(1)高拷贝数的质粒载体 - 西北师范大学
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然后与肿瘤DNA进行分子杂交，有两段质粒DNA能和肿瘤DNA杂交。
进一步研究证明，这部分DNA是从质粒DNA上切割后，转移到肿瘤细胞， 故称之为转移DNA（transformed DNA，T-DNA）。这是首次证明在高
等植物的细胞内存在有微生物的DNA顺序。
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T－DNA的长度约为23kb。章鱼碱 型和胭脂碱型的T-DNA都有8-9kb长 的一段保守区（或称核心区）；而
细菌转座子常有各种抗菌素抗性的基因；在转化过程中可嵌入质粒，使农 杆菌带有相应的抗菌素抗性，可方便地筛选出转座子嵌入的 Ti质粒突变体。
（1）T-DNA区（transferred-DNA regions）：是能 从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA， 故称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的 形成有关。 （2）Vir区（virulence region）：该区段的基因能 激活 T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之 为毒区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻， 合起来约占Ti质粒DNA的三分之一。 （3）Con区（regions recoding conjugations）：存 在着与细菌间接合转移的有关基因tra，冠碱能激 活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转 移编码区。 （4）Ori区（origin of replication)该区段基因调控 Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。
植物基因转化系统: 载体转化系统、原生质体DNA直接导入转化系统、基 因枪 DNA 导入转化系统及利用生物种质细胞 ( 如花粉 粒等)介导转化系统。
载体转化系统 : 包括 Ti 质粒转化载体、 Ri 质粒转化载
体以及病毒转化载体等，其中 Ti 质粒转化载体是最
质粒载体——精选推荐
质粒载体载体主要有病毒和⾮病毒两⼤类,其中质粒DNA是⼀种新的⾮病毒转基因载体。
⼀、⼀个合格质粒的组成要素a复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核⽣物DNA分⼦中只有⼀个复制起始点。
⽽真核⽣物DNA分⼦有多个复制起始位点。
b 抗⽣素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+c 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因⽚段d P/E 启动⼦/增强⼦e Terms 终⽌信号f 加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作⽤⼆、如何阅读质粒图谱第⼀步：⾸先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第⼆步：再看筛选标记，如抗性，决定使⽤什么筛选标记。
（1）Ampr ⽔解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻⽌四环素进⼊细胞。
（3）camr ⽣成氯霉素羟⼄酰基衍⽣物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍⽣物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单⼀切点。
便于外源基因的插⼊。
如果在这些位点外有外源基因的插⼊，会导致某种标志基因的失活，⽽便于筛选。
决定能不能放⽬的基因以及如何放置⽬的基因。
第四步：再看外源DNA插⼊⽚段⼤⼩。
质粒⼀般只能容纳⼩于10Kb的外源DNA⽚段。
⼀般来说，外源DNA⽚段越长，越难插⼊，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动⼦－核糖体结合位点－克隆位点－转录终⽌信号。
这是⽤来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加⼊⼀些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选⽤那种载体，还是要以实验⽬的为准绳。
启动⼦－核糖体结合位点－克隆位点－转录终⽌信号a 启动⼦－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵⼦编码顺序的上游，是DNA分⼦上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动⼦本⾝不被转录。
b增强⼦/沉默⼦－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的⼀种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。
基因工程第四章载体
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
质粒载体的发展
质粒载体的发展质粒载体即，在由限制性核酸内切酶修饰过的质粒DNA序列中插入外源的目的基因，以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导进宿主细胞，进行重组、筛选、扩增的过程。
目录编辑本段质粒载体简介质粒是小型环状DNA分子，在基因工程中作为最常用，最简单的载体，必须包括三部分：遗传标记基因，复制区，目的基因。
