药品微生物限度检查法汇总
中国药品检验标准操作规程微生物限度检查法
微生物限度检查法一、细菌、霉菌和酵母菌计数１简述细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。
也是用于评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者的卫生状况的重要手段和依据细菌、霉菌和酵母菌计数均采用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法之一，也是目前国际上许多国家常用的一种方法。
以在琼脂平板上的细菌、霉菌和酵母菌形成一个独立可见的菌落为计数依据。
该法测定结果只反映在该规定条件下所生长的细菌（为一群嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。
不包括对营养、氧气、温度、pH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。
一个细菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成。
因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位数（colony forming unity，cfu），不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。
2 设备、仪器2.1 设备2.1.1 洁净实验室微生物限度检查应有单独的洁净实验室，每个洁净实验室应有独立的净化空气系统。
2.1.1.1 结构和要求洁净实验室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。
操作间与缓冲间之间应有样品传递舱，出入操作间和缓冲间的门不应直对。
洁净实验室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。
墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。
操作间内不应安装下水道。
洁净实验室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300LX。
2.1.1.2 温度、湿度洁净实验室内的温度应控制在18～26℃，相对湿度最好在40％～60％。
2.1.1.3 操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。
洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于10Pa，操作间与缓冲间也应保持相对正压，不低于5Pa。
操作台上备有药物天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。
微生物限度检查法
中华人民共和国药典2000版二部微生物限度检查法附录Ⅺ J 微生物限度检查法微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。
供试品应随机抽样。
一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。
检查的全过程，均应严格遵守无菌操作，严防再污染。
除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25 ～28℃，控制菌培养温度为36℃±1℃。
检验结果的报告以1g、1ml或10cm<2>为单位。
培养基及其制备方法除另有规定外，培养基制备的灭菌条件为121℃20分钟。
1.营养琼脂培养基与营养肉汤培养基见无菌检查法（附录Ⅺ H）2.玫瑰红钠琼脂培养基胨 5g 玫瑰红钠 0.0133g葡萄糖 10g 琼脂 15～20g磷酸二氢钾 1g 水 1000ml硫酸镁 0.5g除葡萄糖、玫瑰红钠外，取上述成分，混合，加热溶化后，滤过，加入葡萄糖、玫瑰红钠，分装，灭菌。
3.酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)胨 10g 琼脂 15～20g酵母浸出粉 5g 水 1000ml葡萄糖 20g除葡萄糖外，取上述成分，混合，加热溶化后，滤过，加入葡萄糖，分装，灭菌。
4.胆盐乳糖培养基(BL)胨 20g 磷酸二氢钾 1.3g乳糖 5g 牛胆盐 1.3g氯化钠 5g （或去氧胆酸钠0.5g）磷酸氢二钾 4.0g 水 1000ml除乳糖、牛胆盐外,取上述成分，混合,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2, 煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐，分装，灭菌。
5.曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)营养琼脂培养基 100ml 曙红钠指示液 2ml20％乳糖溶液5ml 亚甲蓝指示液 1.3～1.6ml 取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃,按无菌操作加入灭菌的其他3种溶液, 摇匀，倾注平皿。
6.麦康凯琼脂培养基(MacC)胨 20g 1％中性红指示液 3ml乳糖 10g 琼脂 15～20g牛胆盐 5g 水 1000ml氯化钠 5g除乳糖、指示液、牛胆盐及琼脂外,取上述成分，混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌,冷至60℃，倾注平皿。
微生物限度检查
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（2）控制菌检查：测定单位重量（体积或面 积）药品中的粪便污染指示菌和某些特定 菌，如大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄 球菌、铜绿假单胞菌、梭菌、白色念珠菌、 螨等在规定量的样品中不得检出或不超过 某限度。 对于大肠菌群，采用系列稀释级供试 液，分别定量加置规定数量的试管中，经 培养后记录出现产酸或产气的管数，按最 近似数（MPN）对染菌量做出定量估计。
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二、药品微生物限度检查的特殊性和基 本条件
1、药品微生物限度检查的特殊性
（1） 活体细胞 （2）分布不匀 （3）多数处于受损状态 （4）生境复杂
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（1） 活体细胞 药品微生物限度检查以活体菌细胞为
对象，污染菌在药品中处于不稳定状态， 可随存放时间延长而死亡，也可在适宜条 件下大量繁殖。药品还可因为本身性质， 存放温、湿度，暴露空气等状态不一，污 染菌发生变化导致检出结果的差异.
