昆虫杆状病毒表达系统(BEVS)
昆虫杆状病毒表达载体系统的应用与展望
昆虫杆状病毒表达载体系统的应用与展望作者：宋姗姗来源：《中国科技纵横》2017年第22期摘要：昆虫杆状病毒表达载体系统具有生物安全性高、能容纳较大外源基因片段并实现多基因共表达、有完备的翻译后加工修饰系统等特点，因而得到广泛的应用。
近年来，随着重组杆状病毒构建技术、昆虫细胞培养技术的不断发展和改进，加大了昆虫杆状病毒表达载体系统在疫苗制备、治疗性抗体、药物研发和基因治疗中的应用力度。
本文综述了杆状病毒表达载体的研究现状和应用范围，讨论了目前杆状病毒表达载体重组蛋白易降解的问题。
随着科技的进步，对杆状病毒载体的研究与优化会更加深入，昆虫杆状病毒表达载体系统的应用研究尤为重要。
关键词：杆状病毒；疫苗；治疗性抗体；基因治疗中图分类号：Q789 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）22-0209-01昆虫杆状病毒表达载体系统（Baculovirus expression vector system，BEVS）是当今基因工程四大表达系统之一，具有生物安全性高、能容纳较大外源基因片段、可实现多基因共表达、具有完备的翻译后加工修饰系统、无内毒素污染等优点[1-3]。
同时，由于宿主细胞系的建立和优化、细胞培养基成分的不断改进，使得细胞生存率达到95%，基本可实现大规模培养[1]。
因此，昆虫杆状病毒表达系统越来越广泛的应用于疫苗制备、药物研发、农林牧渔等领域。
1 昆虫杆状病毒表达载体系统的研究进展Kitts等在1990年提出了线性技术，并设计了重组-救活方法，提高了杆状病毒基因组同源重组能力，将其设计的BacPAK6的重组效率提到80%以上，有较强的应用价值[4]。
但由于DNA酶切消化效率影响，重组病毒的获得仍需通过噬斑纯化过程。
Bac-to-Bac技术的出现避免了噬斑纯化步骤，缩短了重组杆状病毒的周期，同时，此方法在大肠杆菌中进行，非常便捷，不需要空斑纯化，较为节省时间。
但由于鳞翅目昆虫细胞系缺乏功能性糖基转移酶和唾液酸生物合成与利用途径，其产生的糖基化修饰缺乏末端唾液酸化，影响糖蛋白的整体性质，因此研究人员设计出转基因昆虫细胞系，使昆虫细胞对重组蛋白的糖基化修饰更加接近哺乳动物细胞，更利于昆虫杆状病毒表达载体系统的研究。
昆虫表达系统
➢ 识别受体 ➢ 假病毒颗粒
• 杆状病毒及其基因组模型
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昆虫杆状表达系统简介
• 杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群 ,发现最早 、研
究最多且实用意义很大的昆虫病毒。20世纪80年代以来由
于杆状病毒表达载体系统（baculovirus expression vector system，BEVS）的建立 ,已被公认为是当今 基因工程四大表达系统之一 。该系统具有许多优点, 如多角体启动子控制下的高效表达 ,完善的转译后 加工修饰 ,较易从无血清培养上清中纯化的蛋白,无 内毒素污染等。 • 杆状病毒载体系统主要分为两大类,一类是用于表达单 个外源基因的载体,另一类是多元表达载体,用于插人 并表达2个或多个外源基因
➢ 荧光显微镜法——表位标记的抗体与
直接抗体进行荧光标记——免疫学 方法
• Western印迹法 ➢ 蛋白样品制备→ SDS-PAGE（按分子
量大小）→电转移→一抗（特异性） →二抗→显色
➢ 敏感度：1-5ng
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杆状病毒-昆虫表达系统技术路线
• BEVS通常由转移载体、亲本病毒和重组介质三部分组成,其技术 路线分以下几步:先将外源片段克隆到载体质粒中, 置于杆状病毒启 动子控制之下, 上下游各有一段与亲本病毒DNA 相匹配的侧翼序 列, 构建成转移载体; 然后把转移载体和野生型病毒共转染入昆虫 细胞,通过同源重组将外源片段插入到病毒基因组,再以特定的筛选 标记和方法获得重组病毒。由于病毒原来的非必需区段被外源片 段取代, 当重组病毒在受体细胞内复制时,外源片段也得到了表达。 最后空斑纯化重组病毒, 扩大培养,分离、 纯化所表达的外源蛋白 。
昆虫杆状病毒表达系统的研究与应用进展_刘高强
收稿日期: 2004-02- 23 修回日期: 2004- 04- 29 * 国家自然科学基金资助项目(30070627) * * 电子信箱: gqliugq@ sohu. com
第7 期
刘高强 等: 昆虫杆状病毒表达系统的研究与应用进展
41
表 1 一些代表性的杆状病毒基因及其功能
基因
polh p10 gp64 p619 gp41 vp39 hel dnapol lef- 1 lef- 2 lef- 3 ie- 1 ie- 2 p35 pe38
