定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法
杆状病毒滴度检测
如何提高FuGENE HD转染实验成功率FuGENE, 转染摘要：在本章节我们解释了转染体系的关键组分对细胞转染实验的效率有何影响，并且合理的给予您一些关于如何使它们更有利于您研究方面的提示。
在本章节我们解释了转染体系的关键组分对细胞转染实验的效率有何影响，并且合理的给予您一些关于如何使它们更有利于您研究方面的提示。
【组织培养试剂】一般提示：优化您的细胞生长条件。
只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并经可能减少所用试剂的变更。
基础培养基—目前所使用的各种市售培养基（如，RPMI 1640和DMEM）。
培养基的成分包括营养物质（氨基酸，葡萄糖），维生素，无机盐，和缓冲物质。
有些成分非常不稳定，因此如果不在使用时新鲜加入就可能会产生问题。
务必要使培养基避光保存。
因为已知有一些组分和缓冲物质，如HEPES，当暴露于光照下就会分解产生细胞毒性物质。
酚红试剂可保护细胞免受一些HEPES降解所产生的毒性效应，但在使用未加酚红试剂的培养基的应用场合下，如荧光素酶的测定，细胞毒性则仍然是一个问题。
胎牛血清—血清是一种含有白蛋白、球蛋白、生长促进因子和生长抑制因子的极为复杂的混和物。
采集血清所用动物的年龄、营养水平、和健康状况可影响到血清中这些成分的数量和质量。
因此血清易受显著生物学变异的影响。
添加剂—某些细胞的生长依赖于一些对生命力或细胞分裂必不可少的物质（如，生长因子，微量元素，必需代谢物和蛋白等）。
CO2培养箱—细胞生长所需环境为37℃、相对湿度为95％的CO2培养箱。
用CO2是为了控制pH值。
细胞生理对pH的变化非常敏感，因此多数细胞培养基都含有碳酸氢盐缓冲体系。
有些培养基需要CO2 浓度为5％来有效控制pH值，而另一些则需要10％的CO2。
需要向您的培养基供应者核对一下适当的CO2浓度。
如果培养箱内培养条件与所需条件不一致（温度、湿度和CO2）则会导致实验结果的板间变异性。
来自于培养箱内的污染物、化学物质，或真菌／细胞的污染也都可能影响到细胞生理【细胞】一般提示：密切观察您的细胞；确保它们状态良好。
荧光定量PCR用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度检测的研究
荧光定量PCR用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度检测的研究童夏生;孟哲峰【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2007(023)008【摘要】目的:建立一种高效、简便的荧光实时定量PCR方法,用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度的检测.方法:利用Bac-to-Bac载体系统在昆虫细胞中构建含人IL-18基因的重组杆状病毒,收获的病毒母液以10倍梯度系列稀释后,提取病毒基因组DNA.以10倍梯度稀释的重组杆状病毒穿梭质粒(bacmid)作为标准模板,进行荧光定量PCR反应扩增IL-18基因片段并绘制标准曲线,然后以上述的重组杆状病毒基因组DNA作为模板,采用同样体系进行实时PCR反应检测,同时用琼脂糖空斑法测定病毒母液的滴度.结果:成功构建了重组杆状病毒并建立了病毒滴度的实时荧光PCR检测方法.运用标准模板进行的PCR反应显示该方法的线形范围为101-108拷贝,病毒母液的DNA拷贝浓度(vg/mL)值约为空斑检测的滴度pfu/mL值的10倍.结论:荧光定量PCR方法可灵敏快速地鉴定重组杆状病毒,并在较大的线形范围内检测重组杆状病毒滴度,较之空斑法更准确地反映了重组杆状病毒的实际数量.【总页数】4页(P1623-1626)【作者】童夏生;孟哲峰【作者单位】浙江省温岭市第三人民医院,浙江,温岭,317523;中国疾病控制预防中心,北京,100002【正文语种】中文【中图分类】R363【相关文献】1.荧光定量PCR用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度检测的研究 [J], 沈波;孟哲峰;彭颖;吕建新2.荧光定量PCR技术用于模拟临床标本单增李斯特菌检测的研究 [J], 王艳;赵爱兰;叶长芸3.实时荧光定量PCR技术应用于核酸定量检测的研究进展及展望 [J], 任广睦;刘季;王英元4.表达绿色荧光蛋白重组狂犬病病毒Flury-LEP的构建及其用于中和抗体检测的研究 [J], 华涛;陶丽红;葛金英;王喜军;沈向真;步志高5.表达绿色荧光蛋白重组狂犬病病毒Flury—LEP的构建及其用于中和抗体检测的研究 [J],因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
杆状病毒——昆虫细胞表达系统