对于非规定灭菌药品，包括常用的口服制剂与局 部外用制剂。对这一部分制剂一般不要求绝对无 菌，允许在规定量的样品中，检出一定限量的微 生物，但不得检出某些控制菌。通常药品微生物 限度检查的检验对象多为此类药物。
此外，与药品质量密切相关的还有辅料、包装材料以 及生产环境的检测和医用材料、器械等也都制定了相 应的微生物学限度指标。
应进行复试。 我国药典规定，对菌落数测定当一
次检查不合格时，应从同一批样品中随 机抽样，独立复试两次，以三次检查结 果的平均值报告菌数，这是对染菌处在 合格边缘数的产品，避免由此引起可能 的争议采取的一种界定方法。
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2.控制菌报告及复试
04微生物限度检查方法薄膜过滤法验证方案
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理1.1验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
1.2原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤2.1验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于4.9pa。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
【2020版中国药典】通则-非无菌微生物限度检查
【2020版中国药典】通则-非无菌微生物限度检查1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
学习：将旧版的“相应”更换为“规定”，更便于按照1107进行判定执行。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
洁净空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
学习：将旧版的“单向流空气区域”更换为“洁净空气区域”。
计数方法
……供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
……
提示：后文增加了对于“贵重药品、微量包装药品”的检验量的更全面的表述，因注意结合此处的要求。
计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验
……菌液制备……取黑曲霉的新鲜培养物加人适量含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或……
学习：此处改动同无菌检查法，将“3~5ml”的具体量调整为“适量”，便于根据孢子的量灵活掌握菌液制备方法。
培养基适用性检查
微生物计数用的商品化的预制培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
学习：类似于无菌检查法，此处将“成品培养基”修改为“商品。
微生物限度检查法名词解释(一)
微生物限度检查法名词解释(一)微生物限度检查法1. 介绍微生物限度检查法（Microbiological Limit Test）是用于评价药品、食品和化妆品等产品中微生物质量的检验方法。
它能够确定样品中是否存在对人体有害的微生物，并对其数量进行定量评估。
2. 相关名词以下是与微生物限度检查法相关的一些常见名词：•微生物限度：指产品中允许存在的微生物或菌群的数量上限。
不同产品类型有不同的微生物限度标准，例如菌落数、霉菌数和大肠菌群数等。
–例如，某药品的微生物限度为每克不超过10个细菌。
•菌落总数：指在特定培养基上，某一样品中培养出的微生物菌落的总数。
–例如，通过菌落总数检验，发现某食品样品中每克菌落总数为100个。
•霉菌数：指在特定培养基上，某一样品中培养出的霉菌菌落的数量。
–例如，某化妆品样品中每克霉菌数为5个。
•大肠菌群数：指在特定培养基上，某一样品中培养出的大肠菌群的数量。
–例如，某食品样品中每克大肠菌群数为0。
3. 检验流程微生物限度检查法的具体流程包括以下几个步骤：1.样品准备：从被检测产品中取样，按照一定的方法进行样品的准备和处理，以便进行后续分析。
2.菌落计数：将样品分别接种在适当的培养基上，并在一定的条件下孵育。
孵育结束后，利用显微镜和计数板等设备，对培养出的微生物菌落进行计数和记录。
3.菌种鉴定：根据菌落的形态、生理特性和生化反应等，对菌落进行鉴定，以确定菌落的种类和数量。
4.结果评价：根据相关的微生物限度标准，将检测结果与标准进行比较，评价样品是否符合质量要求。
5.结果记录：将检测数据和结果进行记录，并生成相应的报告。
4. 应用领域微生物限度检查法广泛应用于以下领域：•药品：验证药品是否符合微生物限度，确保药品的安全和有效性。
•食品：检测食品中是否存在致病菌乃至变质微生物，保障食品的卫生和质量。
•化妆品：评价化妆品中的细菌、霉菌等微生物是否超过限度，确保产品的质量和安全性。
以上就是关于微生物限度检查法的相关名词和解释，以及检验流程和应用领域的简要介绍。
中国药典2020微生物限度检查
中国药典2020微生物限度检查
中国药典2020的微生物限度检查是一项严格的检查标准，用
于评估药物及相关产品中微生物污染的程度。
根据中国药典2020的要求，药品和相关产品在销售前必须经过微生物限度
检查，以确保其质量和安全性。
微生物限度检查包括检测制备过程中是否存在微生物污染、产品使用后是否易受微生物感染等方面。
根据不同的药品性质和用途，微生物限度检查可以涵盖不同的微生物指标，如细菌、真菌、酵母菌等。
中国药典2020中关于微生物限度检查的要求包括样品采集、
检验方法、标准和评估等方面。
具体的检验方法和标准根据不同的药品类别和用途而有所不同，例如，口服药品、注射剂、眼用制剂等都有各自的微生物限度标准。
微生物限度检查的目的是为了确保药品及相关产品无微生物污染或其污染水平在规定范围内，以保证使用者的安全。
在药品生产和销售过程中，严格遵守微生物限度检查的标准是非常重要的，以避免因微生物污染引发的健康问题。
需要注意的是，微生物限度检查只是药品质量控制的一部分，其他重要的质量控制措施还包括化学成分分析、物理性质检查、稳定性评估等。
所有这些质量控制步骤的目标是确保药品的质量和安全性，以满足患者的需要。
微生物限度检查
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对于其它控制菌，通常是将制备好 的供试液，按照待检菌的特性取规定 量直接接种于培养基或经薄膜过滤法 处理后接种于培养基，分别进行增菌、 分离培养，在获得单个疑似菌株培养 物的基础上作形态学、生化及血清学 鉴定。