表达产物和功能
多角体蛋白; 构成蛋白质晶体起保护作用 10 k 蛋白; 与多角体膜形成、病毒多角体聚集、细胞核解体有关 BV 包膜结构蛋白; 与病毒入侵细胞有关 核心蛋白, 使病毒基因组 DNA 浓缩 PDV 结构糖蛋白 壳体主要结构蛋白 解螺旋酶, 病毒 DNA 复制和晚期表达因子, 也与 AcMNPV 的宿主域扩大有一定关系 DNA 聚合酶; 病毒 DNA 复制必需 31k; DNA 复制和晚期表达因子 24k; DNA 复制和晚期表达因子 DNA 复制和晚期表达因子 67k 蛋白; 早期转录、病毒 DNA 复制和晚期表达因子, 刺激增强子活性 47k 蛋白; 早期转录、病毒 DNA 复制和晚期表达因子, 刺激增强子活性, 也与杆状病毒宿主范围有关。 35k 蛋白; 抗细胞凋亡, DNA 复制和早、晚期表达因子 38k; 参与病毒 DNA 复制的调节, 能激活解旋酶基因的表达, 也与杆状病毒宿主范围有关。
昆虫杆状病毒表达系统具有安全性高, 对外源 基因克隆容量大, 重组病毒易于筛选, 具有完备的 翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力 等特点[1 ] , 现已成为基因工程四大表达系统( 即杆 状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统) 之一。近 年来, 昆 虫杆状病毒表 达系统的 发展很 快, 本文综述了它的最新研究进展, 并在此基础上 分析其存在的主要问题和应用前景。
昆虫表达系统
昆虫杆状病毒表达系统的分子基础
• 目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 (Ac MNPV)、 家蚕核多角体病毒(BmNPV)、 黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒 (OpMNPV)、 舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒( Ld MNPV)、 甜菜夜蛾多核衣壳 核多角体病毒( Se MNPV)、 棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)以及斜纹夜蛾核 型多角体病毒( SplM t NPV) 杆状病毒在其生活史中共有两种形式的表型存在,在感染的初期( 0~ 24h), 主 要以细胞释放型病毒粒子( cell-released virus , CRV)为主, 也称为胞外型病毒 ( extracel lular vir us , ECV)或出芽型病毒 ( Budded vir us , BV); 在感染的晚 期主要以包埋型病毒( occlude d vir us , OV)的形式存在。杆状病毒的这两种 表型的形态、 蛋白组成、 病毒囊膜的来源、 感染组织特异性以及病毒入侵 宿主细胞的方式都不相同。 由于两种表型的病毒在结构组成上的差异, 所以杆状病毒在不同的时期需要表 达不同类型的蛋白来满足病毒颗粒不同形式的组装。昆虫杆状病毒的基因表 达共分为 4个时期: 极早期、 早期、 晚期、 迟晚期。4个时期的基因一环扣 一环,按时间先后, 以级联方式严格制约。早期表达的基因有 ie- 1、 me53、 pe38、 ie- 2等, 晚期表达的基因有 vp39 、vp80、 polh、 p10等, 这些不同的 基因所表达的蛋白各自具有不同的功能, 有些表达产物具有调控的功能, 而有 些仅仅只具有结构蛋白的作用。 在杆状病毒所表达的一系列蛋白中,有一类蛋白具有较高的表达量,并且均为病 毒基因组复制所非必需, 其中最具代表性的有多角体蛋白与 P10蛋白, 均属于 晚期表达的蛋白,受晚期启动子的调控。昆虫的杆状病毒表达系统正是利用了 这类蛋白的优点, 从而提供了外源 DNA插入座位。
昆虫杆状病毒表达系统研究进展
昆虫杆状病毒表达系统研究进展昆虫杆状病毒表达系统研究进展摘要：昆虫杆状病毒表达载体系统具有安全性好、重组蛋白表达量高、能同时表达多个基因、重组蛋白翻译后加工完整等特点，因而得到了广泛的应用。
随着重组杆状病毒构建技术的不断发展，昆虫杆状病毒表达载体系统的操作在逐渐简化，重组杆状病毒获得的效率也在不断提高。
昆虫细胞培养技术的改进和转基因昆虫细胞系的发展，进一步推动了昆虫杆状病毒表达载体系统在商品化药物、治疗性抗体、生物农药研发和基因治疗中的应用。
尽管仍存在着重组蛋白降解的问题，但随着分子生物学技术的发展，对杆状病毒载体的研究与改造也会更加深入，未来昆虫杆状病毒表达载体系统的应用将更为广泛。
关键词：杆状病毒；多角体启动子；转基因昆虫细胞系；疫苗；治疗性抗体。