实验材料：1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。
2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。
抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。
实验步骤：一、昆虫细胞转染：1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。
2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。
b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。
c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。
3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。
4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。
加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。
5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。
27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。
二、病毒贮液的制备：1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。
即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。
2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。
长期保存分装冻存于-80℃。
3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：感染所需病毒贮液量(ml)=[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。
4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下：a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。
病毒滴度测定方法
病毒滴度测定方法
病毒滴度测定是一种用于确定病毒在溶液中的浓度的方法。
它通常用于病毒学研究、疫苗生产和药物研发等领域。
正确的病毒滴度测定方法可以帮助科研人员准确地评估病毒的活性和浓度，从而为相关研究工作提供可靠的数据支持。
下面将介绍几种常用的病毒滴度测定方法。
一、细胞培养法。
细胞培养法是一种常用的病毒滴度测定方法。
首先，将待测病毒样品与细胞培养基混合，然后在培养皿中接种一定数量的细胞，并将混合液加入培养皿中。
接下来，将培养皿放入恒温培养箱中，培养一定时间后观察细胞的感染情况，根据感染细胞的数量可以计算出病毒的滴度。
二、血凝法。
血凝法是另一种常用的病毒滴度测定方法。
这种方法利用病毒对红细胞的凝集作用来确定病毒的滴度。
首先，将一定浓度的病毒样品与红细胞混合，然后在琼脂培养皿中进行凝集反应。
根据凝集的程度和范围可以计算出病毒的滴度。
三、动物接种法。
动物接种法是一种直接将病毒样品接种到动物体内，通过观察动物的感染情况来确定病毒滴度的方法。
这种方法通常用于病毒毒力的测定。
通过确定50%动物传染单位（TCID50）或50%致死剂量（LD50）来表示病毒的滴度。
总结。
以上介绍了几种常用的病毒滴度测定方法，每种方法都有其特点和适用范围。
在进行病毒滴度测定时，需要根据实际情况选择合适的方法，并严格按照操作规程进行操作，以确保测定结果的准确性和可靠性。
希望本文对您有所帮助。
病毒滴度的测定
病毒滴度的测定稀释计数法滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，为每个病毒准备10个孔。
放入37℃，5%CO2培养箱中培养。
第二天加病毒在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入90μl培养液，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。
吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
第三天追加培养液在每个孔再加入100μl完全培养液，利于细胞的生长。
第五天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒液的含量（μl）。
定量PCR法病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。
