植物生物技术-转基因植物的分子及检测及安全评定 (2)
遗传修饰与转基因生物的风险评估
遗传修饰与转基因生物的风险评估遗传修饰与转基因生物（Genetically Modified Organisms, GMOs）在当今农业领域扮演着重要的角色。
然而，伴随着其广泛的应用，许多人担心这些技术可能带来的风险。
因此，对遗传修饰与转基因生物的风险评估变得尤为重要。
本文将探讨遗传修饰的相关概念、转基因生物的安全性评估方法以及面临的挑战。
一、遗传修饰的概念与应用遗传修饰是指利用生物技术手段对生物体的基因组进行改变，使其具有新的性状或者提高现有性状的能力。
这种技术在农业领域被广泛应用，旨在提高作物的产量、抗病性和耐逆性。
转基因生物则是通过遗传修饰技术获得的生物体。
它们的基因组中插入了来自其他物种的外源基因，使其具备了特定的性状，如抗虫、抗草剂或抗病能力。
二、转基因生物的安全性评估方法为了确保转基因生物在环境中和食品链中的安全，科学家们开发了一套严格的安全性评估方法。
这些评估方法通常包括以下几个方面：1. 基本信息评估：对转基因生物进行基本特征描述和目标性状确认，对其基因稳定性也进行评估。
2. 比较与相似性评估：将转基因生物与其近缘物种进行比较，评估其是否存在重要的生物学、生态学或化学差异。
3. 潜在风险预测：评估转基因生物在环境中的表现、传播和生态影响，特别关注其可能的不良后果。
4. 风险管理评估：根据潜在风险预测的结果，制定相应的风险管理策略，以确保转基因生物的安全性。
三、转基因生物风险评估的挑战尽管转基因生物的安全性评估方法已经相对成熟，但仍然面临一些挑战。
首先，由于转基因生物与自然种群的相互作用复杂多样，确切评估其在大规模应用中的潜在影响非常困难。
其次，不同的转基因生物可能有不同的潜在风险，因此评估安全性需要针对每种转基因生物进行具体分析。
此外，转基因生物的长期影响和遗传漂变等问题也是评估的难点，需要密切监测并进行持续研究。
最后，公众对转基因生物存在着广泛的疑虑，社会舆论的影响也给风险评估带来了一定的挑战。
转基因生物及其产品食用安全检测
4.22TBST1缓冲液：在500 mL TBS缓冲液中，加入250µL吐温20（Tween20），用磁力搅拌器混匀。
4.6稳定对照蛋白溶液：
模拟胃液消化稳定对照蛋白溶液：选用牛β-乳球蛋白B（BLG）或大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor，STI）作为模拟胃液消化稳定对照。
模拟肠液消化稳定对照样品溶液：选用牛血清白蛋白（BSA）或大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）作为模拟肠液消化稳定对照。
重蒸馏水
3.4
300 g/L丙烯酰胺储液（Acr/Bis）
0.83
浓缩胶缓冲液
0.63
100 g/L十二烷基磺酸钠（SDS）
0.05
100 g/L过硫酸铵（AP）
0.05
N,N,N',N'-四甲基二乙胺（TEMED）
0.005
总体积
5
4.31 PVDF转印膜。
4.32 滤纸。
5仪器
5.1 恒温水浴(温度波动范围：0.1℃)。
2.5
