酸性α醋酸萘酯酶染色法

酸性α醋酸萘酯酶染色法
一、 原理
淋巴细胞内含有许多种酶，如α醋酸萘酯酶(ANAE)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)

、β葡萄糖苷酸酶等。不同的淋巴细胞细胞亚群所含酶类及其含量各异，如淋巴母细胞
富含ACP，而成熟的T淋巴细胞则显示ANAE活性，因此可利用化学反应作检测。
T淋巴细胞浆内含有的酸性α醋酸萘酯酶(acid αnaphthyl acetate esterase，ANAE)
，在弱酸性条件下，能使底物酸性α醋酸萘酯水解成醋酸和α萘酚，后者与六偶氮副品
红偶
联，生成不溶性的红色沉淀物，沉积在T淋巴细胞胞浆内酯酶所在的部位，经甲基绿复染，
反应呈现单一或散在的颗粒或斑块，显棕红色。B淋巴细胞则无此种反应。因此ANAE染色
法

可作为鉴别T淋巴细胞的一种非特异性方法。此外，单核细胞、中性粒细胞、酸性粒细胞及
血小板等也可呈现酯酶染色阳性反应，应当注意区分。
二、 材料和方法
(一) 材料
1 25%戊二醛溶液(固定液)在01mol/L pH值74磷酸盐缓冲液9ml中加入25%
戊二醛

溶液1ml，混和，置4℃冰箱保存备用。
2 副品红液将副品红4g加入2mol/L盐酸100ml中，37℃溶解过滤，4℃冰箱保存备用。

3 4%亚硝酸钠溶液取亚硝酸钠400mg，溶于蒸馏水10ml中，临用前配制。
4 六偶氮副品红溶液取新配制的亚硝酸钠溶液3ml，慢慢滴入副品红溶液3ml中，边滴边

搅拌，此时有刺激性气体产生。充分混合，1min后备用。
5 α醋酸萘酯溶液：

α醋酸萘酯2g
乙二醇单甲醚100ml
也可用丙酮100ml代替乙二醇单甲醚。

6 0067(1/15)mol/L pH值76磷酸盐缓冲液：
甲液KH2PO4 908g加蒸馏水至1，000ml
乙液Na2HPO4 974g加蒸馏水至1，000ml。(如为Na2HPO4·12H2O则称
取23

22g)
取甲液13ml，加入乙液87ml，即为0067mol/L pH值76磷酸盐缓冲液。
7 反应液
0067mol/L pH值76磷酸盐缓冲液89ml
六偶氮副品红 6ml(缓慢加入)
α醋酸萘酯液[KG*2/3]25ml(缓慢加入)
8 甲基绿染色液充分混匀，调pH值58～60，临用前配制。
甲基绿1g
蒸馏水100ml
置37℃溶解，冰箱保存备用。
(二) 方法
1 分离单个核细胞取家兔肝素抗凝血1ml加入Hanks液1ml，加入到含有2ml淋巴细
胞分

层液(比重1077±0001)的离心管中，以2 000 r/min离心30min。洗涤后，加少量
Hank

s液，摇匀。
2 制片取上述细胞悬液1滴，加到洁净玻片上，涂片，自然干燥。
3 固定和染色将制备的细胞涂片用25%戊二醛液4℃固定10min，流水冲洗，待干。将
玻片置于反应液内，37℃孵育1h，取出用水冲洗，待干。
4 复染用甲基绿染色液染1min(或瞬时染色)，水洗，吹干。油浸镜下观察计数。
三、 结果判定
镜检时，首先要判定是否为淋巴细胞。淋巴细胞经ANAE染色后，可区分为两大

类：一类淋巴细胞的胞浆内不见呈色物质，为ANAE阴性细胞；另一类在胞浆中出现棕红色
物

质，为ANAE阳性细胞。根据呈色物质的形态和分布又分为块状ANAE阳性淋巴细胞和点状
ANAE

阳性淋巴细胞。ANAE阴性淋巴细胞呈黄绿色，胞浆内无明显着色颗粒。
四、 注意事项
1 不同质量的试剂，尤其是偶氮染料对反应产物的颜色、鲜艳程度、颗粒粗细和定位清
晰

程度等影响很大，应加注意。
2 由于本反应为酶化学反应，反应非常灵敏，各种条件应严格掌握。尤其是试剂的pH值
要

求准确，需用精密pH试纸或pH计测定。
3 配制反应液时，各溶液混合，必须边摇边缓慢加入，若滴入过快，可出现沉淀，影响
染

色结果。
4 制片过程中，标本要求尽快固定、干燥和冲洗。若时间过长，可影响酯酶活性。
5 涂片插入染色缸时，要注意必须将标本面与反应液接触，切勿将标本面紧贴缸壁，以
免

影响染色反应。如片子较多，反应液相对减少，会使阳性率减低。
染色后冲洗不宜过久，防止酶反应产物的红色消减，造成标本观察困难。