杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定)
杆状病毒滴度检测
如何提高FuGENE HD转染实验成功率FuGENE, 转染摘要：在本章节我们解释了转染体系的关键组分对细胞转染实验的效率有何影响，并且合理的给予您一些关于如何使它们更有利于您研究方面的提示。
在本章节我们解释了转染体系的关键组分对细胞转染实验的效率有何影响，并且合理的给予您一些关于如何使它们更有利于您研究方面的提示。
【组织培养试剂】一般提示：优化您的细胞生长条件。
只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并经可能减少所用试剂的变更。
基础培养基—目前所使用的各种市售培养基（如，RPMI 1640和DMEM）。
培养基的成分包括营养物质（氨基酸，葡萄糖），维生素，无机盐，和缓冲物质。
有些成分非常不稳定，因此如果不在使用时新鲜加入就可能会产生问题。
务必要使培养基避光保存。
因为已知有一些组分和缓冲物质，如HEPES，当暴露于光照下就会分解产生细胞毒性物质。
酚红试剂可保护细胞免受一些HEPES降解所产生的毒性效应，但在使用未加酚红试剂的培养基的应用场合下，如荧光素酶的测定，细胞毒性则仍然是一个问题。
胎牛血清—血清是一种含有白蛋白、球蛋白、生长促进因子和生长抑制因子的极为复杂的混和物。
采集血清所用动物的年龄、营养水平、和健康状况可影响到血清中这些成分的数量和质量。
因此血清易受显著生物学变异的影响。
添加剂—某些细胞的生长依赖于一些对生命力或细胞分裂必不可少的物质（如，生长因子，微量元素，必需代谢物和蛋白等）。
CO2培养箱—细胞生长所需环境为37℃、相对湿度为95％的CO2培养箱。
用CO2是为了控制pH值。
细胞生理对pH的变化非常敏感，因此多数细胞培养基都含有碳酸氢盐缓冲体系。
有些培养基需要CO2 浓度为5％来有效控制pH值，而另一些则需要10％的CO2。
需要向您的培养基供应者核对一下适当的CO2浓度。
如果培养箱内培养条件与所需条件不一致（温度、湿度和CO2）则会导致实验结果的板间变异性。
来自于培养箱内的污染物、化学物质，或真菌／细胞的污染也都可能影响到细胞生理【细胞】一般提示：密切观察您的细胞；确保它们状态良好。
昆虫杆状病毒表达系统的研究与应用进展_刘高强
收稿日期: 2004-02- 23 修回日期: 2004- 04- 29 * 国家自然科学基金资助项目(30070627) * * 电子信箱: gqliugq@ sohu. com
第7 期
刘高强 等: 昆虫杆状病毒表达系统的研究与应用进展
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表 1 一些代表性的杆状病毒基因及其功能
基因
polh p10 gp64 p619 gp41 vp39 hel dnapol lef- 1 lef- 2 lef- 3 ie- 1 ie- 2 p35 pe38
表达产物和功能
多角体蛋白; 构成蛋白质晶体起保护作用 10 k 蛋白; 与多角体膜形成、病毒多角体聚集、细胞核解体有关 BV 包膜结构蛋白; 与病毒入侵细胞有关 核心蛋白, 使病毒基因组 DNA 浓缩 PDV 结构糖蛋白 壳体主要结构蛋白 解螺旋酶, 病毒 DNA 复制和晚期表达因子, 也与 AcMNPV 的宿主域扩大有一定关系 DNA 聚合酶; 病毒 DNA 复制必需 31k; DNA 复制和晚期表达因子 24k; DNA 复制和晚期表达因子 DNA 复制和晚期表达因子 67k 蛋白; 早期转录、病毒 DNA 复制和晚期表达因子, 刺激增强子活性 47k 蛋白; 早期转录、病毒 DNA 复制和晚期表达因子, 刺激增强子活性, 也与杆状病毒宿主范围有关。 35k 蛋白; 抗细胞凋亡, DNA 复制和早、晚期表达因子 38k; 参与病毒 DNA 复制的调节, 能激活解旋酶基因的表达, 也与杆状病毒宿主范围有关。
昆虫杆状病毒表达系统具有安全性高, 对外源 基因克隆容量大, 重组病毒易于筛选, 具有完备的 翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力 等特点[1 ] , 现已成为基因工程四大表达系统( 即杆 状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统) 之一。近 年来, 昆 虫杆状病毒表 达系统的 发展很 快, 本文综述了它的最新研究进展, 并在此基础上 分析其存在的主要问题和应用前景。
昆虫杆状病毒表达系统(BEVS)
姓名：宋志瑞 专业：生物工程 学号： 2015304120207
NO.1
BEVS 简介
BEVS简介
昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVS)是基于昆虫杆状病 毒及其宿主细胞建立起来的表达体系；是继大肠杆菌， 酵母，哺乳动物细胞表达系统建立起来的，始于上世纪 80年代。
NO.2
BEVS 优点
2
Bac-to-Bac
3