不稳定对照蛋白 labile control protein
为确认模拟消化体系正常工作而选取的在模拟胃
3原理
根据人体胃/肠消化液的主要成分及消化环境，在体外建立模拟胃/肠消化体系，将转基因生物及其产品中外源基因表达的蛋白质在该体系中进行消化，对不同消化时间的样品进行蛋白电泳和蛋白印迹，确定该蛋白在模拟胃液和模拟肠液中被消化的时间，推断转基因生物及其产品中外源基因表达的蛋白质在模拟人体胃/肠消化过程中的稳定性。
转基因食品安全性评价原则
转基因食品安全性评价原则转基因食物安全性评价原则是国际上普遍采用的一般性食品安全性评价原则，简单来说，这是为了确保转基因食品安全，以确保公众健康卫生而采取的一系列评估原则。
转基因食品安全性评价原则主要包括了种子来源的确定，转基因体的确定，新基因产物的评估和新蛋白质的评估，最后的存货和非存货产物的评估要求。
首先，种子来源的确定是转基因食品安全性评价原则的重要环节，因为种子本身的品质会直接影响作物的后续可食性和安全性。
为了确定种子的品质，可以将现有的材料识别分析技术应用于营养成分分析、分子生物学分析和基因组学分析等方面。
这种方法可以更加精确地检测种子中的营养成分和基因，从而确定其品质，并确定种子的食用安全性评估要求。
其次是转基因体的确定。
转基因技术可以确定新基因插入到到植物细胞中的植物体，以确定变异植物细胞的基因组定位和功能。
在基因组定位上，可以通过测序、定位和检测技术进行确定以确定植物体中基因插入的精确位置，并确定变异植物中新基因的变异特性。
在新基因上，可以设计和分析转录因子链和转移因子链，以了解新基因在植物细胞中的具体功能。
此外，在新基因产物的评估中，也可以根据已有的生物技术识别技术，对新基因产物的特性和毒性进行评估，以确定其可食性和安全性。
最后，在新蛋白质的评估上，应该通过基因组学的分析及抗原性评价，应用酶联免疫吸附测定（ELISA）和检测技术（Western blot）等技术，以及植物基因组学特性分析来识别和评估新蛋白质对人体不良影响情况。
最后，转基因食品安全性评估原则还需要对最后的存货产物和非存货产物进行评估，通过食用毒理学实验和饮食营养学分析等方式，确定植物表型材料，完整性，变异特性，安全性和有效性等指标，以便确定最终的可食性和安全性。
综上所述，转基因食品安全性评估原则是国际上普遍采用的一般性食品安全性评价原则，涵盖从种子确定、转基因体确定、新基因产物评估、新蛋白质评估和存货非存货产物评估等全方位的考量，以便确保转基因食品的安全性，确保公众的健康并为消费者提供安全的食品。
农业部办公厅关于印发《农业转基因生物（植物、动物、动物用微生物）安全评价指南》的通知
农业部办公厅关于印发《农业转基因生物（植物、动物、动物用微生物）安全评价指南》的通知
文章属性
•【制定机关】农业部(已撤销)
•【公布日期】2017.01.23
•【文号】农办科〔2017〕5号
•【施行日期】2017.01.23
•【效力等级】部门规范性文件
•【时效性】现行有效
•【主题分类】农业科技
正文
农业部办公厅关于印发《农业转基因生物（植物、
动物、动物用微生物）安全评价指南》的通知
农办科〔2017〕5号各有关单位:
为进一步规范农业转基因生物安全评价工作，根据《农业转基因生物安全管理条例》和《农业转基因生物安全评价管理办法》，我部修订了《转基因植物安全评价指南》《动物用转基因微生物安全评价指南》，制定了《转基因动物安全评价指南》，并经2017年农业部第1次常务会议批准，现予印发，请遵照执行。
附件：1.转基因植物安全评价指南
2.转基因动物安全评价指南
3.动物用转基因微生物安全评价指南
农业部办公厅
2017年1月23日。
几种常用植物病原细菌分子检测方法
几种常用植物病原细菌分子检测方法一、几种常用植物病原细菌分子检测方法1.基因扩增技术：基因扩增技术是植物病原细菌的分子检测的一种重要的方法。
它可以通过对植物病原细菌的DNA和RNA进行扩增，从而检测植物病原细菌的特异性基因片段。
具体来说，首先将植物样本中的病原细菌DNA/RNA提取出来，然后使用特定的聚合酶链反应（PCR），在恒温下复制植物病原细菌特异性DNA/RNA片段，最后再进行适当的 DNA 杂交实验，就可以鉴定出病原细菌的特异性DNA片段，从而检测出植物病原细菌。
2.生物信息学分析：生物信息学分析也是一种常用的植物病原细菌分子检测方法。
它可以通过对植物病原细菌的特征基因序列进行分析，从而检测出植物病原细菌的特征基因序列。
具体来说，首先将植物样本中的病原细菌DNA/RNA提取出来，然后通过特定的软件进行序列比对，有效地检索出植物病原细菌的特征基因序列，从而检测出植物病原细菌。
3. 免疫检测：免疫检测是植物病原细菌的分子检测的一种重要的方法，它可以通过检测植物病原细菌的特异性抗原，从而检测出植物病原细菌。
具体来说，首先将植物样本中的病原细菌抗原提取出来，然后使用特定的免疫试剂进行试验，如免疫印迹法（Western Blot），ELISA（Enzyme-linked Immunosorbent Assay）等，从而检测出植物病原细菌的特异性抗原，从而检测出植物病原细菌。
4. 质粒分离技术：质粒分离技术也是一种常用的植物病原细菌分子检测方法，它可以通过检测植物病原细菌的特异性质粒，从而检测出植物病原细菌。
具体来说，首先将植物样本中的病原细菌质粒提取出来，然后使用特定的分离器对质粒进行分离，比如电泳或磁性分离，从而检测出植物病原细菌的特异性质粒，从而检测出植物病原细菌。
总之，上述是几种常用的植物病原细菌分子检测方法，它们都能够有效地检测出植物病原细菌。
不过，在实际应用中，应该根据植物样本的不同特点，选择合适的植物病原细菌分子检测方法，以达到最佳的检测效果。
转基因植物及产品检测技术研究综述
Ｖｏ ４ Ｌ２ Ｎｎ ３
西
南
农
业
学
报
１０ ２３
Ｓ ｕｈ ｅｔ ｈ ａＪｕ ｎ ｌ ｆ ｃ ｌ ｒｌ ｃ ｎ ｅ ｏ ｔｗ ｓ Ｃ ｉ ｏ ｒ ａ ｏ ｎ Ａ ｕｔ ａ Ｓ ｉ ｃｓ ｕ ｅ
文章 编号 ： ０ － ８９ ２ １ ）３—１０ ０ １ １ ４ ２ （０ １ ０ ０ ２３— ６
田间鉴评试 验 ；９ ５年完成 首 例转 基 因植 物产 品安 １９
ｌ 转 基 因植 物及 产 品的 概 念
１ １ 转 基 因植 物 ．
全性评价研究 ； ９ １ ６年转基 因植物产品进入商 品化 ９ 生产 ； ２ １ ， 球 已有 ２ 国家种植 转基 因植 到 ００年 全 ９个 物， 种植面积发展到 了 １４ 亿 ｈ 约 占全球农作 ．８ ｍ， 物种植面积 的 ２ ． ｌ％，５年间增 长了 ８ Ｏ０ １ ７倍… 。 全球 ２ 亿 以上人 口食用 了转基因产品。随着转基 Ｏ
