谢产物，因此没有好的窖泥，就不能生产出上乘的浓香型优质酒。
千年老窖出好酒就是这个道理。
本文主要对浓香型白酒窖泥的具体培养过程及注意事项进行了描述。
菌种经过分离、筛选、纯化培养后，选育产己酸能力较强、活力较强的梭状芽孢杆菌。
培养基配方：K2HPO40.04%，（NH4）2SO40.05%，酵母膏0.1%，CH3COONa 0.5%，MgSO4 0.02%，CaCO31%，95%酒精2%，PH值大于4.5。
白酒窖泥新菌种的筛选新方法
Abundance of taxa %
60 50 40 30 20 10 0
低年份 窖池
高年份 窖池
低年份与高年份窖池窖泥细菌“属”水平分类丰度图
老熟与老化窖泥微生物丰度分析（qPCR）
不同酒厂不同性质窖泥表征微生物的qPCR结果
A值 • 研究成果—窖泥群落结构解析 (qPCR ) 窖泥 copy数 拟杆菌门copy 数 厚壁菌门 酒厂 氨基酸杆菌属copy数 样品
窖泥微生物的分离培养与筛选
基于传统分离培养技术筛选窖泥中特定微生物菌落
细菌
细菌
霉菌
放线菌
酵母菌
放线菌
窖泥特定功能微生物菌种的筛选
基于16S rDNA克隆技术、DGGE分析与厌氧培养技术结合。
窖泥特定功能微生物菌种的筛选
采用厌氧培养技术与菌落原位杂交技术（斑点杂交技术）对窖泥中的特征 菌Clostridiaceae 1进行分离筛选获得Clostridium kluyveri 14。
常规筛选方法及依据
菌落形态
筛选一般常见菌种
生理生化特征
错判、漏判
复杂环境微生物体系
无法有目的性 筛选新菌种
基于分子生物学技术的窖泥微生物的筛选
• 窖泥潜在新细菌菌种的筛选方法
培养方法
筛选 分离 纯化
免培养方法
PCR扩增 16S rDNA克隆 基因测序 DGGE分析
基于分子生物学技术的窖泥微生物的筛选
窖泥微生态理论及其营养因子对活性窖泥制备的促进
基于免培养技术的窖泥微生物区系的系统研究及大量 未培养菌种的发现 优势菌、特征菌的分类鉴定及窖泥性状的分子生物学 描述 免培育技术指导下的功能菌筛选、分类鉴定及窖泥强 化应用 分子生物学技术
浓香型白酒窖泥中梭菌群落多样性与窖泥质量关联性研究
浓香型白酒窖泥中梭菌群落多样性与窖泥质量关联性研究一、本文概述白酒，作为中国独特的传统酒类产品，其酿造过程中涉及到众多复杂的微生物群落。
其中，窖泥作为白酒发酵的重要载体，其微生物群落的结构和多样性对于白酒的质量和风味具有重要影响。
在浓香型白酒的生产过程中，梭菌群落是窖泥微生物群落的重要组成部分，其多样性与窖泥质量之间的关系研究，对于提高浓香型白酒的生产效率和产品质量具有重要意义。
本文旨在深入研究浓香型白酒窖泥中梭菌群落的多样性，以及其与窖泥质量之间的关联性。
通过对不同窖泥样品中梭菌群落的分析，揭示梭菌群落多样性对窖泥质量的影响机制，为优化浓香型白酒的生产工艺和提高产品质量提供理论支持和实践指导。
研究内容包括窖泥样品的采集和预处理、梭菌群落的分子生物学鉴定、群落多样性分析、以及梭菌群落多样性与窖泥质量之间的相关性分析等。
采用现代分子生物学技术，如高通量测序和生物信息学分析，对窖泥中的梭菌群落进行全面、系统的研究。
通过本文的研究，有望为浓香型白酒的生产提供新的理论依据和技术支持，推动白酒产业的可持续发展。
对于深入理解白酒酿造过程中的微生物生态学原理，也具有重要的科学价值。
二、材料与方法选择位于不同地理位置、具有不同酿造历史和风格的多个浓香型白酒窖池，在窖池的不同深度（表层、中层、深层）采集窖泥样品。
采样过程中确保窖泥样品不受到外界污染，如雨水、尘土等。
使用的主要试剂包括DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒、梭菌特异性引物等。
主要仪器包括离心机、PCR仪、凝胶成像系统、高通量测序仪等。
将采集的窖泥样品进行冷冻干燥，研磨成粉末状，并过筛去除大颗粒杂质。
然后按照DNA提取试剂盒的说明提取窖泥中的微生物总DNA。
使用梭菌特异性引物对提取的DNA进行PCR扩增，扩增产物经过纯化后，利用高通量测序仪进行测序。
测序数据经过质量控制和拼接后，得到每个样品的梭菌群落信息。
利用生物信息学软件对测序数据进行分析，包括OTU聚类、物种注释、群落结构分析等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根Biblioteka 白酒窖泥新菌种的筛选 新方法
6、纪律是自由的第一条件。——黑格 尔 7、纪律是集体的面貌，集体的声音， 集体的 动作， 集体的 表情， 集体的 信念。 ——马 卡连柯
8、我们现在必须完全保持党的纪律， 否则一 切都会 陷入污 泥中。 ——马 克思 9、学校没有纪律便如磨坊没有水。— —夸美 纽斯
10、一个人应该：活泼而守纪律，天 真而不 幼稚， 勇敢而 鲁莽， 倔强而 有原则 ，热情 而不冲 动，乐 观而不 盲目。 ——马 克思