每孔细胞为5×104个。
接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。
弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5μg/ml polybrene的新鲜培养基。
将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1μl病毒加入到199μl的培养基中。
在3个培养孔中分别加入0.5μl，5μl和50μl 的稀释病毒。
感染开始后20小时，除去培养上清，换为500μl含DNaseI 的新鲜培养基。
在37℃消化15分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。
然后换为2ml正常的培养基，继续培养48小时。
用0.5ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。
用培养基吹洗下，离心收集细胞。
杆状病毒表达系统 杆状病毒滴度测定 全攻略
细胞因子的ELISA检测：
（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细 胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）臵37 ℃，5 % CO2温箱中培养72 h后，收取细胞上清。 （3）详细阅读说明书的实验步骤（不同牌子试剂盒稍有不 同），严格按要求操作。 标准曲线是判定实验的质量。
外周血单核细胞的分离 ：
细胞因子的定量PCR检测：
（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细 胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）臵37 ℃，5 % CO2温箱中培养20 h，提取细胞总RNA并 测定 RNA浓度和纯度。 （3）取0.5 µ g RNA进行逆转录（TOYOBO反转录试剂）。 （4）定量PCR：
供体质粒pFastBac：靶基因位于杆状病毒特异启动子下游 DH10Bac：杆状病毒穿梭载体Bacmid + 辅助质粒
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Expermiantal outline
昆虫细胞的培养
Insect Cell Lines：
杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较： 空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
流式细胞术快速检测杆状病毒滴度
流式细胞术快速检测杆状病毒滴度徐鹏;张佑红;杨益;彭继明;陈龙;靖志强;危威;马静;秦琴【摘要】为了快速而准确的测定杆状病毒的滴度,采用流式细胞术对经SYBR Green I染色后的杆状病毒直接计数.考察固定、破膜和染色等因素对检测结果的影响,并验证改进后的方法的重复性和线性性.杆状病毒最佳染色条件:质量分数为0.1%的多聚甲醛固定病毒30 min后,加入一定量的SYBR Green I在80℃下孵育10 min.测量结果CV值为2.4%(n=8),R2为0.999 8.整个测量过程由原来终点稀释法的7～10 d缩短到1 h.【期刊名称】《武汉工程大学学报》【年(卷),期】2010(032)001【总页数】4页(P57-60)【关键词】流式细胞术;杆状病毒;SYBRGreenI【作者】徐鹏;张佑红;杨益;彭继明;陈龙;靖志强;危威;马静;秦琴【作者单位】武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430074;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430074;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430074;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430074;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430074;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430074;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430074;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430074;武汉工程大学化工与制药学院,湖北,武汉,430074【正文语种】中文【中图分类】Q3310 引言杆状病毒表达载体系统(Baculovirus expression vector system, BEVS)由于其表达的高效性、安全性等诸多优点，在重组蛋白生产、疫苗的研制以及生物杀虫剂等方面具有很高的应用前景[1].