BaculoDirect源自BacPAKBac-to-Bac
BaculoDirect
三大体系的区别
NO.5
BEVS常用宿主
常用宿主
Thanks
√
√ √ Sometimes Sometimes
Glycosylation
Acylation
√
√
表达高
加工 修饰
安全
B E VS
高效
容量大
NO.3
BEVS 原件
BEVS原件
1. 转移载体 2. 杆状病毒（AcNPV) 3. 宿主（培养细胞或虫体）
NO.4
BEVS三大系统
BEVS三大系统
1
BacPAK
BEVS优点
Features Simple to use Protein size Multiple gene expression Signal peptide cleavage BEVS √ unlimited √ √ Bacterial √ <100kD
Intron splicing
Functional protein Phosphorylation
杆状病毒表达系统医学PPT课件
12
同源重组：先将外源基因克隆到转移载体上，然后与线 性化Bacmid上共转染转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒：
13
• “转座”和“同源重组”目前都在使用中。
• “转座”方式的代表是ThermoFisher的Bac-to-Bac系统。
• 采用“同源重组”方式的有Clontech的BacPAK系统、OET 的FlashBac系统，以及Bacmid Ltd.的qBac系统。 • 这两种方式与外源基因的表达量无关。
6
• G. E. Smith将AcMNPV的EcoRI-I片段（包含多角体蛋白基 因）克隆到pUC8质粒上，然后把人β-干扰素基因克隆到 BamHI位点。 • 用重组的质粒和野生型的AcMNPV共同感染Sf细胞。 • 得到的病毒通过空斑筛选(0.5%)，得到重组病毒。 • 用重组病毒感染Sf细胞，得到β-干扰素。
杆状病毒表达系统
1
杆状病毒简介
• 杆状病毒是一类专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒 粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋 形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。 模式种是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）. • 核型多角体病毒有两种形式：一种为芽生病毒(budded virus, BV) ，另一种则为包涵体病毒(occluded virus, OV)。
S.A. Kaba et al. / Journal of Virological Methods 122 (2004) 113–118
17
敲除p26,p10,p74极大地提高了外源基因的产量：
Cell Biol Toxicol (2010) 26:57–68
18
糖基化改造 把昆虫细胞中缺少的糖基化酶克隆到Bacmid上，使蛋白 的糖基化更像哺乳动物细胞：
Bac-to-bac中文说明书
Bac-to-bac中⽂说明书Bac-to-Bac杆状病毒表达系统Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的⽅法产⽣重组杆状病毒。
此⽅法基于让已经转⼊杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座⼦的表达框的质粒在Ecoli中扩增。
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产⽣包含⽬的位点的表达结构，这个⽬的基因的产⽣被杆状病毒特意位点启动⼦控制。
*⼀个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产⽣重组杆粒。
*⼀个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染细胞后产⽣重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素⼄酰转移酶。
Bac-to-Bac表达系统的优点：使⽤这个系统产⽣重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使⽤同源重组产⽣重组杆状病毒所需的4-6周相⽐，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和⾮重组病毒的⼏率*可以快速同时进⾏⼤量重组，适合表达功能性研究的蛋⽩选择pFastBac菌体（Vector）：⼤量的pFastBac菌体都适于进⾏Bac-to-Bac表达系统。
选择对于你的需要最合适的菌体。