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四、检验结果报告及复试
1. 细菌、霉菌及酵母菌数报告及复试
细菌、霉菌及酵母菌数，一般以每1g、 lml 或l0cm2菌落形成单位数（colony forming nints, cfu）报告，特殊药品可 以最小包装单位报告。
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（2）培养基的pH值
培养基的pH值应符合规定，否则必需
校正。调节培养基pH值，使其高于规定值 的0.2，灭菌后可达到规定的pH值，测定时 溶液温度应为20～25℃，调节PH值可用 1mol/L氢氧化钠溶液、1mol/L盐酸溶液。 分装好的培养基应及时密封, 必须在配制 后2小时内进行灭菌处理。
药品中染菌数量愈高，其中所含致病 菌的几率愈高，这是造成药源性感染疾病 的直接原因。 药品染菌还可使其产生霉变、酸败等 理化性质改变造成药品失效、变质，甚至 产生毒素，危害使用者的健康。 为保证药品质量，必须对微生物污染进 行必要的控制和检验。
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（2）药品染菌反映药品生产工艺的科学 性、合理性及质量管理水平。
1、药品微生物限度检查的特殊性
（1） 活体细胞 （2）分布不匀 （3）多数处于受损状态 （4）生境复杂
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（1） 活体细胞
药品微生物限度检查以活体菌细胞为 对象，污染菌在药品中处于不稳定状态， 可随存放时间延长而死亡，也可在适宜条 件下大量繁殖。药品还可因为本身性质， 存放温、湿度，暴露空气等状态不一，污 染菌发生变化导致检出结果的差异. 由于检验对象的这种活体特征，保持 供检样品污染菌尚存活而又不大量增殖尤 为重要。
药品微生物限度检查方法介绍
（北京市药品检验所 戴红）
1
无菌室的质量管理 药品的微生物限度检查 药品的无菌检查
2
无菌室的要求
位置选择 面积大小 洁净度 采光 紫外杀菌 门 人流物流 地面墙面
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无菌室的管理
陈设尽量简单，仅放置必需用的仪器设备 无菌室应每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭擦拭操作台及可能污
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供试液的制备（4）
非水溶液性供试品 软膏剂、乳膏剂、称供试品5g（5ml），加到 含已灭菌溶化并45℃保温的乳化剂的烧杯中，用无菌玻棒搅拌混 匀后，慢慢加入45℃左右的稀释剂85ml，边加边搅拌，使供试品 充分乳化，作供试液（1:20）。
油剂取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯—80 5 –8ml，摇匀，再加 入稀释剂至100ml。
砷、汞类 100ml硫乙醇酸盐培养基 洗必泰类 100ml增菌液中加适量的聚山梨酸80等表面活性剂 沉降法：自然沉降5min，取上层液置100ml增菌液中
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供试液的稀释（10倍递增稀释法）
10g 1ml 1ml
100ml 10ml 10ml
1:10 1:100 1:1000
至少3个稀释级，每递增1个稀释级，必须更换吸管。
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洁净度的要求
应在环境洁净度10000级局部洁净度100 级的单向流空气区域内进行。检验全过程必 须无菌。
工作台面及环境应定期按《医药工业洁 净室（区）悬浮粒子、浮游 菌和沉降菌的 测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
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尘埃粒子
洁净级别
尘粒数/m3
≥0.5um ≥5um
100级
染的死角，室内无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1小时。 人员：肥皂洗手， 0.1%新洁尔灭洗手，换无菌服、鞋，进入。 操作必须符合无菌要求，穿好无菌服后，不能反复出入无菌间，
微生物限度检查法-药典附录
微生物限度检查法微生物限度检查法（2005年版一部）附录ⅩⅢC. 微生物限度检查法微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌素、酵母菌数及控制菌检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。
除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25～28℃，控制菌培养温度为36℃±1℃。
检验结果的报告以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告。
检验量检验量即一次试验所用的供试品（g、ml 或cm2>）。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；中药膜剂为50 cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
要求检查沙门菌的供试品，其检验应增加10g或10ml。
检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。
供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，可采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。
1.液体供试品取供试品10ml，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。
油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2.固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：10的供试液。