为了提高重组蛋白或病毒的产量，必须准确测定杆状病毒与细胞的浓度比，即感染复数(multiplicity of infection，MOI)[2-3].目前病毒滴度的测定方法主要是蚀斑法和终点稀释法(EPDA)[4-5]，两种方法都是利用病毒去感染细胞而间接得到病毒的滴度，测量过程繁琐，耗时长，且不同实验者之间测得的结果相差较大.随着近年来流式细胞术(FCM)的不断发展，其检测范围不再局限于细胞，它已广泛应用于生物医学的各个领域.Marie和Brussaard[6-7]等采用流式细胞仪通过特异性核酸荧光染料SYBR Green I染色成功地检测并计数海洋病毒.在此基础上，Shen[8]首次利用流式细胞术计数杆状病毒，但染色效果不好.本实验针对染色过程中的主要影响因素进行优化，验证了改进后方法的重复性和线性性，并对流式细胞术与终点稀释法的计数结果进行比较.1 实验部分1.1 病毒野生型的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(wide type AcNPV)由武汉大学友好提供.1.2 试剂及仪器SYBR Green I(10 000×)和黄绿荧光微球(1μm)均购于Molecular Probes公司；多聚甲醛购于生工生物工程有限公司；Triton X-100购于Amresco公司；FACSCalibur流式细胞仪，BD公司生产.1.3 样品制备病毒样品制备的主要步骤可分为固定、破膜和染色.待测病毒经磷酸盐缓冲液(PBS，pH=8.0)稀释后，加入一定量的多聚甲醛4 ℃下固定30 min，再放入-80 ℃超低温冰箱15 min，然后置于室温水浴中5 min，加入一定量的Triton X-100室温放置5 min，最后加入SYBR Green I进行染色，具体的影响因素及水平如表1所示.在上机检测之前，加入已知浓度的黄绿荧光微球作为内参.表1 病毒染色过程的影响因素及水平Table1 Factors and levels of the baculovirus dyeing procedure因素水平多聚甲醛质量分数/%0.00, 0.05, 0.10, 0.20, 0.40冻融处理不冻融, 一次, 两次Triton X-100质量分数/%0.00, 0.05, 0.10, 0.20孵育温度/℃25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90孵育时间/min0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 601.4 流式细胞仪分析采用BD公司FACSCalibur流式细胞仪检测病毒样品.前向散射光(FSC-H)、侧向散射光(SSC-H)和绿色荧光(FL1-H)均以对数模式获取.以FL1-H设定阈值，减少背景干扰.CellQuest软件分析数据，在SSC-H和FL1-H的双参数散点图上确定病毒和微球的位置(图1).图1 SSC-H vs. FL1-H双参数散点图Fig.1 Dot plots of side scatter vs. green fluorescence“门”R1内为加入的微球，“门”R2内为待测的病毒.根据R1/R2可以推算出样品病毒的滴度(1).(1)将得到的样品病毒滴度乘以稀释倍数便是原病毒样本中的病毒滴度.1.5 重复性和线性性检测线性性：PBS缓冲液稀释杆状病毒1000倍，取稀释后不同体积(5～640 μL)的病毒测定其滴度，做3个重复，计算相关系数R2.重复性：对同一个病毒样本计数8次，计算变异系数CV.1.6 流式细胞术与终点稀释法的计数结果比较为了比较改进后的流式测量方法与传统的病毒测定方法的准确性，采用终点稀释法[4]对同一病毒样本进行检测，具体如下：a.将处于对数生长期的Sf9细胞接种于96孔板中(100 μL/孔)，27 ℃下孵育24 h.b.以新鲜培养基连续10倍稀释杆状病毒(10-4～10-10).c.96孔板去上清，于每孔加入不同稀释度的病毒100 μL，每稀释度重复12孔，对照孔加入100 μL的新鲜培养基代替病毒液，27 ℃下孵育5～7 d.d.按Spearman-Karber法[9]计算病毒样本的TCID50值.重复测量5次，计算变异系数CV.2 结果与讨论2.1 固定的影响图2显示了不同质量分数的多聚甲醛固定对杆状病毒计数的影响.采用多聚甲醛固定能够维持病毒的原有形态，提高病毒的计数，但当其质量分数大于0.1%后病毒的计数随之减少.这主要是由于甲醛与DNA的相互作用，削弱了染料SYBR Green I与DNA的结合.病毒颗粒的荧光强度也会随着多聚甲醛质量分数的增加而降低. 