质粒在所有的细菌类群中都可发现，它们是独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。
自然界中，质粒是在营养充足时出现的，它在结构、大小、复制方式，每个细菌的拷贝数，在不同的细菌体内的繁殖力，在菌种之间的转移力等方面都会变化，可能最重要的是质粒所携带的特征的改变。
大多数原核生物的质粒是双链环状的DNA分子；但是无论是在革兰式阳性还是阴性菌体内都可以发现线状质粒。
质粒大小变化很大，可从几个到数百个kb。
质粒依靠宿主细胞提供的蛋白质进行复制，但也可以使宿主细胞获得质粒编码的功能。
质粒复制可以与细菌的细胞周期同步，导致菌体内质粒的拷贝数较低，质粒复制也可独立于细胞周期，使每个菌体内扩增了成百上千个质粒拷贝。
一些质粒在菌种间可自由地转移它们的DNA分子，另一些只转移质粒给同种细菌，而有些却根本不转移它们的DNA。
质粒带有具有许多功能的基因，这些功能包括对抗生素和重金属道德抗性、对诱变原的敏感性、对噬菌体的易感或抗性、产生限制酶、产生稀有的氨基酸和毒素、决定毒力、降解复杂有机分子，以及形成共生关系的能力和在生物界内转移DNA的能力。
编辑本段质粒的基本特征质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。
其特点如下：是染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed circuar DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300kb之间，<15kb的小质粒比较容易分离纯化，>15kb 的大质粒则不易提取。
能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous replicon）。
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基因工程
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高拷贝数：自身基因功能控制，与寄主无关
低拷贝数：自身与寄主共同控制，与寄主染色体同步复制
失控：一些低拷贝数的质粒，其复制控制是温度敏感型的。 例如 POU71质粒，在低于 37C下培养，每条染色体平均只有一个拷贝， 但当温度上升到42 C时，其拷贝数可增加到1000个以上。在这种高温环 境下，细胞的生长及蛋白质的合成可按正常的速率持续2～3小时。这期 间编码在质粒载体上的基因产物便超过了常量。最后，细胞生长受到了
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4.2.2 质粒拷贝数控制
常用的定义是指，生长在标准的培养基条件下，每个细菌细 胞中所含有的质粒DNA分子的数目. •10~100个拷贝，称为高拷贝数质粒，松弛型 •1~4个拷贝，为低拷贝数质粒，严紧型 •质粒最多可以占到细菌总DNA的0.1％ ~ 5％。
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4.4.3 质粒载体的选择记号
素抗性等多种。
包括有新陈代谢特性、对大肠杆菌素EI的免疫性，以及抗菌
绝大多数的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号，而且主要集 中在四环素抗性、氨节青霉素抗性、链霉素抗性、卡那霉素 抗性等少数几种抗菌素抗性记号上。 一方面是由于许多质粒本身就是带有抗菌素抗性基因的抗药
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基因工程
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4.1.3 质粒的转移
4.1.3.1 按结合方式分类类型：结合型和非结合型 雌一雄细胞配对过程为细菌的接合作用。
分类 主要基因
按抗性记 号分类 Col质粒 R质粒 F质粒 Col质粒 R质粒 Col质粒
质粒及质粒载体复习题及答案.doc
质粒及质粒载体复习题及答案一、填空题1、基因工程中有三种主要类型的载体：质粒DNA、病毒DNA、质粒和病毒DNA杂合体。
2.由于不同构型的DNA插入EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同。
SC DNA的泳动速度最快，OC DNA泳动速度最慢，L DNA居中，通过凝胶电泳和EB染色的方法可将不同构型的DNA分别开来。
3.就克隆一个基因（DNA片段）来说，最简单的质粒载体也必须包括三个部分：复制子（含有复制起点）、选择标记（主要是抗性基因）、克隆位点（便于外源DNA插入）。
另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子质量。
4.如果两个质粒不能稳定地共存于一个寄主细胞中，则属于同一个不亲和群，这是因为它们的复制机制相同所致。
5.质粒拷贝数是指细胞中质粒的份数同染色体的比值，即质粒/染色体。
6.一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫质粒消除（或治愈）。
7.PBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于pMBl ,它的四环素抗性基因来自于pSClOl ,它的氨节青霉素抗性基因来自于PSE2124 （R质粒）。
8.YAC的最大容载能力是1000~2000kb , BAC载体的最大容载能力是300kb 。
9.把那些没有可检测表型的质粒称为隐蔽性质粒。
10.pUC18质粒是目前使用较为广泛的载体。
pUC系列的载体是通过PBR322和M13两种质粒改造而来。
它的复制子来自pMBl , Amp抗性基因则是来自转座子。
11・Ti质粒是自然界存在的植物基因工程的天然载体。
12.既能在夙coll又能在S・cerevisiae中自我复制的载体DNA称为穿梭载体。