前言作为当今基因工程四大表达系统之一，昆虫细胞杆状病毒表达载体系统(Insect cell baculovirus ex． pression vector system，IC-BEVS)的应用变得越来越广泛。
它不仅具有真核表达系统所具有的传统优势，同时兼具原核表达系统重组蛋白表达量高的特点，且能同时在一个载体上表达多种蛋白。
由于昆虫细胞易于悬浮培养，细胞培养基的改进也使得悬浮培养的细胞活率不断提高，最终得以实现昆虫细胞的大规模培养，这使得其在商业领域如生物医药、农业、疫苗研发等方面均获得了广泛的应用[1]。
1 杆状病毒的分类与分子生物学杆状病毒属于杆状病毒科(Baculoviridae)，分为核多角体病毒属和颗粒体病毒属，病毒粒子呈杆状，是一类专一性感染节肢动物并具有囊膜的DNA病毒。
基因组DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 kb之间。
杆状病毒基因组可在昆虫细胞核复制和转录，DNA复制后组装在杆状病毒的核衣壳内，因其具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入而成为表达大片段DNA的理想载体。
其中，目前用作外源基因表达载体的杆状病毒主要为核型多角体病毒(Nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
杆状病毒表达系统00000001
昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白●杆状病毒表达系统介绍●杆状病毒蛋白表达系统的优势●杆状病毒表达载体系统（BEVS）●杆状病毒表达宿主细胞●表达优化条件●翻译后修饰对蛋白表达的影响●高通量表达●总结杆状病毒介绍1.杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒。
2.杆状病毒在其生命周期中有两种不同的形态：一种为出芽型病毒（budded virus, BV），另一种为包含体病毒（Occlusion‐derived virus, OV）。
3. BV由糖蛋白GP64包裹的单一囊膜蛋白和膜蛋白构成。
4. OV由蛋白结晶基体包裹的多囊膜病毒粒子。
5. 研究最多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclearpolyhedro‐sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
6. AcMNPV只侵染鳞翅类幼虫。
杆状病毒生命周期●早期（0‐6h PI）•核衣壳迁移到细胞核•病毒DNA释放•开始早期基因表达●晚期（6‐24h PI）•更多DNA复制•新产生的核衣壳离开细胞核，随后在离开细胞质•的过程中得到囊膜蛋白•产生新的出芽病毒●极晚期Courtesy: Dr. Linda Lua, The University of Queensland, Australia •出芽病毒减少•核衣壳在细胞核内得到囊膜蛋白形成MNPVs•MNPVs以多晶体形式出芽，主要是多角体蛋白，形成包含体病毒。
多角体启动子是杆状病毒表达载体系统的主要元件。
优点缺点大肠杆菌成本低、表达量高。
缺乏蛋白质翻译后加工机制；目的蛋白不可溶，蛋白生物活性低。
酵母表达量高，可以翻译后加工，易实现高密度发酵。
蛋白质量不理想。
哺乳动物细胞重组蛋白生物活性高。
成本高；表达水平低，技术和环境要求高。
昆虫细胞重组蛋白生物学活性高；表达水平高；能同时表达多个基因。
重组蛋白糖基化程度低。
江苏省盐城市三校(盐城一中、亭湖高中、大丰中学)2022-2023学年高二下学期期中联考生物试题
2022-2023学年度高二年级第二学期期中联考生物试题一、单项选择题：本部分包括14题，每题只有一个选项最符合题意。
1．下图为细胞与内环境进行物质交换的示意图，图中的箭头“→”表示血液流动的方向。
下列相关叙述正确的是（）A．若③为肝细胞，则其所处内环境中的水可来自③③B．若③为脑细胞，则③处的氧气浓度低于③处，而CO2的浓度则相反C．若③为胰岛B细胞，则饭后半小时③处的胰岛素浓度高于③处D．若③为心肌细胞，则饭后半小时③处的血糖浓度低于③处2．神经中枢产生抑制的机制可分为三种模式，如下图所示，下列叙述错误的是（）A．模式③体现了神经调节中存在负反馈调节机制B．模式③中，③兴奋，使其末梢释放神经递质进入突触间隙，导致③兴奋，③抑制C．模式③中，若③兴奋会导致③兴奋，但③兴奋后③却不兴奋，其机理是③释放抑制性神经递质会抑制③释放递质D．在缩手反射中，肱二头肌因兴奋而收缩的同时，肱三头肌则受到抑制而舒张，该神经调节属于模式③3．如图为人体内水平衡的调节过程，甲、乙、丙代表激素或结构，下列有关叙述正确的是（）A．甲表示在下丘脑分泌的相关促激素释放激素作用下垂体释放的抗利尿激素B．乙表示肾小管和集合管，其细胞内也存在甲状腺激素的受体C．丙表示大脑皮层，若其上S区受损，患者听不懂别人的谈话D．图中所示的水平衡调节过程不存在反馈调节4．肿瘤细胞膜上的PD-L1蛋白能与T细胞的受体PD-1（程序死亡蛋白-1）结合，抑制T细胞产生免疫活性物质干扰素（一种细胞因子，能抑制肿瘤细胞的增殖），其作用过程如图所示。