图2 多聚甲醛固定的影响Fig.2 Effects of paraformaldehyde concentrations on baculovirus counts注: 规定未经固定处理的样本荧光强度为1.2.2 破膜处理破膜的主要原理是利用骤冷骤热或破膜剂的溶脂作用增强病毒颗粒的通透性，以便于染料的进入.从图3(a)可知，病毒样本经过冻融处理后，荧光强度逐渐增强，但病毒计数却随之而减少，这可能是由于冻融导致一部分病毒的DNA与染料不能有效地结合.图3(b)是Triton X-100终质量分数为0.2%的直方图，与图1相比较可知：经破膜剂处理后，病毒的荧光信号分散，背景噪音增强，导致两峰交叠，不利于病毒的准确计数.(a)冻融处理的影响(b)破膜剂处理的影响图3 破膜处理对病毒计数的影响Fig.3 Effects of permeabilization on baculovirus counts注: 规定未经冻融处理的样本荧光强度为1.2.3 染色温度和时间的影响孵育过程对病毒计数的影响显著(图4).孵育温度的提高，一方面可以使病毒外壳失活，增强其通透性，另一方可以增强染料的活性，增加计数结果(图4a)，但温度过高对染色结果也不利.孵育时间不足，将导致染色不充分，病毒峰与背景峰交叠，不能准确计数，当孵育时间大于10 min后，计数结果保持稳定(图4b).(a)孵育温度的影响(b)孵育时间的影响图4 孵育温度和时间对病毒计数的影响Fig.4 Effects of incubation process on baculovirus counts2.4 重复性和线性性检测对于重复性，8次实验结果的平均值为1.22×1010病毒颗粒/mL，最大值为1.43×1010病毒颗粒/mL，最小值为1.01×1010病毒颗粒/mL，CV值为2.4%，这表明该方法的重复性较好.对于线性性，从图5可知，病毒滴度在106～107病毒颗粒/mL范围内，线性性较好(R2=0.999 8).图5 不同加入体积的病毒计数Fig.5 Virus counts of different volume of viral solution注：固定前所有样本均加入PBS缓冲液稀释至960 μL终体积.2.5 流式细胞术与终点稀释法的计数结果比较分别采取流式细胞术和终点稀释法测定同一批病毒的滴度，测量结果如表2所示.从表2可知，流式细胞术的重复性(CV=2.4%)明显优于终点稀释法(CV=25.7%).表中流式细胞术的测量结果是终点稀释法的13.7倍，这是因为流式细胞术是直接计数病毒，而终点稀释法测量的是感染单位.一个感染单位对应多个病毒颗粒，所以流式测量结果大于终点稀释法.表2 终点稀释法与流式细胞术测量结果的比较Table 2 Comparison of virus quantitation results obtained by FCM analysis and by EPDA方法测量次数测量平均值CV/%终点稀释法58.9×108TCID50/mL25.7流式细胞术81.22×1010病毒颗粒/mL2.403 结语病毒最佳染色条件：4 ℃下，0.1%的多聚甲醛固定病毒样本30 min，然后加入SYBR Green I在80 ℃下避光染色10 min.经改进后的流式细胞术测定杆状病毒的方法能够快速而准确的测定杆状病毒的滴度.参考文献：[1]Thomas A K, Condreay J P, Donald L J. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells[J]. Nat Biotechnol, 2005, 23(5): 567-575.[2]Radford K M, Cavegn C, Bertrand M, et al. The indirect effects of multiplicity of infection on baculovirus expressed proteins in insect cells secreted and non-secreted products[J]. Cytotechnology, 1997, 24: 73-81.[3]Zhang Y H, Enden G, Merchuk J C. Insect cells-Baculovirus system: Factors affecting growth and low MOI infection[J]. Biochem Eng J, 2005, 27(1): 8-16.[4]O'Reilly D R, Miller L K, Luckow V A. Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual[M]. New York: Oxford University Press, 1994: 132-134.[5]Hink W F, Vail P V. A plaque assay for titration of Alfalfa looper nuclear polyhedrosis virus in cabbage looper (TN-368) cell line[J]. J Invertebr Pathol, 1973, 22: 168-174.