１ ２ 转基 因作 物 ．
究的重要组成部分和转基因植物及产品安全性评价 中身份认定 的基本技 术一 转基 因植物 及产 品检 测技 术不断进步 ， 系统地了解这一技术的研究进展 ， 对转 基 因植 物育种 和安全 性评 价 、 管具有 重要意 义 。 监
转基 因 作 物 （ ｎｔａｙＭｏｉｅ ｒｐ Ｇ ； ｅ Ｇ ｅｉ ｌ ｄｆｄ Ｃｏ ， ＭＣ ｃｌ ｉ Ｔａｓｅｉ Ｃｏ ） 指用 于人工栽 培生 产特 定产 品的 ｒ ｇｎｅ ｒｐ 专 ｎ 转基 因植 物。 目前 ， 基 因植 物 的主 体是 转 基 因 作 转
（ ｕ ｎｎＡ ａ ｅ ｙｏ ｃｌ ｒｌ ｃｅｃｓＹ ｎａ ｕ ｍ ｎ ５ ２ １ Ｃ ｉａ Ｙ ｎａ ｃｄｍ ｆ Ａ ｕｔ ａ ｉ ｅ。 ｕ ｎｎＫ ｎ ｉｇ６ ０３ ， ｈｎ ） ｕ Ｓ ｎ
《转基因生物安全》课件
拓展转基因技术的应用领域
除了农业领域，转基因技术还可以应用于医药、环保、能源等领域。通过技术创新和应用拓展，为人类社会带来更多 福祉。
建立完善的转基因生物技术标准与规范
制定和完善转基因生物技术的标准与规范，确保转基因产品的安全性和可靠性。
探索新型转基因技术及其安全性评估
随着基因编辑技术的发展，未来将有更多新型转基因技术出现。对这些新技术进行安全 性评估，确保其不会对环境和人体健康造成潜在风险。
加强国际合作与交流
转基因生物安全研究是一个全球性的问题，需要各国科学家加强合作与交流，共同推进 相关研究进展。
技术创新与应用
开发更高效、安全的转基因技术
Part
05
转基因生物安全的伦理问题
伦理问题的提
转基因技术对生态环境和人类健康的影响
转基因生物在种植和养殖过程中可能对生态环境和人类健康产生潜在风险，引发伦理争议 。
转基因食品的标识和监管问题
关于转基因食品是否应该标识以及如何监管的问题，引发了关于消费者权益和信息透明的 伦理讨论。
利益分配和公平性问题
社会参与与公众意识
01
提高公众对转基因生物安全的认知
通过科普宣传和教育，提高公众对转基因生物安全的认知，减少误解和
恐慌。
02
加强与利益相关方的沟通和协商
在转基因生物安全问题上，需要与利益相关方进行充分沟通和协商，听
取各方意见，促进众参与机制
通过建立健全的公众参与机制，让公众能够参与到转基因生物安全的研
BT棉花作为抗虫转基因作物，通过基因工程技术表达BT蛋白，有效抵抗棉铃虫的侵害， 但可能对非目标生物产生影响。
转基因大豆安全检测技术探讨
转基因大豆安全检测技术探讨
□ 张宇辰 周 晴 郑 智 盖 森 翟自成 河北农业大学
摘 要：近年来，转基因大豆已成为人们关注的焦点之一，这是因为转基因大豆可能存在安全问题，进而影响人类的 健康，因此转基因大豆在商业化种植前的安全性检测是十分有必要的。本文主要分析转基因大豆可能存在的危害性，并概 括转基因大豆安全检测技术，以期提供参考和借鉴。
[1] 刘 绘 景． 转 基 因 食 品 分 析 检 测 技 术 研 究 进 展 [J]. 食 品 安 全 导 刊 ,2017(3):68.