下列叙述错误的是（）A．PD-L1抗体和PD-1抗体具有肿瘤免疫治疗作用B．PD-L1蛋白可使肿瘤细胞逃脱T细胞的细胞免疫C．PD-L1与PD-1的结合增强T细胞的肿瘤杀伤功能D．若敲除肿瘤细胞PD-L1基因，可降低该细胞的免疫逃逸5．自然界中，植物开花与光照有关。
在24h昼夜周期中，日照长度长于一定时数才能开花的植物称为长日照植物，日照长度短于一定时数才能开花的植物称为短日照植物。
杆状病毒表达系统——有效的VLP构建工具
杆状病毒表达系统——有效的VLP构建工具刘拂晓1,2 柳增善2 王志亮1【摘要】杆状病毒表达系统是以杆状病毒为外源基因载体，昆虫细胞或活体昆虫为受体的真核表达系统。
相对于其他表达系统，杆状病毒表达系统具有特殊的优势：杆状病毒基因组作为表达载体可以容纳更多外源基因；杆状病毒极晚期启动子能有效调控外源蛋白的表达；昆虫细胞作为受体能够对外源蛋白进行加工修饰；杆状病毒通常只感染节肢动物，不会对人畜构成危害。
因此，该系统越来越受到人们的重视，并已应用于亚单位疫苗的研发与生产，特别其对于构建病毒样颗粒，即由一种或多种病毒结构蛋白自行装配而成且不含病毒基因组的蛋白颗粒，具有不可比拟的优势。
对此做详细评述并展望病毒样颗粒疫苗的发展趋势。
【期刊名称】生物技术通报【年(卷),期】2012(000)006【总页数】7【关键词】杆状病毒昆虫细胞病毒样颗粒杆状病毒表达系统疫苗1983年，Smith等［2］成功实践了美国学者Miller的提出的杆状病毒作为载体在昆虫细胞中表达外源基因的可行性理论：他们将干扰素基因插入至苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californi-ca nuclear polyhedrosis virus，AcNPV）表达载体，然后将其转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda，Sf）细胞，成功表达了具有生物活性的人β干扰素。
此后，杆状病毒蛋白表达技术逐步建立并完善起来。
相对于传统大肠杆菌、酵母及哺乳动物细胞蛋白表达技术，杆状病毒技术在病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）的构建及应用方面具有不可比拟的优势。
VLP是含有一个或多个病毒结构蛋白的空心颗粒，高度模仿真实病毒的衣壳空间构象而不含其基因组。
大多数VLP 是良好的免疫原，既可诱导体液免疫又可诱导细胞免疫［3-5］。
随着杆状病毒蛋白表达技术的成熟，利用其构建VLP的报道也屡见不鲜。
1 杆状病毒分子生物学根据国际病毒分类委员会最新病毒分类报告，杆状病毒科（Baculoviridae）分为4个属，即α杆状病毒属（Alphabaculovirus）、β杆状病毒属（Betabaculovirus）、δ杆状病毒属（Deltabaculovirus）、γ杆状病毒属（Gammabaculovirus）。
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姓名：宋志瑞 专业：生物工程 学号： 2015304120207
NO.1
BEVS 简介
BEVS简介
昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVS)是基于昆虫杆状病 毒及其宿主细胞建立起来的表达体系；是继大肠杆菌， 酵母，哺乳动物细胞表达系统建立起来的，始于上世纪 80年代。
NO.2
BEVS 优点
2
Bac-to-Bac
3
BaculoDirect源自BacPAKBac-to-Bac
BaculoDirect
三大体系的区别
NO.5
BEVS常用宿主
常用宿主
Thanks
√
√ √ Sometimes Sometimes
Glycosylation
Acylation
√
√
表达高
加工 修饰
安全
B E VS
高效
容量大
NO.3
BEVS 原件
BEVS原件
1. 转移载体 2. 杆状病毒（AcNPV) 3. 宿主（培养细胞或虫体）
NO.4
BEVS三大系统
BEVS三大系统
1
BacPAK
BEVS优点
Features Simple to use Protein size Multiple gene expression Signal peptide cleavage BEVS √ unlimited √ √ Bacterial √ <100kD
Intron splicing
Functional protein Phosphorylation