[6]Marie D, Brussaard C P D, Thyrhaug R, et al. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry[J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(1): 45-52.[7]Brussaard C P D. Optimization of procedures for counting viruses by flow cytometry[J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(3): 1506-1513.[8]Shen C F, Meghrous J, Kamen A. Quantitation of baculovirus particles by flow cytometry[J]. J Virol Methods, 2002, 105(2): 321-330.[9]Fineey D J. Statistical Method in Biological Assay[M]. 3rd ed. London: Charles Griffin & Co., 1978: 394-401.。
测定病毒滴度的方法
测定病毒滴度的方法Protocol:1) 转导前一天（第 1 天），胰酶消化细胞并计数细胞密度，按照合适的细胞密度接种到 6 孔板中，能使转染当天的融合度达到 30%-50%。
放置 37℃、 5%CO2 饱和湿度培养箱过夜培养。
例如：如果用HT1080细胞测定滴度，通常一个六孔版的孔接种 2×105 个细胞；2) 转导当天（第 2 天），融解病毒，准备 10 倍稀释系列样品，稀释倍数从 10-2到10-6。
对于每一个稀释样品，用完全培养液稀释病毒至总体积 1mL 。
避免漩涡震荡；3) 去除细胞中的培养液，加入已含有不同病毒量的完全培养液。
另外，保留一孔不添加病毒的细胞，作为空白对照组。
注：每孔加入的培养液的体积应为 1mL ；4) （可选）在含有病毒的培养液中加入聚凝胺，促进病毒感染细胞。
轻轻地摇晃培养板以混匀聚凝胺。
放置 37℃、5%CO2 饱和湿度培养箱过夜培养；注：一般 polybrene 的储液浓度是 6mg/ml （用超纯水配制，－20 度储存，注意分装，反复冻融三次以上将大大降低效果）。
工作浓度是 6ug/ml 。
5) 转染后一天（第 3 天），去除含有病毒的培养液，加入 2mL 新鲜的完全培养液。
放置 37℃、5%CO2饱和湿度培养箱过夜培养；6) 转染后两天（第 4 天），去除培养液，加入含有适当浓度的嘌呤霉素的完全培养液以筛选稳定转导的细胞；7) 每 3 天更换含有嘌呤霉素的新鲜培养液；8) 筛选数天后，可以看到对照组没有活细胞，而添加过病毒的 1 个或者更多个的孔会出现药物抗性的克隆。
去除培养液，用 PBS 洗涤细胞 2 次。
注：筛选所需天数应以对照组的所有细胞死亡为准；9) 先加入95%甲醇固定10min,再 加入结晶紫染色液（6 孔板每孔 1mL ）并放置室温孵育10 分钟；10) 去除染色液，用 PBS 洗涤细胞 2 次；11) 计数被染成蓝色的克隆数目，并计算病毒滴度。
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定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法摘要本发明提供一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，该方法利用重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞后会干扰宿主细胞的生长和复制，通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量实现定量测定重组昆虫杆状病毒滴度。
该方法灵敏度高，准确性好，所需试剂廉价易得；操作简便，技术容易掌握；耗时较短，效率更高。
说明定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法技术领域[0001] 本发明涉及病毒滴度测定，具体地，涉及一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。
背景技术[0002]自从80年代初发现杆状病毒科核型多角体病毒的多角体蛋白基因(polh)的强启动子特性后，Smith and Summer [Smith GE, MD Summers and MJ Fraser.Production ofhuman beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expressionvector.Mol Cell Biol.1983; 3 (12): 2156-2165]首次建立了杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector System, BEVS)。