二、选项题（单选或多选）1.下面关于松弛型质粒（relaxed plasmid）性质的描述中，（C ）是不正确的。
的制约, 而有较多的拷贝数A.质粒的复制只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制B.可以在氯霉素作用下进行扩增C.通常具有较少的拷贝数D.同严紧型质粒整合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子2.基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体中只有（B ）被视为用作基因工程载体的天然质粒载体。
基因工程知识点1
基因工程知识点基因工程1、操作水平:DNA分子水平目的:定向改变遗传物质或获得基因产物。
理论基础：1）物质基础一一脱氧核甘酸2）结构基础一一规则的双螺旋结构3）中心法则，共用一套遗传密码2、基因工程（geneticengineering）:指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）,而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
（基因操作、遗传工程、重组DNA技术）。
1973年诞生的基本用途:分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源;大规模生产生物活性物质；设计、构建生物的新性状甚至新物种。
3、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术其核心步骤是DNA片段之间的体外连接。
4、基因工程的基本形式：第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程第四代基因组或染色体的转移基因组工程5、基因工程诞生的理论基础:理论上的三大发现1】证实了DNA是遗传物质；2】揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理；3］遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定。
6、DNA双螺旋:带负电的糖一磷酸骨架在外侧,碱基在螺旋中间相互堆叠，以5'-3'方向反向平行关系。
第二章用于核酸操作的工具酶1、寄主的限制和修饰现象：［1］作用:保护自身DNA不受限制；破坏入侵的外源DNA,使之降解。
【2】入侵噬菌体的子代便能高频感染同一宿主菌，但却丧失了在其原来宿主细胞中的存活九因为它们在接受新宿主甲基化酶修饰的同时,也丧失了原宿主菌甲基化修饰的标记。
2、限制性核酸内切酶的命名：如:HindI属名(H)+种名(in)+株名(d)+类型(I)II型限制性核酸内切酶的基本特性:识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列,大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。
第三章基因工程载体
3个会导致Ampr基因失活
9个导致Tetr基因失活
氨苄青霉素和四环素抗性 24个单一克隆位点。
pBR322的优点
① 双抗生素抗性选择标记
抗生素抗性基因的插入失活效应是检测重 组体质粒的有效方法，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。 获得重组载体的寄主细胞 在Aplasmid ）:在整个细胞
周期中随时可以复制，每个细胞中有许多拷贝, 一般10-60 拷贝，如Col E1质粒。
氯霉素扩增：在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体
复制的氯霉素存在时，松弛型质粒可继续扩增， 其拷贝数可达2000-3000个，称氯霉素扩增效应
严紧型复制质粒 （stringent plasmid ）：
plasmid 接合型质粒（自我转移的 质粒）：质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。
Non
Conjugative plasmid 非接合型质粒
（不能自我转移的质粒）：由于失去控制细菌配 对和自我转移的基因，质粒不能从一个细胞自发 的转移到另一个细胞。
结合型质粒：相对分子质量大、拷贝数小、 严紧型复制 非结合型质粒：相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制
① colicin E1基因的结构 cea imm 免疫基因 kil 溶菌基因
结构基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物 ③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
克隆位点
EcoR I
EcoR I位于E1内部，插入外源DNA导致E1 失活，使受体菌不能合成E（ColE1-），但 仍表现出对E1免疫型（ImmE1+）。
外源DNA
Colicin E1
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4.1.4 质粒DNA的迁移作用（mobilization）
接合型质粒的分子比较大，编码有一套控制质粒DNA 转移的基因。 非接合型的质粒，分子小，不足以编码全部转移体系 所需要的基因。 如果寄主细胞中同时存在一种接合型质粒，那么它们 通常也是可以被转移的。 由共存共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移 叫质粒的迁移。
ColE1
实验中使用的许多载体分子，在其构建过程中都已经丢掉了nic位点，因此不能迁 移。要使这类质粒发生接合转移的唯一的可能途径是，通过重组作用形成融合的 共整合质粒，从而使它们在形体上变成接合型质粒的一部分。