指南⽤途：指南提供了⼀个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆⽬的基因到pFastBac TM供体质粒的选择2、转化pFastBac TM 结构到最⾼效的DH10Bac TM产⽣重组质粒3、转染重组质粒DNA到昆⾍细胞产⽣重组杆状病毒4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使⽤病毒株感染昆⾍细胞表达⽬的重组蛋⽩重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是⽤来帮助你产⽣重组杆状病毒，在昆⾍细胞中进⾏⾼⽔平表达⽬的基因的系统。
虽然他可以帮助你很容易的产⽣杆状病毒表达你的重组蛋⽩，但是使⽤这系统更倾向于有杆状病毒⽣物学和昆⾍表达背景的使⽤者。
杆状病毒表达系统简介-9页精选文档
体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。
原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。
真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。
昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。
1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m 的包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
杆状病毒表达系统 杆状病毒滴度测定 全攻略
细胞因子的ELISA检测：
（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细 胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）臵37 ℃，5 % CO2温箱中培养72 h后，收取细胞上清。 （3）详细阅读说明书的实验步骤（不同牌子试剂盒稍有不 同），严格按要求操作。 标准曲线是判定实验的质量。
外周血单核细胞的分离 ：
细胞因子的定量PCR检测：
（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细 胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）臵37 ℃，5 % CO2温箱中培养20 h，提取细胞总RNA并 测定 RNA浓度和纯度。 （3）取0.5 µ g RNA进行逆转录（TOYOBO反转录试剂）。 （4）定量PCR：
供体质粒pFastBac：靶基因位于杆状病毒特异启动子下游 DH10Bac：杆状病毒穿梭载体Bacmid + 辅助质粒
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Expermiantal outline
昆虫细胞的培养
Insect Cell Lines：
杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较： 空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
测定杆状病毒滴度方法的研究进展
中性 红 染料 的第 二层琼 脂 糖凝 胶 ，７ 孵育 １ ２℃ ２—２ ４ 小时 ， 肉眼观察 进行 噬斑计 数 ； 计 算病 毒滴 度 。 ⑥ 病毒滴 度 ＝最高 稀 释倍 数 的蚀 斑数 × 高稀 释 最 倍数 ×接种 病 毒量 ｍ／ Ｌ ｌ￣
用前景。为了在 Ｂ Ｖ Ｅ Ｓ中最大程度地表达重组蛋 白 质， 确定杆状病毒与细胞 的合适 比例 ， 称为感染复数 （ ｕｔ ｌ ｉ ｆｉ ｅ ｔ ｎ ＭＯ ） 非 常 重 要 的 ， 达 Ｍ ｌｐｉ ｔ ｏ ｆｃ ｏ ， Ｉ 是 ｉ ｃｙ ｎ ｉ 为 到 在合适 的 ＭＯ Ｉ时感 染 细 胞 ， 必需 测定 病 毒 滴 度 。 这 对 于病毒 的扩 增 和获得 新 的病 毒 液时进 行重 复性 表达重 组 蛋 白是 必 不 可 少 的 ， 此本 文 就 测定 杆 状 因 病毒滴度方法的研究进展作一综述。
杆 状 病毒 表 达 载体 系统 （ ａｕ ｖ ｕ ｘｒｓｉ Ｂ ｃｌ ｉ ｓｅｐｅｓ ｎ ｏｒ ｏ ｖｃｏ ｓ ｍ， Ｅ Ｓ 是 一个 以杆 状 病毒 为 外 源基 因 ｅｔ ｓ ｔ Ｂ Ｖ ） ｒｙ ｅ
载体 ， 以昆虫细 胞 为 受体 的表 达 系 统 ， 具 有安 全 、 它
４ ￣ 同时使 Ｓ －０ ．ＩＳ Ｍ 培 养液预 热 ４ ￣ 等 体 ０Ｃ， Ｆ９ ０ Ｉ Ｆ ０Ｃ，
１ 蚀斑 检测
删＝壹 痘避 蒜
该方 法 的缺点是 ： 需 时 间长 ， ① ６～７天 ； 易 受 ②
Ｓ９细 胞 的质 量 、 层 细胞 密度 、 ／ 单 琼脂 糖 的一致 性 、 孵 育 时 间和操作 者 的熟 练 程 度 等 多种 因素 影 响 ， 验 试 结 果重 复性差 异较 大 。 １２ 使 用 Ｂ半 乳糖 苷酶 的蓝 白斑 计数 ． ． 携 带 ｌｃ ａＺ基 因 的转 移 载 体 与杆 状 病 毒 共 转 染