杆状病毒表达系统已成为当今基因工程领域四大表达系统之一，与大肠杆菌、酵母哺乳动物细胞表达系统相比，BEVS在以下四个方面具有特殊的研究价值:(I)作为超高效的真核基因表达系统，生产有用的目的蛋白；[2]作为基因工程病毒杀虫剂，提高害虫防治效率；(3)研究杆状病毒基因组的结构和功能；(4)研究真核基因的表达调控机制。
杆状病毒表达载体系统已成为研究各种原核蛋白和真核蛋白的非常有效和广泛使用的工具[李卫国，王厚伟，牟志美，石连辉.昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望.山东农业大学学报(自然科学版).2003，34(1): 134-138]。
[0003] 检测病毒滴度的方法有终点稀释法和空斑法。
终点稀释法是常用检测病毒滴度的方法，具有简便、快速的特点。
它是将病毒进行梯度系列稀释后感染细胞，通过检测50%组织细胞感染量(TCID5tl)来判定病毒滴度。
空斑技术最早是由Dulbecco建立[DulbeccoR.-Production of plaques in monolayer tissues by using single particles ofanimal virus.Proc Nat Acad Scil952;38 (8): 747-752], Hink 和Vial 后来把这项技术应用于杆状病毒的研究工作。
空斑法是将适量病毒感染细胞后，病毒在感染的细胞内复制、增殖并释放出游离病毒粒子，这些游离病毒粒子由于受到琼脂糖固定培养基的限制，只能感染邻近的细胞。
经过几个感染周期以后，这些被感染的细胞均死亡而不被中性红染色，周围的活细胞则被染成红色，于是在最初被病毒感染的细胞周围形成一个无色透明区域，即空斑。
通过计数空斑的数量即可判定病毒滴度。
[0004] 对于野生型的昆虫杆状病毒而言，由于其可在感染细胞内形成肉眼可见的包涵体并在短期内将周围细胞崩解形成明显的空斑，用终点稀释法和空斑法均可以确定其滴度。
但是对于重组昆虫病毒而言，由于其缺失了多角体蛋白基因，它不会像野生型的杆状病毒一样在感染细胞内形成肉眼可见的包涵体，因此不能用终点稀释法而只能用空斑法测定重组杆状病毒的滴度。
[0005] 检测重组昆虫病毒的最常用的方法是空斑法，但是由于空斑法操作繁琐，耗时较长(由于其缺失了多角体蛋白基因，其使受感染细胞发生崩解所需的时间也大大延长)，且技术较难掌握、误差较大。
国外目前有两种检测重组昆虫病毒的方法:一种是通过免疫学方法检测重组杆状病毒感染的细胞表面标志蛋白gp64的表达来确定重组杆状病毒滴度[Dee, K.U, Shuler,M.L.0ptimization of an assay for baculovirus titer anddesign of regimens for synchronous infection of insect cells.Biotechnol.Prog.1997; 13 (I):14-24]。
该方法简便快速(48h内完成)，但价格昂贵；一种是直接将水母绿色突光蛋白(Green Flurescent Protein, GFP)作为报告基因构建重组杆状病毒,使重组杆状病毒筛选和滴度测定都变得极为简单[Takehiko Saito a, Takashi Dojima b, MasaruToriyama a, Enoch Y.Park The effect of cell cycle on GFPuv gene expression inthe baculovirus expression system.Journal of Biotechnology.2002;93(2):121-129]。
但该方法涉及到从上游的构建工作做起，工作量巨大。
目前尚没有简便、快速地定量测定重组昆虫病毒滴度的方法。
[0006] 因此，本领域中需要一种低成本、简便、快速的方法来定量测定重组昆虫病毒滴度，以利于昆虫杆状表达系统的广泛研究及应用。
发明内容[0007] 本发明涉及一种定量、简便和快速的方法，用于检测重组杆状病毒的滴度，具体地说，该方法通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量来定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。
[0008] 因此，本发明的目的是提供定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，该方法利用重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞后会干扰宿主细胞的生长和复制，通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量来定量来实现。