作 者 简 介： 张 宇 辰（1998—）， 男，河北沧州人ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ本科在读。研究方向： 生物科学。
周 晴（1997—）， 女， 河 北 秦 皇 岛人，本科在读。研究方向：制药工程。
一 般 来 说， 外 源 蛋 白 是 转 基 因 大 豆检测中的重点，运用的检测方法是 免疫学检测法。这种检测因为检测的 外源蛋白质大多具有水溶性，故样品 经过简单的粗提之后就能直接检测， 另外抗体具有高度专一的特性，因此 该方法灵敏度高且使用广泛。目前市 场上常见的免疫检测法较多，例如如 试纸条法、酶联免疫吸附法、“测流”
关键词：转基因大豆；检测技术
1 转基因大豆的安全问题
转基因大豆安全问题主要包括环 境安全和食用性安全两个方面。 1.1 转基因大豆环境安全性问题
① 超 级 杂 草 的 产 生。 通 常 来 说， 常规转基因大豆会因转基因载体携带 某些抗性基因（尤其是抗除草剂基因） 而对除草剂产生抗性，如果这些抗性 基因通过基因漂移而重组到杂草中， 那么杂草的除草剂抗性将会增强，从 而更难消灭。②新病毒或超级病毒的 产生。自然界中，植物与病毒之间能 够进行遗传交流，如若转基因大豆体 内的病毒与抗病毒转基因大豆的 RNA 发生重组，新病毒的产生也并非不可 能 [1]。另一方面，如果其他病毒或病毒 产物与转基因大豆中的病毒发生协同作 用，加速病毒的遗传变异，进而产生新 的具有相应抗性的超级病毒。③对生物 多样性以的影响。转基因技术的出现， 打破了生殖隔离机制，使得外源基因可 以插入重组到不同物种，而这些转基因 作物的遗传信息又可能会重组到近缘野 生种中去，造成基因污染。而转基因大 豆相对于非转基因大豆而言有较大的 优势，在经济效应下，它们能够很快 地进行商业释放，并得到大面积种植， 这无疑会对其他物种的生存造成威胁， 使得物种多样性减少。 1.2 转基因大豆食用安全性问题
植物外源基因转化方法及转化子的检测
3.3 DNA直接导入基因转化
所谓DNA直接导入转化就是不依赖农杆 菌载体和其他生物媒体，将特殊处理的 裸露的DNA直接导入植物细胞，实现基 因转化的技术。常用的DNA直接转化技 术根据其原理可分为化学法和物理法两 大类。
3.3.1化学诱导DNA直接转化
化学诱导DNA直接转化是以原生质体为 受体，借助于特定的化学物诱导DNA直 接导入植物细胞的方法。目前主要有2种 方法：PEG介导法和脂质体介导法。
化学诱导DNA直接转化
物理法诱导DNA直接转化 花粉管通道法介导基因转化（种质系统介导法）
3.1农杆菌介导法
农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方 法。
它是利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti (Tumer induce)质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染植 物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并 插入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的遗传转 化特性,可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可 使外源基因整合到受体染色体而获得稳定的表达。
植物敏感细胞和土壤农杆菌相互作用 土壤农杆菌的毒性区基因被激活 T-DNA的切割和T复合物生成 T复合物由土壤农杆菌经植物细胞膜进入
植物细胞 T-DNA整合到植物染色体上
农杆菌的 活化
挑单克隆
收集细胞
用液体MS培 养基重悬细 胞
将预培养的 外植体放 入菌液中 侵染
取出外植体在
➢脂质体介导基因转化
脂质体法是用脂类化学包裹DNA成球体，通过植物原生质 体的吞噬或融合作用把内含物转入受体细胞。
脂质体是由磷脂组成的膜状结构,用它包装外源DNA分子, 然后与植物原生质体共保温,于是脂质体与原生质体膜结构 之间发生相互作用,而后通过细胞的内吞作用而将外源DNA 导入植物的原生质体