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胞中保存下去所需的生物学功能
通常用质粒、噬菌体和病毒
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第四章 基因工程质粒载体
第一节
质粒的一般生物学特性
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4.1.1 质粒DNA：都有一段DNA复制起始位点序列
1、F因子(致育因子)：F+（♂）；F-（♀）；Hfr. 2、R因子(耐药性)： 3、Col因子：可以使不带有Col质粒的亲源关系密切的菌 株致死的蛋白质. 4、青霉素酶质粒： 5、Ti质粒(诱癌质粒)：植物基因工程重要载体。 6、降解质粒： 7、其它：隐蔽质粒、表达质粒、分泌质粒等。 西北师范大学 精品课程 武国凡
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4.1.3.2 F质粒
（ 1）以染色体外环形双链质粒 DNA 形式存在，其上不携带 着细菌的染色体基因或DNA区段。这样的细胞叫做F+细胞。 （ 2）以染色体外环形双链质粒 DNA 形式存在，同时在其上 还携带着细菌的染色体基因或 DNA区段。这样的细胞叫做F’ 细胞。
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ColE1是一种可以迁移的非接合型的质粒。
bom (nic)
ColE1质粒的转移需要质粒自己编码的两种基 因参与：特异位点bom( nic) ；ColE1特有的 mob基因编码的核酸酶（迁移蛋白质）。
从ColEI质粒或其亲缘关系密切的派生的大多 数的质粒载体，都已经丧失掉了mob区段。迁 mob 移蛋白可以由亲和性质粒类似基因来补充。
（ 3）以线性 DNA 形式从不同位点整合到寄主染色体上，这 样的细胞叫做Hfr细胞（高频重组细胞）。
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4.1.3.3 质粒DNA的接合转移作用
雄性细胞中的 F因子按滚环复 制，进入到雌性细胞。 F－受体细胞
F＋细胞。
F因子还能够带动寄主染色 体一道转移。 从安全考虑，基因工程主要 使用非接合型的质粒。
① 对寄主酶的依赖性 ② DNA聚合酶的利用 绝大多数大肠杆菌质粒DNA都是利 用Pollll，仅在前体片段合成中才利用poll；但另外一些 质粒，例如ColE1，始终是利用pol1 。 ③ 复制的方向性 分为纯单向性的（如 ColE1 ）和纯双向 性的（如 F质粒）两种不同的形式。此外还有一类质粒， 其 DNA的复制既有单向性的也有双向性的。 ④ 复制的终止 ⑤ 复制型 ⑥ 复制起点 窄宿主范围质粒和广宿主范围质粒。 西北师范大学 精品课程 武国凡
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4.1.3 质粒的转移
4.1.3.1 按结合方式分类类型：结合型和非结合型 雌一雄细胞配对过程为细菌的接合作用。
分类 主要基因
按抗性记 号分类 Col质粒 R质粒 F质粒 Col质粒 R质粒 Col质粒
非 接 合 自主复制基因，产生大肠杆菌素基因 型质粒 自主复制基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 接 合 型 自主复制基日，转移基因，大肠杆菌素基因 质粒 自主复制基日，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
基因工程
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4.1.2 质粒编码基因表达的某些表型特征
抗性特征 抗菌素抗性 氨苄青霉素、氯霉素、四环素、链霉素抗性等 重金属抗性 汞\镍、钻、铅、锑、锌等金属抗性 毒性阴离子抗性 砷酸盐、亚砷酸盐、亚硫酸盐、硼酸盐等 其它 嵌人试剂（EB）、辐射、噬菌体及细菌素、质粒特异的限制／修 饰体系抗性 代谢特征：抗菌素及细菌素的合成；碳水化合物、蛋白质、冠瘦碱的新陈 代谢；固氮作用、H2S的合成； 修饰寄主生活方式的因子 毒素的合成--大肠杆菌肠毒素合成； 金黄色葡萄球菌--剥脱性毒素的合成， 植物之冠座病和发根病；豆科植物的感染与结瘤 其它特征 盐杆菌---细胞中气泡的形成； 豌豆根瘤菌的根际蛋白质合成；
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4.1.5 质粒的不亲合性
当两种或两种以上的质粒不能够在同一
个宿主细胞中共存的现象，叫质粒的不
亲合性. 这两种质粒就属于一个单一的不相容组.
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基因工程
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第二节 质粒DNA的复制与拷贝数控制
4.2.1 质粒DNA复制的多样性
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4.2.2 质粒拷贝数控制
常用的定义是指，生长在标准的培养基条件下，每个细菌细 胞中所含有的质粒DNA分子的数目. •10~100个拷贝，称为高拷贝数质粒，松弛型 •1~4个拷贝，为低拷贝数质粒，严紧型 •质粒最多可以占到细菌总DNA的0.1％ ~ 5％。
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第四章 基因克隆质粒载体
第一节 第二节 质粒的一般生物学特性 质粒ＤＮＡ的复制和拷贝数控制
第三节
第四节
质粒ＤＮＡ的分离和纯化
质粒载体的构建及类型
第五节
重要的大肠杆菌质粒载体
西北师范大学 精品课程 武国凡引子
限制性片段，连接进载体后，
形成多个重组DNA分子
将外源DNA带进宿主细胞 提供使重组 DNA分子在宿主细