酸性磷酸酶法测定原理是活细胞内的酸性磷酸酶可以准确反映细胞数。
在一定条件下，用去垢剂使细胞膜破裂释放出酸性磷酸酶，再与底物PNPP (对硝基苯磷酸酯)作用一段时间后，即可将其催化生成黄色的对硝基酚。
这一呈色反映可以用酶标仪检测，所测的吸光度即可代表酸性磷酸酶活性，也间接反映了活细胞数。
[0009] 本发明提供了一种通过酸性磷酸酶法定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。
包括下列步骤:[0010] (a)将对数生长期的昆虫细胞重悬，用培养基进行适当稀释后接种昆虫细胞于96孔细胞培养板；[0011] (b)将病毒滴度标准品与待检病毒液进行系列稀释，接种于昆虫细胞进行感染；[0012] (C)加入底物液，显色一定时间后，酶标仪检测光吸收值；[0013] (d)根据各系列稀释度病毒滴度标准品的光吸收值绘制标准曲线；[0014] (e)采用标准曲线法，计算待检病毒液的滴度。
[0015] 本发明的实施方案中，其中所述的重组昆虫杆状病毒是指缺失了多角体蛋白基因的昆虫杆状病毒。
[0016] 本发明的实施方案中，所述的昆虫细胞为草地贪夜蛾细胞，包括但不限于Sf9细胞、Sf21细胞、Hi5细胞，最优选Sf9细胞。
使用前应调整细胞生长状态及生长周期，选择生长状态良好、处于对数生长期的细胞用于实验。
[0017] 本发明的实施方案中，Sf9细胞接种数量为2X IO3〜3X IO3个细胞/孔，优选3 X IO3个细胞/孔。
[0018] 本发明的实施方案中，所述的感染为，15〜25°C条件下感染I〜2h，优选在25°C条件下感染2h。
[0019] 本发明的实施方案中，所述的培养基为TC-100或Sf-900 II培养基，优选TC-100培养基。
TC-100培养基中可含有I〜20% (V/V)胎牛血清，优选含有10% (V/V)胎牛血清。
[0020] 本发明的实施方案中，所述病毒滴度标准品稀释后浓度范围是1.9X104〜3.0X105pfu/mLo[0021] 本发明的实施方案中，所述显色条件为在37°C条件下作用lh。
[0022] 本发明的实施方案中，是在405nm下测定光吸收度值。
[0023] 本发明克服了现有技术中的缺点，以滴度对数值和吸光度为坐标轴作图绘制标准曲线，通过计算确定重组昆虫杆状病毒滴度。
具体方法为:以标准品的滴度对数值为横坐标，以对应的405nm的吸光度值为纵坐标，根据实验数据绘制标准曲线，求直线回归方程。
将测得待检样品的吸光度代入直线回归方程，将计算结果乘以稀释倍数即为滴度。
将所有位于标准曲线范围内的待检样品的吸光度值分别计算滴度，相加后取平均数，即为该待检样品的滴度。
[0024] 该方法排除了空斑法通过肉眼打点计数空斑易导致主观误差的缺点，获得的结果更加可观、准确。
此方法通过检测细胞的数量实现定量测定重组昆虫杆状病毒滴度。
灵敏度高，准确性好，所需试剂廉价易得；操作简便，技术容易掌握；耗时较短，效率更高。
附图说明[0025] 图1为根据实施例3所述的检测结果绘制的标准曲线。
具体实施方式[0026] 下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照文本或已知的方法合成的，对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。
[0027] 实施例1:细胞接种[0028] (I)材料Sf9细胞，购自中国典型物菌种保藏中心；TC-100培养基和胎牛血清，购自GIBCO 公司；96孔板，购自NUNC公司。
[0029] (2)操作方法[0030] 取对数生长期的Sf9贴壁生长细胞，轻柔吹打，使细胞重悬。
1，OOOg (水平转头)离心8min。
弃上清，将细胞用含10% (V/V)胎牛血清的TC-100培养基重悬，制成细胞悬液。
取样，台盼蓝染色计数。
[0031] 用含109UV/V)胎牛血清的TC-100培养基将细胞稀释至3 X IO4个/mL，加入到96孔细胞培养板中，每孔100微升。
27°C静置2h。
[0032] 实施例2:重组杆状病毒滴度标准品及待检样品的稀释[0033] (I)材料TC-100培养基和胎牛血清，购自GIBCO公司；微量移液器，购自EPPEND0RF 公司；EP管、枪头，购自AXYGEN公司。
[0034] (2)操作方法[0035] 用TC-100培养基稀释重组杆状病毒滴度标准品，最高浓度为320倍稀释，以下使用640倍稀释、1280倍稀释等2倍梯度稀释，共8个稀释度；用TC-100培养基稀释待检样品，最高浓度为20倍稀释，以下使用80倍稀释、320倍稀释等4倍梯度稀释，共5个稀释度。
[0036] 实施例3:定量测定重组昆虫杆状病毒滴度[0037] (I)材料胎牛血清，购自GIBCO公司;pNPP，购自Amersco公司;Triton X-100、乙酸钠、NaOH购自国药；EDTA，购自沪试。