水稻转基因系的分子鉴定方法
水稻转基因系的分子鉴定1．目的1．1从T2不同转基因株后代中鉴定得到分离出的纯转基因株、杂合转基因株和非转基因株，为根系和生理学实验提供材料；1．2鉴定纯转基因株中插入T-DNA的拷贝数和插入方式；1．3鉴定纯转基因株中插入T-DNA的插入位置。
2．材料中华11 （CK）H05系列石狩白毛（CK）E10系列WD17系列3．主要试剂和配方3.1 DNA微量提取微量提取液：200mM Tris-HCl(pH7.5250mM NaCl25mM EDTA0.5% SDS酚/氯仿氯仿无水乙醇、70%乙醇TE缓冲液（pH8.0）10mg/ml RNase3.2 Htp的PCR鉴定Taq酶及Buffer 购自Takara公司dNTPs购自华美公司3.3 植物DNA大量提取抽提液： 1.5%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)75mmol/L Tris-HCl PH8.01M NaCl15mmol/L EDTA沉淀液： 1%CTAB50mmol/L Tris-HCl PH8.010mmol/L EDTA高盐TE: 1mol/L NaCl10mmol/L Tris-HCl PH8.01mmol/L EDTA3．4 Southern杂交Southern杂交液（1×）:20×SSC 250 mL5%SDS 5 mL10%Sarkosyl 10 mLddH2O 735 mLBlocking Reagent 5 g洗脱液(1x)：20x SSC 10 mL5%SDS 40 mLddH2O 950 mL3.5 RNA提取Trizol: 购自Invitragen公司10×MOPS: 80mmol/L NaAc0.2mol/L MOPS10mmol/L EDTA加DEPC处理的水定容，调pH值至7.0 RNA上样混合物：0.25%溴酚兰0.25%二甲苯菁50％甘油1 mmol/L EDT A1.2%甲醛变性胶(100ml)：1.2g grose73ml DEPC水10×MOPBuffer 10 mL2.2M甲醛 6 mL3.6 RT-PCR反转录酶SuperscriptIII试剂盒购自Invitragen公司 PCR所用试剂同前。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
mRNA
cDNA
PCR 产
物
RNA 提取：
逆转录体系： RNA 、缓冲液、 dNTP 、逆转录酶、引物（随机 引物， Oligo dT; 特异引物 )
RT-PCR 体系：特异性引物、 cDNA 模板、 Taq DNA 聚合 酶、 buffer
利用凝胶成像分析仪对电泳结果进行拍照和结果记录； 观察胶上是否有预扩增的主要产物带。对比目的基因产物的
电 泳谱带分子量和谱带的特异性，确定和描述谱带特征。
GhCIPK6 GhUBQ7
（三） 、
Western blot
Western immunoblot analysis of chitinase (chi) gene expression in leaf extract of transgenic cotton lines.
灵敏度高（可检测 1pg 的 DNA 样品），特异性强（可鉴别 20 个碱基的同源序列）是目前坚定外源基因整合最权威 的 方法
二、外源基因表达的检 测
► 基因表达包括转录和翻译两个水平 转录是指以 DNA( 基因 ) 为模板合成 mRNA 的过程 翻译是指以 mRNA 为模板合成蛋白质的过程
► 检测外源基因的表达包括特异 mRNA 和特异蛋白质 检测特异 mRNA 的主要方法是 Northern 杂交和 RTPCR 特异蛋白质表达的检测方法主要有三种 ►① Th化反应检测法 ►② 免疫学检测法： Western 杂交 ►③ Th物学活性的检测
3. 总 DNA 的限制性酶切 选择合适的限制性内切酶
单酶切 酶切反应体系 DNA 5-15ug 体积 20-90ul 检测酶切效果 琼脂糖凝胶分离
4. 凝胶电泳分离各酶切片 段
凝胶厚度 0.5cm 以上 样品及上样量 含分子量质量标准 DNA ，阳性对照，阴性对照 低电压、长时间电泳 1V/CM 电泳 16 小时