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病毒扩增&蛋白表达
扩增病毒：接毒量为 0.05—0.1 MOI
一般情况下，P1代毒滴度大概为1×106 — 1×107
PFU/ml， P2 代毒滴度1×107—1×108 PFU/ml
比如：P1代毒滴度为5×106 PFU/ml，T75细胞瓶的细胞量
2×107cells，那么
蛋白表达：接毒量为 1—5 MOI
固定血清—稀释病毒法
在固定量的血清中，加入等量不同稀释度的病毒，用对 照非免疫血清（对照组）和待检血清同时进行测定，计算每 一组的TCID50、EID50或LD50，然后计算中和指数。
注意事项：
1. 待检血清需56℃灭活30分钟。
2. 需重复测定抗体时，血清应分装后冻存，以免反复冻融。
3. 细胞应处于对数生长期，严禁细胞过度生长或老化，细 胞 活力≥ 95%。 4. 牛血清有中和病毒感染力的作用，实验过程中切勿将细胞 培养液与病毒稀释液混淆使用。 5. 病毒与抗血清混合，常规采用37℃作用1小时。但针对不 同耐热性的病毒，孵育温度和时间应有所增减。
细胞因子的ELISA检测：
（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细 胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）臵37 ℃，5 % CO2温箱中培养72 h后，收取细胞上清。 （3）详细阅读说明书的实验步骤（不同牌子试剂盒稍有不 同），严格按要求操作。 标准曲线是判定实验的质量。
BacPAK™ Rapid Titer Kit
本测定方法，以针对杆状病毒囊膜蛋白gp64的 单克隆抗体标记被病毒感染的细胞，然后以HRP-标 记的二抗与感染细胞进行染色。通过底物显色，在
光学显微镜下计数感染斑点的数量，经过稀释倍数
的换算，即可得出病毒的滴度（IFU/ml）。
注意事项：
1. 细胞铺板5 ×106 cells/well，细胞计数要准，台盼蓝染 色，保证细胞活力≥ 95%。
获得重组杆状病毒——转染Sf9 cells
1. 小提好的Bacmid DNA，置4 ℃不超过1周 2. 转染试剂：Cellfectin® ⅡReagent 3. 转染后细胞的形态变化
细胞 变大
增殖明显变 慢或不增殖 脱落 或 融合(VSV/G) 裂解
4. 收毒，短期内4 ℃避光保存，长期保存分装后置-80 ℃
距离比例=(高于50%的保护率-50% )/(高于50%的保护率-低于50%的保护率) =(66.7-50)/(66.7-16.7) =0.33 lgPD50=高于50%保护率的血清稀释度的对数 +距离比例×稀释度对数的差 =-1.2+0.33×(-0.3) =-1.299
PD50=-1.299的反对数=0.05=1/20 即1:20稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞不出现CPE
外周血单核细胞的分离 ：
细胞因子的定量PCR检测：
（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细 胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）臵37 ℃，5 % CO2温箱中培养20 h，提取细胞总RNA并 测定 RNA浓度和纯度。 （3）取0.5 µ g RNA进行逆转录（TOYOBO反转录试剂）。 （4）定量PCR：
3. 细胞和细胞培养试剂
（1）对数生长期细胞 （2）DMEM/血清/胰酶/抗生素
固定病毒—稀释血清法
将不同稀释度的血清与固定量的病（200TCID50、 EID50或LD50）混合，适当的条件下感作一定时间以后， 再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物， 测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生 病毒感染的能力及其效价。以能保护50%组织培养细胞、 鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血清最高稀 释倍数，作为该血清的50%中和效价(PD50)。
重组pFastBac质粒的构建
选择合适的载体
重组Bacmid的产生
重组Bacmid的鉴定
Bacmid DNA ≥135kb
PCR法: pUC/M13 Forward and Reverse primer 或者pUC/M13 Forward or Reverse primer and a primer that hybridizes within your insert
Primer-Forward（IFN-γ/IL-4/β-actin）
Primer-Reverse（IFN-γ/IL-4/β-actin） 2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix cDNA ROX H2O