第 12 章 转基因植物的分子 检测及安全性评价
本章主要内容
• 第一节 转基因植物的检测 • 第二节 转基因植物的安全性评
价
第 12 章 转基因植物的分子检测 及安全性评价
本章教学目的与要求
► 转基因植物检测方法 ► 人们对转基因安全性的几类问
题
第一节、转基因植物的检测
► 外源基因是否进入受体植物细胞 ► 进入植物细胞的外源基因是否整合到植物染色体上 ► 整合到染色体上的外源基因是否表达 ► 能否产生理想的目的表型
一、外 源 基 因 整 合 状 态 检 测
（一）、 PCR 检测方 法 • 检测报告基因或目的基因 • 快捷、简易、灵敏等优点
1. 引物的设计与合成
2. 模板 DNA 的制备 PCR 对模板 DNA 的质量要求不高，可以直接利用 细胞裂解液，或用快速微量法（ CTAB 或 SDS 法） 制备基因组 DNA
杂交：加入杂交探针， 65° 保温摇床过
夜 洗膜： 2*SSC—0.1*SSC 洗膜
6. 杂交信号的检测
同位素标记的探针通过放射性自显影检测 非同位素探针采用酶反应检测
HR16 HR18 HR19 HR24 HR26 HR30 HR35 HR37 HR38 HR39
YZ1
转基因棉花再Th植株的 Southern 分子杂交图
1. 植物总 DNA 提 取
CTAB: 十六烷基三乙基溴化铵是一种去污剂，可溶解细胞膜，能与 核 酸形成复合物，在低盐溶液中，复合物在溶液中沉淀，在高盐溶液 中 是可溶的，再加入乙醇使核酸沉淀。
SDS 法：高浓度的 SDS 在较高的温度下裂解细胞，高盐低温下沉淀 多 糖及蛋白质，然后用乙醇沉淀 DNA
转基因棉花再生植株的 NPT-Ⅱ 报告基因的 PCR 检测 M ： 1Kb 的分子量标准； P ：质粒； C ：非转基因对照； 1-27 ：转化再生植株
5. PCR 检测的特点：
► 检测迅速 ► 灵敏度高，可以检测到纳克级外源 DNA ► 操作方便，对 DNA 质量要求不高 ► 不足之处在于假阳性偏高、不能提供整合位点的遗传信
（一）、 Northern 杂 交
► Northern 杂交── DNA 和 RNA 分子之间 的 杂交
► 检测目的基因是否转录出 mRNA 的方法
（二） RT-PCR
原理： RNA 的多聚酶反应（ RT-PCR ）是以 mRNA 为模板进行逆转 录 反应（ reverse transcription ， RT ） 与 PCR ，可用于检测 单个 细胞或少数细胞中少于 10 个拷贝的 RNA 模板。
要有阴性对照和阳性对照
3. 反应体系与循环参 反应体数系： DNA 模板， dNTP ， Taq DNA 聚合酶， buffer
反应程序：Βιβλιοθήκη 变性 ( 94~95oC)
复性
( 37~55 oC)
( 70~72 oC )
72 oC 延伸
10min 30-35cycles DNA 扩增
100 万倍
延伸
8
4. 扩增产物检 测
息
（二） . Southern 杂交及拷贝数检测
• 基因的碱基序列， 与含有标记的探针发Th同源配对， 杂交后能产Th 杂交印迹或杂交带的转化植株为转基因植株；未产Th杂交印迹或杂 交带的为非转基因植株
• 选择不同的内切酶和探针组合，根据杂交带的片断大小及数目，可 以判断外源基因的插入位点的整合情况及插入的拷贝数
2. DNA 纯度及浓度的检测：
琼脂糖凝胶电泳 0.8%
植物 DNA 呈现分子量较大的清晰条带 如果 DNA 条带呈弥散状，表明降 解 如果在小分子量区存在较亮的条带，说明含 RNA 如果点样孔较亮，表明样品含杂质
紫外分光光度法：
OD260/ OD260 =1.8 OD260/ OD260 >1.8 含较多 RNA OD260/ OD260 <1.8 含较多的蛋白质及其它杂质
5. 凝胶变性及转 膜双链 DNA 变性成为单链，用 0.5M NaOH+1.5M NaCl
硝酸纤维素膜 尼龙膜
毛细管转移法 电转移法 真空转移法
5. 预杂交及杂交
预杂交：在加入探针前用封闭剂封闭膜上的非特异性位 点 封闭剂：变性的非特异 DNA ，鲑鱼精 DNA
高分子化合物： PVP+BSA+Ficoll400 杂交膜在预杂交液中， 37-42° 温育 3-12 小时