1µ l（10 µ M）
1µ l（10 µ M） 12.5 µ l 1µ l 0.05 µ l 9.45 µ l 总25 µ L
供体质粒pFastBac：靶基因位于杆状病毒特异启动子下游 DH10Bac：杆状病毒穿梭载体Bacmid + 辅助质粒
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Expermiantal outline
昆虫细胞的培养
Insect Cell Lines：
谢谢
细胞免疫检测注意事项：
1. 分离淋巴细胞的速度要快，避免体外长时间操作导致
过多淋巴的活性降低和死亡。
2. 台盼蓝染色计数，保证实验组间有效细胞的数量相同。 3. 准备免疫原性较好的刺激，并通过预实验确定最佳刺 激剂量。 4. RNA提取时，不丢弃24孔板中淋巴细胞上清。 5. 严格按照细胞因子ELISA试剂盒操作步骤实验。
2. 病毒稀释要准，不同浓度之间换枪头，是确保不同稀释 度孔斑点成10倍关系的关键。
3. 整个过程中，轻轻洗板，避免细胞脱落过多。 4. 实验完毕3 h后数斑，效果更佳。 5. 结果判定：
疫 苗 免 疫 动 物 后 免 疫 效 力 评 价
ELISA抗体 体液免疫检测
中和抗体
细胞因子mRNA水平检测—qPCR 细胞免疫检测 细胞因子蛋白质水平检测—ELISA 淋巴增殖实验—MTT法
Sf9 or Sf21 cells ——主要用于转染，空斑实验和滴度测定 High Five™ cells or Mimic™ Sf9 cells ——转染效率低，主要用于蛋白表达
Grace's Insect Medium with L-glutamine and
supplemented with（pH 6.5）：
杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较： 空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
3330 mg/L lactalbumin hydrolysate 3330 mg/L yeastolate 350 mg/L NaHCO3 10% heat-inactivated fetal bovine serum
昆虫细胞的培养
Atmosphere：air, 100%
Temperature：27.0—28.0 ℃
每次包被板子条件一致， 4 ℃ 16-18h。 方阵滴度确定最佳抗原包被浓度。
2. 血清样品不溶血，防止干扰结果。
3. 设置空白孔（不加血清），统计结果时，所有实验组的 OD值先减掉背景值，再计算比值和滴度。
中和抗体
微量中和实验技术
中和实验原理
分类
固定病毒—稀释血清法 固定血清—稀释病毒法（用的很少）
杆状病毒表达系统 & 疫苗实验体液免疫与细胞免疫的检测
杆 状 病 毒 表 达 系 统
昆虫细胞的培养
重组pFastBac质粒的构建
重组Bacmid的产生与鉴定 获得重组杆状病毒
蛋白表达&病毒扩大
Overview
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System能快速并有 效的获得重组杆状病毒，其重组是基于供体质粒表达盒 与杆状病毒穿梭载体Bacmid间发生位点特异性转座。
ELISA抗体
1. 制备良好的抗原包被ELIFra bibliotekA板—纯化的蛋白或病毒
（1）蛋白质与酶标板的结合主要是靠疏水作用的物理吸附，而包被液 的PH大于蛋白的PI，有利于蛋白质疏水键的适当暴露。 （2）酶标板聚苯乙烯表面暴露的主要是C－H键，包被液PH大于蛋白 PI，使蛋白质带上负电荷，有利于蛋白质与酶标板的牢固结合，提 高包被效率。
用途
疾病诊断 病毒分离株的鉴定
不同病毒株的抗原关系研究
疫苗免疫原性的评 免疫血清的质量评价 测定实验动物血清中是否存在抗体
材料
1. 病毒
（1）冻存的病毒不能重复使用 （2）进行中和实验前，需先进行病毒滴定（TCID50）的滴定 进行病毒定量
2. 血清样品
（1）血清样品分装冻存于-20℃ ，一般不要反复冻融3次以上。 （2）血清样品不溶血，不长期冻存，以减少对细胞的毒性。 （3）需要有阳性和阴性对照血清，实验前需56℃灭活30分钟。
6. 每份血清做3个生物学重复。
细胞免疫的检测
首先要完成淋巴的分离和体外刺激 包括脾淋巴细胞/外周血单核细胞的分离
脾细胞的分离：
1.处死的小鼠经消毒后，放臵于泡沫板右侧卧固定，剪开左 侧背腹交界处皮肤，分三套镊子/剪刀无菌取脾脏 2.将脾脏转入匀浆器中，加少量不完全1640，轻轻研磨。 3.静臵，吸上清液入15 ml离心管中，1000rpm×10 min。 4.弃上清，加入5 ml的8.3g/l NH4Cl，静止5 min (去除红细 胞)，1000 rpm ×10 min。 5.弃上清，用不完全RPMI-1640洗涤，1000 rpm ×10 min。 6. 细胞计数，台盼蓝染色，要求细胞活性应在95%以上。 7.调整浓度为4×106 cells/ml。